СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимическим методам исследования, а именно к способам определения антиокислительной активности (АОА) антиоксидантных препаратов (АП).

Перекисное окисление (ПО) является нормальной составной частью окислительных процессов, постоянно протекающих в организме. Чрезмерная активация ПО оказывает отчетливое повреждающее действие на уровне субклеточных образований. Интегрально, это действие среди прочего негативно сказывается на физической работоспособности организма.

Поддержание высокой работоспособности может быть обеспечено соответствующими экзогенными антиоксидантными средствами. Современная фармакология предоставляет широкий спектр подобных средств, способных обеспечить коррекцию и нормализацию ПО.

Заявляемый способ количественной оценки антиокислительной способности антиоксидантов может быть использован для выявления механизма их действия и для научно обоснованного выбора этих препаратов с целью последующего практического применения.

Изобретение представляет интерес для спортивной биохимии, т.к. практически любая спортивная деятельность сопровождается активацией ПО, что в силу упомянутого повреждающего воздействия негативно сказывается на физических возможностях организма и на его спортивных показателях. Таким образом, количественная оценка АОА применяемых препаратов является важной задачей биохимии спорта. При этом представляется очевидным, что область применения предлагаемого способа гораздо шире рамок спортивной биохимии. Возможность количественной оценки АОА различных препаратов важна для клинической биохимии, фармакологии и различных областей медицины.

Эту оценку удобно осуществлять на основании определения перекисной резистентности эритроцитарных мембран без и в присутствии исследуемого АП [1].

Из описанных в литературе способов определения АОА наиболее близким к предлагаемому оказывается [2], взятый в качестве ближайшего аналога.

Способ основан на следующем. Любой биологический материал рассматривается не только как субстрат перекисного окисления, но и как потенциальный источник про- и антиокислительных факторов. В зависимости от их соотношения данный материал будет проявлять про- или антиоксидантные свойства. Следовательно, при инициировании перекисных процессов концентрация продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в пересчете на единицу исследуемого материала будет зависеть от количества этого материала в объеме инкубационной среды при активации ПОЛ.

В способе [2] для характеристики АОА используется отношение концентрации малонового альдегида (МДА) при активации ПОЛ для двух разных разведений исследуемого субстрата. АОА выражается коэффициентом K:
K=E₁v₁/E₂v₂,
где E₁, v₁ - оптическая плотность и объем биологического материала в 1-й пробе; E₂, v₂ - во 2-й пробе. В частности, для сыворотки крови животных и человека K рассчитывают по соотношению МДА, образовавшегося в системе при использовании 0,1 и 0,2 мл этой сыворотки. В таком случае расчетная формула принимает вид
K=2E₁/E₂
Способ [2] надежен, прост в исполнении, при этом он позволяет объективно оценивать АОА различных биологических объектов.

Недостатком способа, взятого в качестве ближайшего аналога, является следующее. Способ предназначен исключительно для оценки антиокислительной активности биологического материала. Его методическая основа - сопоставление концентраций одного из продуктов ПОЛ при разном содержании биологического материала в системе - позволяет выявить антиокислительные свойства биологического субстрата. Следовательно, по своей концентрации этот способ не предусматривает участие или присутствие экзогенного антиокислителя и не может быть использован для решения поставленной задачи: дать количественную объективную оценку АОА экзогенных антиоксидантных препаратов.

Указанная выше задача достигается тем, что в предлагаемом способе определения антиокислительной активности антиоксидантнах препаратов, заключающемся в определении перекисной резистентности незащищенных эритроцитов при инициировании перекисного окисления перекисью водорода, производят определение перекисной резистентности эритроцитов, защищенных исследуемым антиоксидантом и по соотношению
K=A'/A'',
где A' - степень гемолиза незащищенных эритроцитов; A''- степень гемолиза эритроцитов, защищенных исследуемым препаратом, судят об антиокислительной активности этого препарата, сравнивая показатель K для исследуемого препарата с соответствующей величиной для глутатиона, причем K глутатиона определяется таким же образом.

Прежде чем перейти к подробному рассмотрению способа следует кратко описать его сущность и остановиться на его некоторых практических характеристиках.

1. Используя суспензию эритроцитов, полученную из донорской крови, и инициируя ПОЛ перекисью водорода, в точном соответствии с [1], определяли перекисную резистентность эритроцитов. Параллельно тот же показатель определяли в присутствии антиоксидантного препарата, повышающего резистентность мембран и, следовательно, снижающего степень гемолиза эритроцитов.

2. Степень перекисного гемолиза А (%) рассчитывали по следующей формуле
А=(а-в)/(б-в),
где а - экстинкция пробы; б - экстинкция той же пробы после полного гемолиза; в - экстинкция, соответствующая спонтанному гемолизу, т.е. без H₂O₂ и без защищающего препарата. Причем в соответствии с [1] все три параметра каждой пробы ("а", "б", "в") определяли непосредственно в спектрофотометрической кювете. Степень перекисного гемолиза незащищенных антиоксидантным препаратом эритроцитов обозначает A', в присутствии антиоксиданта - A''.

3. В качестве эталона был выбран препарат глутатион, природный антиоксидант, действующий в организме. Определяли антиоксидантный эффект глутатиона, взятого в физиологической концентрации.

4. Антиоксидантное действие исследуемых препаратов оценивали для нескольких концентраций. Самое высокое содержание препарата соответствовало рекомендуемой норме его потребления.

5. Определяли экстинкцию E для λ = 541нм. Измерения проводили на спектрофотометре СФ-46, обеспечивающем точность показаний до третьего знака после запятой.

Далее приводится пример выполнения предлагаемого способа.

1. Приготовление суспензии эритроцитов
Суспензию эритроцитов получали, добавляя к 0,2 мл гепаринизированной крови 2 - 3 мл буферно-физиологического раствора (БФР), приготовленного из равных объемов 0,06 М фосфатного буфера и физиологического раствора (pH смеси - 7,4). Перемешивали, центрифугировали (3000 об/мин, 5'). После отделения надосадочной жидкости операцию повторяли. Суспензию эритроцитов получали, добавляя к отмытым эритроцитам БФР до 1 мл.

2. Приготовление раствора H₂O₂
В соответствии с [1] перекисные процессы инициировали H₂O₂. 2,2% раствора H₂O₂ готовили extempore. Концентрацию раствора контролировали спектрофотометрически.

3. Приготовление растворов исследуемых антиоксидантов
Растворы антиоксидантных препаратов готовили на БФР.

В каждом случае рассматривали определенный концентрационный спектр, причем наиболее концентрированный раствор соответствовал условиям 100% поступления дозы препарата в кровь. Остальные растворы получали 2-кратным разведением. Растворы исследованных препаратов "Вента", "Валдай", "Рукитис" фильтровали. Концентрация раствора глутатиона соответствовала физиологической норме (2,5 мкмоль/л [3]). Перед приготовлением глутатион нейтрализовали бикарбонатом натрия.

4. Последующие операции
4.1. В спектрофотометрическую кювету объемом 1 мл с толщиной поглощающего слоя 1 см вносили 0,7 мл БФР и добавляли 0,1 мл суспензии эритроцитов. Далее в точном соответствии с [1] определяли "в".

4.2. Затем в кювету добавляли 0,1 мл соответствующего антиоксиданта (для определения A* вместо антиоксиданта добавляли 0,1 мл БФР). После 30' инкубации при той же температуре (37^oC) в каждую кювету добавляли 0,1 мл раствора H₂O₂, перемешивали и в соответствии с [4] инкубировали 15' при 37^oC и 1,5 часа при 20^oC. Далее центрифугировали (3000 об/мин, 5') и определяли "а", фотометрируя надосадочную жидкость.

4.3. В кюветы вносили стеклянную палочку, смоченную 4%-ным раствором сапонина, содержимое кюветы перемешивали. После 10'-минутной экспозиции смесь центрифугировали (3000 об/мин, 5') и определяли "б", фотометрируя надосадочную жидкость.

5. После этого по вышеприведенной формуле рассчитывали A'', A' и K = A'/A''.

В качестве примера в таблице 1 приведены результаты, отражающие влияние глутатиона и биологически активного препарата "Валдай" на перекисную резистентность эритроцитарных мембран. Величина A' отмечена значком *.

В предпоследнем столбце таблицы приводятся средние значения А для концентрации АП, указанной во втором столбце, и средние значения A*, описывающие перекисную резистентность незащищенных эритроцитов (концентрация АП равна нулю). Наконец, в последней графе дано соотношение K = A'/A'', отражающее эффективность АП и, следовательно, уже само по себе могущее служить характеристикой АОА антиоксидантных препаратов. Но при этом сравнение АОА различных АП представляется затруднительным. Приняв за единицу (100%) "K" глутатиона, получаем возможность сопоставлять АОА различных АП.

Для 7-ми препаратов (включая и те, что фигурируют в таблице 1) были получены значения "а", "б" и "в". По ним рассчитаны A и далее - K. Подученные величины, сопоставленные с K глутатиона, позволяют соотносить их АОА. Эти данные приведены в таблице 2.

В таблице представлены данные об антиокислительной активности семи различных антиоксидантов. Трипептид глутатион, как уже отмечалось, представляет собой природный антиокислитель, присутствующий в крови. "Вента", "Валдай" и "Рукитис" являются препаратами сложного состава на базе растительных экстрактов. "Унипан БЖ-13" и "Биоженьшень - препараты культуры клеток женьшеня". Тимол - индивидуальное химическое вещество, имеющее статус лекарственного препарата. Предлагаемый способ во всех случаях выявил АОА и позволил количественно выразить и сопоставить эффективность столь различных АП. Все исследованные препараты проявили активность, сопоставимую с действием глутатиона.

Очевидно, что конечный результат зависит от выбора параметров эксперимента, в частности, - от времени инкубации суспензии и антиоксидантных препаратов перед добавлением раствора H₂O₂ (в описываемых опытах - 30'). Сопоставление результатов имеет смысл лишь в случае строгой стандартизации условий проведения опытов.

Литература
1. Михайлов С.С., Романчук Л.А., Фактор Э.А. Способ определения перекисной резистентности эритроцитов. Заявка N 97105596/14 (005946). Приоритет от 09.04.97. Положительное решение от 08.12.98.

2. Мартынюк В.Б., Ковальчук С.Н., Тымочко М.Ф., Панасюк Е.Н. Индекс антиокислительной активности биологического материала // Лаб. дело., 1991. - N 3. - С. 19 - 22.

3. Тиц Н. И. Клиническая оценка лабораторных тестов. - М.: Медицина, 1986. - 479 с.

4. Покровский А.А., Абраров А.А. К вопросу о перикисной резистентности эритроцитов // Вопросы питания. - 1964. - N 6. - С. 44 - 46.

Способ может быть использован в медицине, а именно в биохимических методах исследования антиокислительной активности (АОА) антиоксидантных препаратов. Определяют перекисную резистентность незащищенных эритроцитов при инициировании перекисного окисления перекисью водорода, производят определение перекисной резистентности эритроцитов, защищенных исследуемым антиоксидантом, и по соотношению К=А'/А'', где А' - степень гемолиза незащищенных эритроцитов; А'' - степень гемолиза эритроцитов, защищенных исследуемым препаратом, судят об АОА этого препарата, сравнивая его АОА с АОА глутатиона, определенной таким же способом. Предлагаемый способ позволяет дать количественную оценку АОА антиоксидантных препаратов. 2 табл.

Способ определения антиокислительной активности антиоксидантных препаратов, заключающийся в определении перекисной резистентности незащищенных эритроцитов при инициировании перекисного окисления Н₂О₂, отличающийся тем, что далее производят определение перекисной резистентности эритроцитов, защищенных соответствующим исследуемым препаратом, и по величине соотношения этих показателей К= А'/A'', где A' и A'' - степень гемолиза незащищенных и защищенных эритроцитов соответственно, судят об антиокислительной активности исследуемого препарата, сравнивая его антиокислительную активность с антиокислительной активностью глутатиона, определенной таким же способом.