ОРГАНИЧЕСКИЕ СОЛИ N,N'-ДИАЦЕТИЛЦИСТИНА, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ Российский патент 1999 года по МПК C07C323/59 A61K31/195 A61K31/22 

Изобретение относится к органическим солям N,N'-диацетилцистина, именуемым далее как DiNAc, имеющим иммуномодулирующую активность, равно как фармацевтические средства, основанные на этих солях, а также к способам их фармацевтического применения. Особый акцент в изобретении сделан на методах получения кристаллических, негигроскопичных химически стабильных солей, содержащих нетоксичные органические катионы, которые хорошо зарекомендовали себя при лечении заболеваний, сопровождающихся нарушениями иммунной системы.

N-ацетил-L-цистеин представляет собой хорошо известное соединение, которое традиционно используется как терапевтическое средство при хронических обструктивных заболеваниях и хронических бронхитах. Хотя первый патент был зарегистрирован в 1964 г. (GB 954268) механизм действия этого соединения до сих пор не изучен. Лишь недавно было установлено, что соответствующий дисульфид N-ацетил-L-цистеина, т.е. DiNAc действует как мощный иммуностимулятор (шведская заявка на патент по SE 9002067-8), проявляя активность, сравнимую с активностью таких иммуностимуляторов, как диэтилдитиокарбамат натрия или 2,2'-дитиобисэтанол.

Методики получения DiNAc описываются в нескольких патентах (патент США NN 4827016, 4724239 и 4708965, Европейский патент N 300100 и Германский патент N 2326444). Однако DiNAc, будучи гигроскопичным и аморфным, представляет трудности при выделении его и составлении на его основе лекарственного средства, так что прием его обычно производится только в виде водных растворов. Большинство солей DiNAc с неорганическими или органическими катионами имеют те же неудобные физические свойства, что и свободная двухосновная кислота. В патентной литературе появились сведения о солях других серусодержащих аминокислот (патент США N 3647834, Японский патент N 56155298 и Французский патент N 8106592).

К своему удивлению мы обнаружили, что несколько солей DiNAc с органическими основаниями обладают удачным сочетанием кристаллических свойств и негигроскопичностью, что позволяет осуществлять как их выделение, так и приготовление на их основе лекарственных препаратов в твердой форме и использовать твердые формы для ингаляции или в виде других сухих препаратов, какие только могут понадобиться для клинического применения.

Настоящее изобретение относится к органическим солям DiNAc, имеющим форму Ia или Ib


где R⁺ и R²⁺ обозначают соответственно моно- и дипротонированные органические амины.

Органические амины получают из лизиния, этилендиаминия, N,N'-дибензилэтилендиаминия, N-бензил-2-фенилэтиламиния, пиперазиния и 1-адамантанаминия.

Лизин может быть в D- или L-форме. Более предпочтительная L-форма.

Изобретение включает гидратированные и сольватированные соли, т.е. сольватированные низкими алканолами. Изобретение включает соли DiNAc в виде индивидуальных изомеров, т.е. D-, L- и мезоформы, а также рацемическую смесь. Наиболее предпочтительными являются L-формы этих солей.

Мы обнаружили, что новые соли, описанные в изобретении, отвечают необходимым требованиям: они легко кристаллизуются, негигроскопичны и химически стабильны, сохраняя иммуномодулирующую активность DiNAc, и в связи с этим представляются весьма полезными в медицинском плане.

Изобретение, таким образом, относится к соединениям с благоприятными свойствами для лечения заболеваний, в отношении которых можно предположить наличие энергии иммунного ответа, аберрантный иммунный ответ или недостаточность иммунной защиты организма. Такие заболевания включают, например, хронический бронхит, при котором, как было показано ранее, происходит снижение интенсивности заболевания в фазе обострения в случае применения таких модификаторов иммунного ответа, как Биостим (Rademecker, M. et al Int. J. Immunopharmac 10, 913-917, 1988, Scheffer, J. et al Arzneim. Ferxch (Drug Res. 41, 815820, 1991), Рибомунил и Бронхо-Ваксом (Paupe, J. Respiration 58, 150-154, 1991), равно как и при использовании N-ацетилцистеина (См. Bergstrand, H. et al J. Free Radic. Biol Med 2, 119-127, 1986).

Такие заболевания включают также определенные формы злокачественных заболеваний. Так, многочисленные исследовательские институты во всем мире занимаются поиском путей стимулирования иммунного ответа у пациентов с различными формами злокачественных заболеваний, и в литературе появляется большое число обзоров, освещающих различные подходы к этому вопросу (Stevenson, F.K.FASEB J. 5:2250-2257, 1991). В качестве примеров можно назвать пациентов с внутричерепными опухолями (глиомами), у которых резко снижен иммунитет, возможно, как результат нарушения у таких пациентов процесса секреции IL-2 или экспрессии IL-2 рецепторов T-клеток (Koszman, T. et al Immunology Today 12, 370, 374, 1991). В этой связи характерно, что иммуностимулятор Левамизол проявляет выраженный адъювантный эффект при иммунотерапии меланомы и рака толстой кишки (Van Wauwe, J. and Janssen, P.A.J. Int J. Immunopharmac 13, 3-9, 1991), а при иммунотерапии с помощью IL-2 in vivo или при обработке лимфокин-активированных киллерных клеток пациентов ex vivo происходит замедление развития рака у некоторых пациентов (Rosenberg, S.A. Immunology Today 9, 580, 1988). Злокачественные заболевания, при которых в случае использования соединений 1 можно ожидать положительный эффект, включают опухоли мезенхимного происхождения, в частности саркомы, такие, как фибросаркома, микросаркома, липосаркома, хондросаркома, остеосаркома, или хордосаркома, такие саркомы, как ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, синовиосаркома, или мезотелиосаркома, а также лейкемии и лимфомы, в частности гранулоцитарная лейкемия, моноцитарная лейкемия, лимфоцитарная лейкемия, злокачественная лимфома, плазмоцитома, ретикулосаркома, или болезнь Ходжкина, саркомы, такие, как лейкомиосаркома, или рабдомиосаркома, опухоли эпитолиального происхождения (карциномы), такие, как плоскоклеточный рак, базалиома, рак потовых желез, рак сальных желез, аденокарцинома, папиллярный рак, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярный рак, недифференцированный рак, бронхогенный рак, меланома, рак почки, печоночно-клеточный рак, рак желчных протоков-холангиокарцинома, переходноклеточный рак, хориокарцинома, семонома, или эмбриональный рак, опухоли центральной нервной системы, в частности, глиома, менингома, медуллобластома, шваннома, или эпендиома.

Более того, данные соединения имеют полезные свойства, пригодные для лечения хронических инфекций, таких, как герпес, афтозный стоматит и синдром минимального изменения (minimal change Syndrome), в отношении которых ранее сообщалось о клиническом улучшении при использовании таких иммуностимуляторов, как Левамизол, к таким болезням относятся также воспаление мочевых путей, уха, горла или носа, на которые благоприятно действует лечение такими иммуностимуляторами, как Биостим, Бронхо-Ваксом и Рибомулин, к ним также относятся ВИЧ-инфекции, или СПИД.

Кроме того, нарушения, связанные с дефектом или дисбалансом иммунного ответа, также имеют место при атопических заболеваниях, такие, как атопический дерматит, ринит и астма (Katz D.H.Transplantation Rewiews 41, 77-108, 1977). Поскольку теоретически стимуляция иммунного ответа могла бы быть лучшим способом восстановления дисбаланса и аутоиммунной реакции (Varela, F.J. and Coutinho, A. Immunology 12, 159-166, 1991), следует предположить, что данные соединения обладают нужными свойствами для лечения астмы, ринита, атопического дерматита и аутоиммунных заболеваний, таких, как диабет "не тучных", системная красная волчанка, склеродермия, ксеродерматоз, дерматомиозит, или множественный склероз, ревматоидный артрит и, возможно, псориаз.

Более того, можно предположить, что данные соединения в связи с их иммуностимулирующими свойствами полезны для использования их в качестве адъювантов при изготовлении различных вакцинных препаратов.

И, наконец, можно ожидать, что соединения обладают полезными свойствами для лечения атеросклероза, независимо от связи его с предполагаемым воспалительным процессом (Hansson, G.K. et al. Proc. Nat. Acad. SCi USA 98, 10530, 1991).

Результаты, свидетельствующие о важном значении иммуностимулирующих средств в отношении опухолей, иллюстрируют наши тестовые системы, содержащие опухоли. Описанные ниже экспериментальные модели с опухолью крыс очень хорошо демонстрируют опухолестатическую способность соединений, описанных в изобретении, в сравнении с хорошо известным иммуностимулятором Левамизолом, клинически эти модели соответствуют быстро растущей опухоли - раку молочной железы и медленно прогрессирующей опухоли - глиоме, и в обоих системах препарат продемонстрировал превосходный эффект на опухоли.

Наиболее подходящими для лечения соединениями, приведенными в изобретении, являются злокачественные процессы, такие, как меланома, рак молочной железы, рак желудочно-кишечного тракта, глиома, рак мочевого пузыря и плоскоклеточный рак области шеи и головы.

Инфекции, такие, как хронический бронхит, гепатит, послеинфекционная анергия и приобретенные иммунодефицитные состояния, каким является СПИД; посттравматическая иммунная анергия и отмеченные выше аутоиммунные заболевания, такие, как ревматоидный артрит, множественный склероз и псориаз.

Эффективные дозы для лечения описанных выше заболеваний находятся в пределах 0,1-100 мг, предпочтительно 1,0-60 мг в день.

Способы получения.

Органические соли формулы Ia и Ib обычно приготавливают смешиванием DiNAc и органического основания из описанных выше, при этом каждый растворяется или диспергируется в растворителе или смеси растворителей. Могут быть использованы такие растворители, как вода, спирты, гликоли, кетоны, амиды, сульфоксиды или другие полярные растворители или смеси растворителей. Соль осаждается или непосредственно из реакционной смеси, или получается после добавления менее полярного растворителя, или выпариванием, или лиофилизацией. Реакция проводится при повышенной температуре или при комнатной температуре в зависимости от растворимости среды. Соль может быть приготовлена иным способом за счет окисления соответствующей соли N-ацетилцистеина в водном или спиртовом растворе, вследствие чего происходит осадкообразование, как и в случае, приведенном выше. Окисление можно осуществлять либо химическим путем с помощью перекиси водорода или галогена, либо электрохимическим способом.

Фармацевтические композиции
В соответствии с настоящим изобретением соединения формулы Ia и Ib приготавливают для применения посредством ингаляции, а также другими способами, т. е. перорально, для местного применения, с использованием или без использования подходящего фармацевтического носителя.

Вещество можно вдыхать из дозированного ингалятора, находящегося под давлением, из сухого порошкового ингалятора, например Турбохалера, или из сухого порошкового ингалятора, использующего желатиновые, пластиковые или другие капсулы. Нетоксичные и инертные химические вещества, такие, как лактоза, трегалоза, маннитол или глюкоза могут добавляться к порошковым веществам.

Вещество также может применяться перорально в виде капсул или таблеток, при этом капсулы, таблетки или само по себе активное вещество могут быть покрыты или не покрыты оболочкой. Оболочка может состоять например, из оксипропилцеллюлозы и аэросила в изопропаноле или других подходящих растворителях. Нетоксичное и инертное вещество может быть добавлено к порошковому веществу с целью получения желательных физических и фармацевтических свойств.

Возможно также парентеральное введение новых соединений.

Фармакология.

Способность соединения ди-L-лизиний-N, N'-диацетил-L-цистината модулировать иммунный ответ иллюстрируется его эффективность в тесте с гипертонией замедленного типа (ГЗТ) на мышах.

Самцы и самки мышей линии BaIb/c, полученные из Бомгольтсгарда (Дания), использовались для эксперимента с весом 18-20 грамм. 4-этоксиметилен-2-фенилоксазолин-5-один (ОХА) был получен от BDH (Англия) и использовался в данном тесте в качестве антигена.

Мыши были сенсибилизированы, день 0, путем поверхностно-кожного введения 150 μл раствора абсолютного этанола - ацетона (3:1), содержащего 3% ОХА, на выбритый живот. Обработка дисульфидной солью или наполнителем (0,9% NaCl) проводилась вслед за началом кормления сразу же после сенсибилизации и продолжалась 1 раз в день вплоть до дня 6. На седьмой день после сенсибилизации (день 6) на обоих ушах мышей были сделаны местные введения в 20 μл 1% ОХА, растворенного в арахисовом масле. Толщина ушей у мышей измерялась до обработки, через 24 и через 48 часов после нее с использованием пружинного кронциркуля Одитест. Пробы на ушах и измерения их толщины проводились при легкой анестезии пентобарбиталом.

Интенсивность ГЭТ реакции выражалась в соответствии с формулой: T_24/48-T_t0 μл единиц, где t0, t24 t48 означают толщину уха перед пробой, через 24 и 48 часов соответственно в индивидуальных тестах (Т). Результаты выражались как средне значение ± СКО. Уровень значимости между средними значениями групп был получен по критерию Стъюдента, основанному на двойной выборке.

Табл. 1 и табл. 2 представляют результаты измерений в репрезантивном эксперименте через 24 и 48 часов соответственно. Иммуностимулирующая способность отражается в значительном различии - увеличении - толщина уха в сравнении с контролем. Так, у обработанных животных через 24 часа ответ был в два раза выше, чем у контрольных животных (18 μл в сравнении с 8 μл табл. 1, 2 см. в конце описания).

Способность того же тестового соединения (Ia, R = лизин), пролонгирующего или увеличивающего выживаемость крыс, страдающих от опухолей, иллюстрируется двумя экспериментами с инокулированными в крыс опухолями.

Две группы животных, состоящая каждая из 10 крыс линии Вистар 5, инокулированы подкожно клетками рака молочной железы из расчета 10⁴ клеток на крысу, и дважды в неделю измеряли размер опухоли. В одной группе крысы пили обыкновенную воду, а в другой - тестовое соединение, растворенное в воде, так чтобы в результате выдерживалась доза 0,03 μмол/кг веса животного в день. Через 38 дней в группе животных, пивших воду, была жива только одна крыса, тогда как в группе животных, получавших исследуемое соединение, было 7 живых животных.

В другом эксперименте 3 группы животных, каждая состоящая из 10 крыс линии Льюис, были инокулированы подкожно клетками глиомы из расчета 10⁶ клеток на крысу, и дважды в неделю измеряли размер опухоли. В одной группе крысы пили обыкновенную воду, во второй - тестовое соединение, растворенное в воде, так чтобы выдерживалась доза 0,03 μмол/кг веса животного в день, тогда как в третьей группе крысы пили воду, содержащую Левамизол, хорошо известное средство, применяемое в терапии онкологических заболеваний, также растворенное в воде в дозе 0,03 μмол/кг веса животного в день. Через 119 дней в группе крыс, пьющих воду, не осталось ни одной живой крысы. В группе, которая получала тестовое соединение, было 6 живых крыс, тогда как в группе, которой давали Левамизол, через 119 дней осталось 3 живых крысы.

В обоих экспериментах с инокулированными опухолями в группах, получавших растворенное в воде тестовое соединение, наблюдалась более низкая частота опухолепозитивных животных, а также прослеживалось ингибирование развития мышиных опухолей.

В другом эксперименте мыши со SCiD (тяжелыми комбинированным иммунодефицитным заболеванием) были инокулированы 2•10³ клетками рака молочной железы, и дважды в неделю измерялся размер развивающейся опухоли. В одной группе мыши пили обыкновенную воду, во второй - тестовое соединение, растворенное в воде, так чтобы выдерживалась доза 0,03 μмол/кг веса животного в день. Не было замечено серьезных различий между группами в отношении скорости роста опухолей и частоты заболевания крыс. Это указывает на то, что соединение не имеет прямого воздействия на опухолевые клетки, но действует через иммунный аппарат. В модельных экспериментах с системной красной волчанкой мышей у мышей линии MRL-lpr/lpr происходило спонтанное развитие лимфоидной гиперплазии, дерматита, артрита и гломерулонефрита. Действие ди-L-лизиний-N,N'-диацетил-L-цистината на показатели гематурии и протеинурии при гломерулонефрита, а также на уровень выживания животных изучалось на той же модели системной красной волчанки мышей (СКВ). Ди-L-лизиний-N,N'-диацетил-цистинат добавлялся в воду со средней дозой 0,03 μмол/кг веса в день. Контрольные группы животных получали водопроводную воду. Обе группы имели свободный доступ к питьевой воде. Обработка начиналась с 8-недельного возраста и продолжалась вплоть до 46 недель, когда исследование прекращалось.

Оценка протеинурии и гематурии осуществлялась с помощью индикаторной полости, Эур-Тест, Берингер, Маннгейм.

При добавлении ди-L-лизиний-N,N'-диацетил-L-цистината уровень выживаемости крыс значительно увеличился по сравнению с контролем. Коэффициент смертности в группе необработанных животных (21 животное) достиг 50% к 25-недельному возрасту. Для мышей линии MRL - lpr/lpr, обработанных ди-L-лизиний-N, N'-диацетил-L-цистинатом, такой коэффициент смертности наблюдался только в 44 неделе.

Указанный вид обработки также значительно улучшал показатели в отношении протеинурии и гематурии, измеренные в произвольных единицах индикаторных полосок, в сравнении с необработанной группой.

Данные результаты демонстрируют иммуномодулирующую способность соединений, описанных в изобретении, особенно в отношении системной красной волчанки.

Рабочие примеры.

Фармацевтические композиции.

Следующие примеры представляют подходы к технологии приготовления лекарственных средств, нацеленных на различные способы их локального или системного приема.

Пример 1. Аэрозоль под давлением для ингаляции
Аэрозольная система устроена таким образом, что каждая отмеренная доза содержит 0,1-1,0 мг.

Соединение Ia или Ib, микронизированные - 1,0 вес.%
Сорбитан триолеат - 0,7 вес.%
Трихлормонофторметан - 24,4 вес.%
Дихлортетрафторэтан - 24,4 вес.%
Дихлордифторметан - 49,5 вес.%
Пример 2. Порошковый аэрозоль для ингаляции чистым веществом
Чистое вещество, приготовленное для ингаляции из Турбохалера. Каждая единичная доза содержит 0,1-1,0 мг.

Соединения Ia или Ib, очищенные.

Пример 3. Порошковый аэрозоль для ингаляции
Каждая доза содержит 0,1-1,0 мг в капсуле
Соединение I, микронизированное - 0,1-1,0 мг
Лактоза - 50 мг
Пример 4. Раствор для распыления
Раствор содержит 1,0-10,0 мг/мл и 1-3 мл может быть введено в качестве единичной дозы.

Соединение I - 1,0-10,0 мг
Вода для инъекции - До 10 мл
Пример 5. Таблетки
Каждая таблетка содержит:
Соединение I - 0,1 - 100 мг
Кукурузный крахмал - 50 мг
Лактоза - 150 мг
Поливидон - 7 мг
Микрокристаллическая целлюлоза - 20 мг
Стеарат магния - 2 мг
Пример 6. Раствор для перорального введения
Единичная доза в 10 мл содержит 10-100 мг.

Соединение I - 1-10 мг
Сорбитал 70% - 150 мг
Глицерол - 100 мг
Бензоат натрия - 1 мг
Корригент
Вода очищенная - До 1,0 мл
Пример 7. Таблетки с контролируемым выделением вещества
Соединение I - 1-100 мг
Специальный парафин - 145 мг
Порошковая лактоза - 50 мг
Коллоидный диоксид кремния - 5 мг
Этилцеллюлоза 10 cps - 13 мг
Этанол 99,5 об.% - 85 мг
Стеарат магния - 2,5 мг
Пример 8. Гранулы с контролируемым выделением вещества
1 г гранул:
Соединение I - 1-100 мг
Диспергированная этилцеллюлоза - 10 мг
Ацетилтрибутилцитрат - 0,5 мг
Эудрагит L 100-55 - 55 мг
Триэтилцитрат - 5 мг
Тальк - 30 мг
Свежая дистиллированная вода - 350 мг
Гранулы, нейтральные - До 1000 мг
Пример 9. Раствор для инъекций
1 мл единичной дозы содержит 1,0 - 10,0 мг
Соединение Ia или Ib - 1,0 - 10,0 мг
Хлорид натрия - 8,9 - 7,7 мг
Вода для инъекции - До 1,0 мл
Пример 10. Крем для местного применения
1 г крема содержит:
Соединение I - 0,1-1,0 мг
Белый мягкий парафин - 75 мг
Жидкий парафин - 10 мг
Цетостеариловый спирт - 75 мг
Цетомакрогол - 20 мг
Метагин - 0,8 мг
Пропагин - 0,2 мг
Вода, очищенная - До 1,0 г
Пример 11. Мазь для местного применения
1 г мази содержит:
Соединение I - 0,1-1,0 мг
Жидкий парафин - 150 мг
Белый мягкий парафин - До 1,0 г
Пример 12. Глазные капли
Одна доза двух капель содержит 0,01-0,1 мг соединения I
Соединение I - 0,1-1,0 мг
Хлорид бензалкония - 0,1 мг
Хлорид натрия - 9,0 мг
Вода, стерильная - До 1,0 мл
Химия.

Пример 13.

Ди-L-лизиний-N,N'-диацетил-L-цистинат (Ia, R=H₂N (COOH)CH(CH₂)₄NH₃):
N-ацетил-L-цистеин (22 мол, 3,59 кг) растворяется в 2,6 л деионизированной воды. Гидроокись натрия 45% в воде (22 мол, 1,92 кг) добавляется при перемешивании и температура поддерживается при температуре ниже 20^oC. Затем температура доводится до 5^oC, и осторожно по каплям в течение 90 мин. добавляется перекись водорода (11,0 мол, 0,95 л). В ходе этого процесса добавления температура не должна превышать 10^oC. К полученному раствору добавляется 9 л активированного высококислого катионообменника. После перемешивания pH принимает значение 2,0, а ионообменник удаляется фильтрованием. Фильтра содержит 9,65 мол N,N'-диацетил-L-цистина, что подтверждается ВЭЖХ с применением в качестве стандарта чистого вещества. К этому раствору, как сырьевой основе, добавляется L-лизин (19,3 мол, 3,17 кг). Образованный густой раствор медленно добавляется к перегнанному этанолу (50 л), содержащему 0,23 кг кристаллического ди-L-лизиний-N, N'-диацетил-L-цистинат. После добавления шлам охлаждается, а кристаллы отделяются фильтрованием. Затем проводится промывание этанолом (8 л), высушивание (вакуум 40^oC) в течение 12 часов, в результате чего получается 5,36 кг (90%) целевого продукта в виде белого кристаллического твердого вещества.

Физические данные: Т. пл. : 210^oC (разлож.): [α]25D

= -70^oC (c = 0,54, H₂O),
¹H-ЯМР (D₂O) δ : 1,36-1,60 [4H, m, Лиз γ CH₂], 1,73 [4H, p, Лиз δ CH₂], 1,84-1,96 [4, m, Лиз β CH₂], 2,05 [6H, c, CH₃], 2,95 [2H, дд., CH₂S], 3,02 [4H, т, Лиз ε CH₂], 3.25 [2H, дд, CH₂S], 3,76 [2H, т, Лиз α CH], 4,50 [2H, дд, CHN]
¹³C-ЯМР (D₂O) δ : 24,27, 24,80, 29,24, 32,72, 41,89, 42,78, 52,96, 57,30, 176,53, 177,41, 179,74.

Анализ: расчет в % для C₂₂H₄₄O₁₀N₆S₂: C 4,28, H - 7,2, N - 13,6. Найдено: C - 42,6, H - 7,4, N - 13,7, MS m/z = 325 (MH⁺), m/z = 471 (ML_ysH⁺), m/z = 617 (ML_ys2H⁺).

Пример 14.

Этилендиаминий-N,N'-диацетил-L-цистинат (Ib, R=H₃NCH₂CH₂NH₃):
К N,N'-диацетил-L-цистину, (30,9 ммол, 10 г) растворенному в 20 мл воды добавляются этилендиамин (61,8 ммол, 3,73 г) и этанол (30 мл). Раствор концентрируется до состояния густой пасты и затем перерастворяется в 80 мл этанола. Кристаллизация наступает после двух часов перемешивания при 10^oC. После фильтрования и высушивания получается 6,2 г (45%) целевого соединения.

Физические данные: Т.пл. 185,2 - 192,4^oC.

¹H-ЯМР (D₂O) σ : 2,06 [6H, c, CH₃], 2,96 [2H, дд, CH₂S], 3,26 [2H, дд, CH₂S], 3,28 [4H, c, H₃N⁺CH₂CH₂N⁺H₃], 4,50 [2H, дд, CHN].

¹³C-ЯМР (D₂O): σ 24,78, 39,99 42,74, 56,98, 176,55, 179,82.

Анализ: расчет в %: C - 37,5, H - 6,3, N - 14,6, S - 16,7.

Найдено: C - 37,3, H - 6,8, N - 15,3, S - 15,2 MS m/z = 385 [M(H₂NCH₂CH₂NH₂)H⁺]
Пример 15.

N,N'-дибензилэтилендиаминий-N,N-диацетил-L-цистинат (Ib, R = PhCH₂NH₂CH₂CH₂NH₂CH₂Ph)
К 63% раствору N, N'-диацетил-L-цистеина в воде (67 ммол, 21,8 г) добавляется N, N-дибензилэтилендиамин (67 ммол, 16,0 г). В результате экзотермической реакции получается слегка масляный продукт, который далее может быть рекристаллизован из воды с образованием 12,0 г (32%) целевого вещества в виде белых игольчатых кристаллов.

Физические данные: Т.пл. 163,8-165,3^oC.

¹H-ЯМР (D₂O) σ : 2,04 [6H, c, CH₃], 2,93 [2H, дд, CH₂S], 3,22 [2H, дд, CH₂S] , 3,44 [4H, c, CH₂NBn] , 4,27 [4H, c, PhCH₂N], 4,47 [2H, дд, CHN], 7,44-7,54 [10H, m, Ph].

¹³C-ЯМР (D₂O) σ : 24,82, 42,82, 45,71, 54,47, 56,99, 132,22, 132,58, 132,67, 133,52, 176,56, 179,80.

Анализ (моногидрат), расчет %: C - 53,6, H - 6,6, N - 9,6, S - 11,0. Найдено: C - 54,5, H - 6,6, N - 29,6, S - 11,2.

Пример 16.

Ди-(1-адамантанаминий)-N,N'-диацетил-L-цистинат (Ia, R= [C(I)CH(3,5,7)CH₂(2,4,6,8,9,10,) H₃]
К N,N'-диацетил-L-цистину (5,35 ммол, 1,73 г), растворенному в 5 л воды добавляется 1-адамантанамин (10,7 ммол, 1,61 г). К раствору по каплям добавляется ацетон (60 мл). Полученная кристаллическая соль отфильтровывается и высушивается в вакууме, при этом получается 2,3 г (67%) целевого соединения.

Физические данные: Т.пл. 162^oC.

¹H-ЯМР (D₂O) σ : 1.71 [12H, щдд, CH₂(4,6,10)], 1,87 [12H, д, CH₂(2,8,9)] , 2,05 (6H, c, CH₃], 2,17 [6H, шс., CH(3,5,7)], 2,96 [2H, дд, CH₂S], 3,26 [2H, дд, CH₂S], 4,50 [2H, дд, CHN].

Пример 17.

Ди-(N-бензил-2-фенилэтиламминий)-N,N'-L-цистинат (Ia, R= PhCH₂CH₂NH₂CH₂Ph)
К N,N'-диацетил-L-цистину (28,7 ммол, 9,3 г), растворенному в 20 мл воды добавляется N-бензил-2-фенилэтиламин (57,4 ммол, 12,1 г). Раствор концентрируется до состояния густой пасты, из которой медленно кристаллизуется соль. Кристаллическое целевое соединение выделяют и высушивают.

Физические данные: Т.пл. 87^oC.

¹H-ЯМР (D₂O) σ : 2,05 (6H, c, CH₃], 2,95 [2H, дд, CH₂S], 3.04 [4H, т, PhCH₂C] , 3,24 [2H, дд, CH₂S], 3,33 [4H, т, CH₂NBn], 4,25 [4H, c, PhCH₂N], 4,49 [2H, дд, CHN], 7,30-7,52 [20H, m, Ph]
Пример 18.

Пиперазиний-N,N-диацетил-L-цистинат [Ib, R=NH₂ (1,4) CH₂(2,3,5,6)]
К N,N'-диацетил-L-цистину (4,60 ммол, 1,49 г) растворенному в 5 мл воды, добавляется пиперазин (4,60 ммол, 0,9%). К раствору добавляется достаточное количество изопропанола, чтобы сделать его маслянистым, масло при этом медленно затвердевает. Соль далее выделяется и высушивается.

Физические данные: т.пл. 170^oC (разлож.)
¹H-ЯМР (D₂O) σ : 2,05 [6H, c, CH₃], 2,96 (2H, дд, CH₂S], 3,26 [2H, дд, CH₂S], 3,42 [8H, c, CH₂ (2,3,5,6)], 4,49 [2H, дд, CHN]
Пример 19.

Ди-L-лизиний-N,N'-диацетил-L-цистинат
(Ia, R = H₂N(COOH)CH(CH₂)₄NH₃)
N-ацетил-L-цистеин (37 ммол, 6,0 г) и L-лизин (37 ммол, 5,4 г) растворяются в 10 мл деионизированной воды. При помешивании по каплям добавляется перекись водорода (18 ммол, 1,5 мл), и температура поддерживается ниже 25^oC. Раствор дополнительно перемешивается в течение 4 часов. Вязкий раствор медленно добавляется к 150 мл перегнанного этанола, содержащего 0,50 г кристаллического ди-L-лизиний-N, N'-диацетил-L-цистината. После добавления раствор охлаждается, и кристаллы отделяются фильтрованием.

После промывания этанолом (20 мл) и высушивания (вакуум, 45^oC) в течение 24 часов получается 10,0 г целевого соединения (84%) в виде белых твердых кристаллов.

Физические данные: Т.пл. 208^oC, [α]25D

= -73^o (c = 0,54, H₂O).

Соль органического основания и N,N'-диацетилцистина в L-форме (DiNAc) общей формулы ^-ООССН(NНСОСН₃)СН₂S-SСН₂СН(NНСОСН₃)СН-СОО^- 2R⁺ или ^-ООССН(NНСОСН₃)СН₂S-SСН₂СН(NНСОСН₃)СН-СОО^- R²⁺, где R⁺ и R²⁺ - катион органического основания лизина, этилендиамина, N,N' -дибензилэтилендиамина, адамантанамина, N-бензил-2-фенилэтиламина или пиперазина, получают обработкой DiNAc органическим основанием или солью, содержащей эти катионы органических оснований. Новые соли DiNAc легко кристаллизуются, негигроскопичны и химически стабильны, обладают иммуномодулирующей активностью. 5 с. и 4 з. п. ф-лы, 2 табл.

1. Соль органического основания и N, N'-диацетилцистина в L-форме (DiNAc) общей формулы


где R⁺ и R²⁺ обозначают катион органического основания лизина, этилендиамина, N, N'-дибензилэтилендиамина, адамантанамина, N-бензил-2-фенилэтиламина или пиперазина. 2. Соль по п. 1 N, N'-диацетил-N-цистеина. 3. Способ получения соли соединения по п. 1 или 2, отличающийся тем, что осуществляют обработку DiNАс органическим основанием или солью, содержащей эти катионы органических оснований, при этом реагенты растворяют или диспергируют в растворителе или смеси растворителей, и выделение соли, которая необязательно присутствует в гидратированной форме или в виде сольвата. 4. Способ получения соли соединения по п. 1 или 2, отличающийся тем, что осуществляют окисление соли N-DiNAc, которая необязательно присутствует в гидратированной форме или в виде сольвата. 5. Фармацевтическая композиция, обладающая иммуномодулирующей активностью, включающая активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента содержит соединение по п. 1 или 2 в эффективной дозе 0,1 - 100 мг в день. 6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что предназначена для применения из дозированного ингалятора, находящегося под давлением, или из сухого порошкового ингалятора, или из сухого ингалятора, использующего желатиновые, пластиковые или другие капсулы. 7. фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что ее применяют в форме капсул или таблеток. 8. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что предназначена для использования в виде распылителей. 9. Соль по п. 1 или 2, используемая при лечении злокачественных заболеваний в качестве иммуномодулятора. 10. Способ лечения заболеваний, связанных с дефектом в иммунной системе у млекопитающих, включая человека, заключающийся во введении в организм, в случае необходимости такого лечения, эффективного количества соли DiNАс по п. 1 или 2.