СТИМУЛЯТОР РОСТА КОСТНО-МОЗГОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1999 года по МПК A61K38/04 

Изобретение относится к экспериментальной и клинической гематологии, иммунологии, онкологии, радиационной медицине и может быть использовано для лечения депрессий кроветворения, связанных с развитием нарушений кроветворения при химиотерапии опухолей, трансплантации костного мозга, других органов и тканей, лучевой терапии, радиационных поражениях; для терапии агранулоцитозов и миелодиспластических состояний различного генеза (первичных - генетически обусловленных: вторичных - вследствие воспалительных заболеваний, тяжелых травм, ожогов, вирусных инфекций, в том числе СПИДа).

Известен стимулятор роста костномозговых клеток - "Лейкомакс", представляющий собой лекарственную форму рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. (SANDOZ, Базель, Швейцария. Регистрационный N П-8-242 002487 - Россия).

Применение Лейкомакса может вызывать тяжелые осложнения, и побочные эффекты, особенно у больных с измененной иммунологической реактивностью, которым он в первую очередь и показан. (Инструкция по применению Лейкомакса). Это связано с многочисленными антигенными детерминантами, расположенными на полной молекуле белка, а так же с примесями бактериальных белков и липополисахарида - Т-независимого антигена.

Технология получения рекомбинантных белков весьма трудоемка и сложна, что приводит к высокой стоимости препарата, а, следовательно, к ограничению сферы его применения.

Предлагается использовать в качестве стимулятора роста костномозговых клеток синтетический полипептид, включающий последовательность аминокислот лизин-глицин-пролин-лейцин-треонин -норлейцин-норлейцин-аланин-серин-гистидин-тирозин-лизин-глицин -гистидин-цистеинпролин по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO.

Синтез предлагаемого пептида осуществляют твердофазным методом на пептидном синтезаторе "Biosearch 9500". В качестве носителя используют аминометилированный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с нагрузкой аминогрупп 0,6 ммоль/г. Синтез осуществляют методом последовательного наращивания цепи по модернизированной компьютерной программе для синтезатора "Biosearch 9500" с добавлением N-метилморфолина в конденсирующую смесь, в отличие от прототипа, (Tam J.P., Merrifield R.B. - Int. J. Peptide Protein Res., 1985, 26, p. 262 - 273), что позволяет сократить время конденсации и уменьшить расход аминокислот. Для посадки первой аминокислоты используют ее n-оксиметилфенилацетамидометильное производное (Tam J.P., Kent S.B., Merrifield R. B. , - Synthesis, 1979, p. 955 - 957) Для временной защиты аминогруппы применяют Вос-группу. Боковые функциональные группы защищают Ser, Thr-Bzl; Lys-ClZ; Tyr-C12Bzl; His-Bom; Ser-MeBzl. Конденсацию проводят карбодимидным методом с использованием диизопропилкарбодиимида и добавлением 1-гидроксибензотриазола при присоединении Cln, Lys, Gly, His. Деблокирование аминогрупп в процессе синтеза проводят 50% трифторуксусной кислотой, а нейтрализацию - 7% раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде. Пептиды снимают со смолы и деблокируют жидким фтористым водородом с добавлением n-крезола. Деблокированные пептиды очищают с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте 0,4% трифторацетат/вода-ацетонитрил. Полипептиды характеризуют аналитической ВЭЖХ, аминокислотным анализом и FAB-масс-спектрометрией.

Как показали проведенные исследования, вновь синтезированный пептид оказывает на культивируемые клетки действие, аналогичное действие цельной молекулы ГМ-КСФ.

Синтетическое полипептид по заявляемому способу представляет собой фрагмент структуры природного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Однако трудно было предложить, что синтетический пептид, по молекулярной массе составляющей лишь 1/10 часть полной молекулы ГИ-КСФ, будет обладать ярко выраженными свойствами, присущими природному ГМ-КСФ, тем, более, что в организме человека синтезированный пептид не определяется в виде активной биологической субстанции, и расширение по стандартным точкам действия протеолитических ферментов не выщепляет данную структуру. Таким образом заявляемый объект, не следуя явным образом из уровня техники, имеет изобретательский шаг.

Получение синтетической низкомолекулярной молекулы белка, являющейся фрагментом структуры ГМ-КСФ, процесс значительно менее дорогостоящий, чем получение нативного ГМ-КСФ из стимулированных фитогемагглютинином лейкоцитов костного мозга, в то же время чистота получаемого целевого продукта неизмеримо выше по сравнению с рекомбинантным ГМ-КСФ, что определяется технологией получения синтетического пептида. (Vajham-Rad S., Keating M., Le Maistre A. , et al. , Effects of' recombinant human granulocyte-macrophage colony- stimulating factor in patients with myelodisplastic syndromes. - NEW ENGL J. MED., 1987, v. 317, p. 1545) Следует отметить также, что заявляемый объект и ГМ-КСФ оказывают аналогичное действие при эквимолярных соотношениях, однако весового количества предлагаемого средства требуется на порядок меньше - мол.масса ГМ-КСФ 15000 дальтон, предлагаемого пептида - 1500 дальтон.

Использование заявляемого пептида позволяет стимулировать дифференцировку клеток через специфические рецепторы к ГМ-КСФ, не затрагивая другие рецепторы поверхности клеток, что связано с минимальной величиной молекулярной массы пептида. Следовательно заявляемый объект обладает повышенной избирательностью действия по сравнению с полной молекулой ГМ-КСФ, что послужит основной достижения именно желаемого терапевтического эффекта.

Использование заявляемого стимулятора роста костномозговых клеток позволяет in vitro подобрать индивидуальную дозу для каждого больного, избежать побочных эффектов возможной передозировки известного стимулятора Лейкомакса, с применением заявленного полипептида провести контроль эффективности проводимой терапии на клетках крови этого же больного с последующей корректировкой дозы и длительности лечения.

Минимальные размеры действующей молекулы полипептида, ограниченное количество расположенных на ней антигенных детерминантов позволят избежать возникновения или стимуляции роста злокачественных новообразований, что возможно при использовании известного стимулятора у больных лейкозами и опухолями гранулоцитарно-макрофагального происхождения.

Доза и курс лечения заявляемого стимулятора подбираются индивидуально, с учетом реагирования костномозговых предшественников больного на ту или иную концентрацию препарата in vitro. Введение стимулятора осуществляют подкожно или внутривенно в дозе 0,2 - 2,0 мкг/кг массы тела в течение 5 - 60 суток в зависимости от тяжести депрессии кроветворения и от скорости реагирования костномозговых клеток на введение полипептида. Положительным эффектом терапии считается не менее, чем двухкратный прирост колоние- и кластерообразующих единиц костного мозга или крови. Веедение заявляемого стимулятора прекращают при увеличении числа лейкоцитов свыше 10000 кл/мкл.

Противопоказанием к применению заявляемого стимулятора может быть его индивидуальная непереносимость.

Пример. Синтез предлагаемого пептида осуществляли твердофазным методом на пептидном синтезаторе "Biosearch 9500". В качестве носителя использовали аминометилированный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с нагрузкой аминогрупп 0,6 ммоль/г. Синтез осуществляли методом последовательного наращивания цепи по модернизированной компьютерной программе для синтезатора "Biosearch 9500" с добавлением N-метилморфолина в конденсирующую смесь. Для посадки первой аминокислоты использовали ее n-оксиметилфенилацетамидометильное производное. Для временной защиты аминогруппы применяли Вос-группу. Боковые функциональные группы защищали Ser, Thr- Bzl; Lys-ClZ; Tyr-C12Bzl; His-Bom; Ser-MeBzl. Конденсацию проводили карбодиимидным методом с использованием диизопропилкарбодиимида и добавлением 1- гидроксибензотриазола при присоединении Gln, Lys, Gly. His. Деблокирование аминогрупп в процессе синтеза проводили 50% трифторуксусной кислотой, а нейтрализацию - 7% раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде. Пептиды снимали со смолы и деблокировали жидким фтористым водородом с добавлением п-крезола. Деблокированные пептиды очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте 0,4% трифторацетат/вода-ацетонитрил. Полипептиды характеризовали аналитическое ВЭЖХ, аминокислотным анализом и FAB-масс-спектрометрией. Лиофильно высушенный стерильный препарат содержал 99,99% синтетического полипептида. Перед применением пептиды растворяли в стерильной деионизованной апирогенной воде дозировали по сухому весу.

Изучали влияние заявляемого стимулятора-полипептида и стандарта ГМ-КСФ на кластеро- и колониеобразование у больных в фазе обострения и ремиссии атомического дерматита (площадь поражения более 70%) через 14 суток культивирования. Результаты представлены в таблице.

Исследование влияния ГМ-КСФ и полипептида - заявляемого средства на клетки больных атопическим дерматитом показало:
- наличие у них выраженного иммунодефицитного состояния;
- безусловные показания к применению заявляемого стимулятора роста костномозговых клеток для лечения депрессии кроветворения;
- возможность контроля эффективности стимулятора in vitro на клетках этого же больного с последующей коррекцией разовой и курсовой доз.

Таким образом показана реальность применения заявляемого стимулятора роста костномозговых клеток - синтетического полипептида, как терапевтического средства

Изобретение относится к экспериментальной и клинической гематологии, иммунологии, онкологии, радиационной медицине. Изобретение характеризуется тем, что используют в качестве стимулятора роста костно-мозговых клеток синтетический полипептид, включающий последовательность аминокислот лизин-глицин-пролин-лейцин-треонин-норлейцин-норлейцин-аланин-серин-гистидин-тирозин-лизин-лицин-гистидин-цистеин-пролин по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, соответствующую участку молекулы природного ГМ-КСФ. Синтез предлагаемого пептида осуществляют твердофазным методом. Стимулятор обеспечивает лечение без побочных эффектов и осложнений. 1 табл.

Стимулятор роста костно-мозговых клеток, применяемый при депрессии кроветворения различной этиологии и иммунодефицитах, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют синтетический полипептид, включающий последовательность аминокислот лизин-глицин-пролин-лейцин-треонин-норлейцин-норлейцин-аланин-серин-гистидин-тирозин-лизин-глицин-гистидин-цистеин-пролин по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO.