СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДЕПРЕССИИ КРОВЕТВОРЕНИЯ Российский патент 1999 года по МПК A61K38/04 

Изобретение относится к экспериментальной и клинической гематологии, иммунологии, онкологии, радиационной медицине и может быть использовано для диагностики депрессий кроветворения, связанных с развитием нарушений кроветворений при химиотерапии опухолей, трансплантации костного мозга, других органов и тканей, лучевой терапии, радиационных поражениях; для диагностики агранулоцитозов и миелодиспластических состояний различного генеза (первичных - генетически обусловленных, вторичных - вследствие воспалительных заболеваний, тяжелых травм, ожогов, вирусных инфекций, в том числе СПИДа).

Заявляемый способ может применяться для диагностики депрессии кроветворения при хронических иммунодефицитных состояниях, а также для контроля эффективности терапии, направленной на стимуляцию кроветворения у больных с перечисленными заболеваниями и состояниями.

Известны методы диагностики депрессии кроветворения с использованием генноинженерных (Vadham-Raj S., Keating M., Le Maistre A., et al., - Effects of recombinant human granulocite-macrophage colony - stimulating factor in patients with myelodisplastic syndromes - NEW ENGL. J. MED., 1987, v. 317, p. 1545) и нативных (Shihab-E1-Deen A., Guevara C., Prehal J.F. - Bone Marrow cultures in dismielopoietic syndrome: Diagnostic & prognostic evaluation. - Acta Haemat., 1987, v. 78, p. 17-22) колониестимулирующих факторов.

Существенным недостатком известного способа, применяемого для диагностики депрессии кроветворения, является использование в качестве стимулятора колоние- и кластерообразования супернатанта стимулированных клеток, содержащего наряду с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) многочисленные цитокины. Это значительно снижает точность диагноза, воспроизводимость результатов, селективность действия стимуляторов, увеличивает разброс показателей.

Применение рекомбинантного ГМ-КСФ также обладает рядом существенных недостатков, основным из которых является трудоемкость очистки от балластных белков и особенно липополисахарида, минимальные количества которого могут оказывать побочное действие на колоние- и кластерообразование клеток-предшественников гранулоцитарного и макрофагального ряда.

Кроме того, полная молекула ГМ-КСФ обладает меньшей избирательностью действия - помимо специфических, отвечающих за пролиферацию и дифференцировку клеток, вовлекает в активацию и другие рецепторы, что снижает воcпроизводимость результатов.

Предлагается использовать в способе диагностики депрессий кроветворения для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов низкомолекулярный синтетический пептид с молекулярной массой около 1500 Дальтон следующей структуры: LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO.

Синтез предлагаемого пептида осуществляют твердофазным методом на пептидном синтезаторе "Biosearch 9500". В качестве носителя используют аминометилированный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с нагрузкой аминогрупп 0,6 ммоль/г. Синтез осуществляют методом последовательного наращивания цепи по модернизированной компьютерной программе для синтезатора "Biosearch-9500" с добавлением N-метилморфолина в конденсирующую смесь, в отличие от прототипа (Tam J.P., Merrifield R.B. - Int. J. Peptide Protein Res., 1985, 26, p. 262-273), что позволяет сократить время конденсации и уменьшить расход аминокислот. Для посади первой аминокислоты используют ее п-оксиметилфенилацетамидометильное производное (Tam J. P. , Kent S.B., Merrifield R.B., - Synthesis, 1979, p. 955-957). Для временной защиты аминогруппы применяют Boc-группу. Боковые функциональные группы защищают Ser, Thr-Bzl; Lys - ClZ; - Tyr - C12 Bzl; His - Bom; Ser - MeBzl. Конденсацию проводят карбодиимидным методом с использованием диизопропилкарбодиимида и добавлением 1-гидроксибензотриазола при присоединении Gln, Lys, Gly, His. Деблокирование аминогрупп в процессе синтеза проводят 50%-ной трифторуксусной кислотой, а нейтрализацию - 7%-ным раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде. Пептиды снимают со смолы и деблокируют жидким фтористым водородом с добавлением п-крезола. Деблокированные пептиды очищают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте 0,4% трифторацетат/вода-ацетонитрил. Полипептиды характеризуют аналитической ВЭЖХ, аминокислотным анализом и FAB-масс-спектрометрией.

Как показали проведенные исследования, вновь синтезированный пептид оказывает на культивируемые клетки действие, аналогичное действию цельной молекулы ГМ-КСФ (см. табл. 1).

Синтетический полипептид по заявляемому способу представляет собой фрагмент структуры природного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Однако трудно было предположить, что синтетический пептид, по молекулярной массе составляющий лишь 1/10 часть полной молекулы ГМ-КСФ, будет обладать ярко выраженными свойствами, присущими природному ГМ-КСФ, тем более, что в организме человека синтезированный пептид не определяется в виде активной биологической субстанции, и расщепление по стандартным точкам действия протеолитических ферментов не выщепляет данную структуру. Таким образом, заявляемый объект, не следуя явным образом из уровня техники, имеет изобретательский шаг.

Получение синтетической низкомолекулярной молекулы белка, являющейся фрагментом структуры ГМ-КСФ, процесс значительно менее дорогостоящий, чем получение нативного ГМ-КСФ из стимулированных фитогемагглютинином лейкоцитов костного мозга, в то же время чистота получаемого целевого продукта неизмеримо выше по сравнению с рекомбинантным ГМ-КСФ, что определяется технологией получения синтетического пептида (Vadham-Raj S., Keating M., Le Maistre A. , et al., - Effects of recombinant human granulocyte-macrophage colony - stimulating factor in patients with myelodisplastic syndromes. - NEW ENGL J. MED. , 1987, v. 317, p. 1545). Следует отметить также, что заявляемый объект и ГМ-КСФ оказывают аналогичное действие при эквимолярных соотношениях, однако весового количества предлагаемого средства требуется на порядок меньше - мол. масса ГМ-КСФ 15000 Дальтон, предлагаемого пептида - 1500 Дальтон.

Пример 1.

Синтез предлагаемых пептидов осуществляли твердофазным методом на пептидном синтезаторе "Biosearch 95000". В качестве носителя использовали аминометилированный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с нагрузкой аминогрупп 0,6 ммоль/г. Синтез осуществляли методом последовательного наращивания цепи по модернизированной компьютерной программе для синтезатора "Biosearch-95000" с добавлением N-метилморфолина в конденсирующую смесь. Для посадки первой аминокислоты использовали ее п-оксиметилфенилацетамидометильное производное. Для временной защиты аминогруппы применяли Boc-группу. Боковые функциональные группы защищали Ser, Thr - Bzl; Lys - ClZ; Tyr - C12Bzl; His - Bom; Ser - MeBzl. Конденсацию проводили карбодиимидным методом с использованием диизопропилкарбодиимида и добавлением 1-гидроксибензотриазола при присоединении Gln, Lys, Gly, His. Деблокирование аминогрупп в процессе синтеза проводили 50%-ной трифторуксусной кислотой, а нейтрализацию - 7%-ным раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде. Пептиды снимали со смолы и деблокировали жидким фтористым водородом с добавлением п-крезола. Деблокированные пептиды очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте 0,4% трифторацетат/вода-ацетонитрил. Полипептиды характеризовали аналитической ВЭЖХ, аминокислотным анализом и FAB-масс-спектрометрией. Лиофильно высушенный стерильный препарат содержал 99,99% синтетического полипептида. Перед применением пептиды растворяли в стерильной деионизованной воде и дозировали по сухому весу.

Клетки (в количестве 5•10⁵ кл/мл) из гепаринизированной крови доноров и больных с предполагаемой депрессией кроветворения выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколлверографин (p 1,077) и помещали в планшеты с лунками 0,5 см² х 1 см² с агарозным гелем. В качестве стимулятора использовали ГМ-КСФ и полипептид по предлагаемому способу в концентрациях 1 нМ - 100 нМ в 1 мл. Учет проводили через 7 дней культивирования. Результаты исследования представлены в табл. 1.

Из представленных данных видно, что синтетический полипептид по заявляемому способу отчетливо стимулирует колоние- и кластерообразование, следовательно, может быть использован для диагностики депрессии кроветворения.

У обследованных больных установлена выраженная депрессия кроветворения - по кластерообразованию ≥ в 1,5-2 раза, по колониеобразованию ≥ в 1,5 раза по сравнению со здоровыми донорами.

Важно отметить, что в обеих группах применение полипептида по заявляемому способу по сравнению с лейкомаксом демонстрировало более низкий ответ по кластерообразованию и идентичный - по колониеобразованию. Более выраженное действие полной молекулы ГМ-КСФ по сравнению с полипептидом по заявляемому способу на кластерообразующие клетки, несущие большее количество рецепторов, при одинаковом их действии на менее зрелые колониеобразующие клетки говорит о большей избирательности действия полипептида по сравнению с полной молекулярной ГМ-КСФ.

Пример 2.

Полипептид синтезировали, как описано в примере 1.

Клетки крови здоровых доноров и больных выделяли, как описано в примере 1.

Изучали влияние полипептида по заявляемому способу и стандарта ГМ-КСФ на кластеро- и колониеобразование у больных в фазе обострения и ремиссии атопического дерматита (площадь поражения более 70%) через 14 суток культивирования. Результаты представлены в табл. 2.

Исследование влияния ГМ-КСФ и полипептида по заявляемому способу на клетки больных атопическим дерматитом показало:
- наличие у них выраженного иммунодефицитного состояния;
- при обострении показатели, выявляемые заявляемым и известными способами, - одинаковы, в то же время при ремиссии полная молекула ГМ-КСФ более эффективна, что объясняется восстановлением рецепторного аппарата клеток при выздоровлении.

Сохранение аналогичной картины у здоровых доноров подтверждает повышенную специфичность действия полипептидов по сравнению с полной молекулой ГМ-КСФ.

Таким образом, заявляемый способ диагностики депрессии кроветворения с применением синтетического полипептида, обладая рядом преимуществ по сравнению с известным способом, в том числе дешевизной, имеет новизну и может быть использован в клинической практике.

Изобретение относится к экспериментальной и клинической гематологии, иммунологии, онкологии, радиационной медицине. Изобретение характеризуется тем, что для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов низкомолекулярный синтетический пептид с мол.м. около 1500 дальтон используют следующей структуры: LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO. Синтез предлагаемого пептида осуществляют твердофазным методом. Способ обеспечивает точность диагностики. 2 табл.

Способ диагностики депрессии кроветворения, включающий выделение клеток крови человека, их культивирование на искусственных питательных средах для получения колониеобразующих и кластерообразующих клеток, отличающийся тем, что в качестве стимулятора колониеобразования и кластерообразования используют синтетический полипептид, включающий последовательность аминокислот лизин-глицин-пролин-лейцин-треонин-норлейцин-норлейцин-аланин-серин-гистидин-тирозин-лицин-глицин-гистидин-цистеин-пролин по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, и в случае кластерообразования больше в 1,5 - 2 раза, а колониеобразование больше в 1,5 раза по отношению к здоровым людям диагностируют депрессию кроветворения.