СПОСОБ КОНФОКАЛЬНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ ТРЕХМЕРНОЙ МИКРОСКОПИИ И КОНФОКАЛЬНЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ ТОМОГРАФИЧЕСКИЙ МИКРОСКОП Российский патент 1999 года по МПК G02B21/00 

Изобретение относится к микроскопии и может быть использовано в биологии, медицине, материаловедении.

За прототип взят способ конфокальной сканирующей микроскопии, описанный " Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed. by J.B. Pawley, Plenum Press, New-York and London, 1990" Конфокальная сканирующая микроскопия была специально разработана для повышения селективных свойств микроскопов по глубине трехмерных объектов. Способ заключается в том, что фокусируют излучение от точечного первичного источника света в точке, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта, с образованием вторичного источника света, формируют изображение вторичного источника света и осуществляют пространственную фильтрацию излучения вторичного источника точечной диафрагмой в плоскости его изображения. Интенсивность прошедшего излучения детектируют точечным (интегральным) фотоприемником, расположенным сразу за диафрагмой. Далее выполняют позиционное сканирование исследуемого трехмерного объекта или вторичного источника света по всем трем направлениям, повторяя для каждой позиции формирование изображения вторичного источника света, пространственную фильтрацию излучения вторичного источника света и детектирование этого излучения. Полученные значения интенсивности излучения последовательно отображаются в виде двумерных изображений различных продольных сечений трехмерного объекта.

Основной технический эффект способа, принятого за прототип, заключается в уменьшении вклада расфокусированных изображений в изображение искомого сечения трехмерного объекта. Этот эффект достигается за счет пространственной фильтрации точечной диафрагмой излучения от вторичных источников света, находящихся вне плоскости фокусировки.

Этот способ применим в основном для флуоресцентных объектов, но даже для таких объектов конфокальная микроскопия формирует изображения внутренних сечений лишь в некотором приближении. Это вызвано тем, что в конфокальном микроскопе объект зондируется коническим пучком, вершина которого находится внутри объекта. Интегрирование информации выполняется по лучам, проходящим через эту вершину и равномерно заполняющим конус. В конфокальном микроскопе регистрируется суммарная интенсивность света от источников, расположенных на прямых, прошедших через эту вершину, а не истинное значение интенсивности света в этой вершине.

Второй недостаток связан с большим временем сканирования. Для восстановления изображений исследуемого трехмерного объекта требуется сканирование по всем трем направлениям. Вначале производится сканирование в плоскости для получения двумерных изображений сечений объекта, а затем плоскость сканирования смещается вдоль оптической оси и повторяется весь процесс сканирования. Большое время сканирования ограничивает возможности микроскопа при исследовании динамических объектов. Время неподвижности объекта должно быть сравнимо со временем сканирования.

Конфокальный сканирующий микроскоп (см. там же), реализующий известный способ, содержит расположенные последовательно вдоль оптической оси микроскопа точечный источник света, линзу-конденсор, микрообъектив, точечную диафрагму и регистрирующее устройство. Причем линза-конденсор расположена на таком расстоянии от источника света, что она формирует изображение этого источника внутри объекта, а микрообъектив переносит это изображение в плоскость точечной диафрагмы. Поэтому данная диафрагма полностью пропускает свет от тех точек внутри микрообъекта, которые находятся в оптически сопряженной плоскости. Регистрирующее устройство, расположенное сразу за диафрагмой, детектирует интенсивность прошедшего света. Свет от других точек внутри микрообъекта, которые находятся вне данной плоскости, фокусируется вне плоскости диафрагмы, следовательно, через диафрагму проходит лишь малая часть света от этих точек и их вклад в результирующий сигнал регистрирующего устройства будет мал. Поэтому конфокальный сканирующий микроскоп обладает лучшей избирательной способностью по глубине объекта, чем обычный микроскоп. Для получения информации от других точек необходимо сканирование объекта относительно изображения точечного источника света в трех направлениях. Этот микроскоп применим в основном для флуоресцентных объектов. Основной недостаток работы данного микроскопа заключается в том, что получаемые на нем изображения несут суммарную информацию об оптических характеристиках исследуемого трехмерного микрообъекта вдоль набора лучей, лежащих внутри конуса, вершина которого совпадает с положением изображения точечного источника света внутри микрообъекта.

В основу настоящего изобретения положена задача создания способа конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии и конфокального сканирующего томографического микроскопа, обеспечивающих восстановление томограмм трехмерного объекта при уменьшении времени сканирования объекта.

Поставленная задача решается тем, что в способе конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии, заключающемся в том, что фокусируют излучение от точечного первичного источника света в точке, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта, с образованием вторичного источника света, формируют изображение вторичного источника света и осуществляют пространственную фильтрацию излучения вторичного источника света в плоскости его изображения с последующим детектированием этого излучение, выполняют позиционное сканирование исследуемого трехмерного объекта или вторичного источника света, повторяя для каждой позиции формирование изображения вторичного источника света, пространственную фильтрацию излучения вторичного источника света и детектирование этого излучения, согласно изобретению позиционное сканирование исследуемого объекта или вторичного источника света выполняют в плоскости сканирования, перпендикулярной оптической оси, проходящей через точечный первичный и вторичный источники света, последовательно для каждой позиции сканирования детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения одного из параметров этого излучения в плоскости, параллельной плоскости сканирования и отстоящей от плоскости изображения вторичного источника света, после чего запоминают зарегистрированные значения двумерных распределений, из которых выбирают значения в точках с одинаковыми координатами и образуют из них двумерные параллельные проекции исследуемого трехмерного объекта, по которым реконструируют его томограммы.

В предлагаемом способе позиционное сканирование исследуемого объекта или вторичного источника света выполняют только в одной плоскости сканирования, перпендикулярной оптической оси, проходящей через точечный первичный и вторичный источники света. В способе, взятом за прототип, сканирование производится во всех трех направлениях, поэтому время сканирования в этом способе выше. В предлагаемом способе при сканировании только в одной плоскости регистрируется достаточный объем информации для восстановления трехмерного изображения объекта. Пусть ось z направлена вдоль этой оптической оси, а начало координат поместим в точке фокусировки излучения первичного источника света, т. е. в месте образования вторичного источника света. В предлагаемом способе сканирование производится только в одной плоскости, поперечной к оптической оси, т.е. в плоскости (x,y), уравнение которой z=0. Чтобы оценить количественно выигрыш во времени сканирования, предположим, что мы хотим восстановить трехмерное изображение объекта на дискретной сетке размером NxNxN, где N - число позиций сканирования вдоль каждой координатной оси. Тогда в способе-прототипе требуется N³ актов сканирования, из которых N² позиций сканирования приходится на получение двумерных изображений сечений объекта плоскостью z=const, и N позиций сканирования вдоль оси z. В предлагаемом способе сканирование выполняют только в одной плоскости по двумерной сетке размером N•N точек, поэтому требуется только N² позиций сканирования, что в N раз меньше, чем в способе-прототипе.

При этом потери информации об объекте не происходит, так как в предлагаемом способе для каждой позиции сканирования детектирование излучения вторичного источника осуществляют путем регистрации двумерного распределения одного из параметров этого излучения в плоскости, параллельной плоскости сканирования и отстоящей от плоскости изображения вторичного источника света, с помощью координатно-чувствительного матричного фотоприемника. В способе-прототипе для каждой позиции сканирования детектирование излучения вторичного источника осуществляют путем регистрации интегральной интенсивности излучения с помощью точечного фотоприемника. Пусть регистрация двумерного распределения осуществляется на сетке из n•n точек. Если полное число этих точек равно N, т.е. при N=n², общее количество данных об объекте в предлагаемом способе будет состоять из N³ значений одного из параметров излучения. Но получен этот объем информации за меньшее количество позиций сканирования. Так как время механического сканирования объекта или вторичного источника света больше, чем время электронного считывания двумерного распределения одного из параметров излучения, то полное время сбора такого объема информации в предлагаемом способе будет меньше, чем в способе-прототипе.

Запомнив зарегистрированные значения двумерных распределений одного из параметров излучения для всех позиций сканирования далее выбирают из них значения в точках с одинаковыми координатами. В эти точки приходят лучи с одинаковыми угловыми координатами, поэтому эти лучи для различных позиций сканирования будут параллельны друг другу. Следовательно, из них можно образовать двумерные параллельные проекции исследуемого трехмерного объекта, по которым реконструируют его томограммы. Проекции будут состоять из NxN точек, где N - число позиций сканирования вдоль одной координатной оси. Полное число проекций, полученных из зарегистрированных значений двумерных распределений, определяется числом точек в этом распределении, т.е. равно n². При сканировании на сетке 256x256 точек, регистрацию двумерных распределений можно производить на сетке 16x16 точек. Из этих данных можно образовать 256 проекций размером 256x256 точек. Такого количества проекций достаточно для восстановления трехмерных томограмм на сетке 256x256x256. В отличие от способа-прототипа эти изображения будут отражать истинное распределение оптических неоднородностей внутри объекта, а не его суммарную картину.

Различие в типе оптических неоднородностей определяет вид параметра оптического излучения, которое подвергается регистрации.

Детектирование излучения можно осуществлять путем регистрации двумерного распределения интенсивности излучения вторичного источника света. Регистрация именно двумерного распределения интенсивности излучения позволяет сформировать томографические проекции флуоресцентного (эмиссионного) трехмерного объекта и восстановить по ним точные изображения различных сечений (томограмм) объекта. При этом излучение первичного источника света служит для возбуждения флуоресценции объекта, а вторичным источником света является источник флуоресцентного свечения. Исследованию подлежит пространственное распределение интенсивности флуоресцентного свечения, по которому судят о пространственном распределении плотности флуоресцирующего вещества.

Детектирование излучения можно осуществлять также путем регистрации двумерного распределения амплитуды излучения вторичного источника света. Регистрация амплитуды излучения позволяет применить этот способ для объектов, поглощающих зондирующее излучение. Объектом исследования в этом случае служит пространственное распределение коэффициента поглощения на длине волны излучения первичного источника света.

Для оптически прозрачных объектов детектирование излучения целесообразно осуществлять путем регистрации двумерного распределения фазы излучения вторичного источника света. Регистрация фазы излучения позволяет применить этот способ для оптически прозрачных объектов. Объектом исследования в этом случае служит пространственное распределение показателя преломления на длине волны излучения первичного источника света.

При регистрации двумерного распределения интенсивности излучения вторичного источника света дополнительно осуществляют многоканальное спектральное разложение этого излучения с помощью набора дифракционных решеток различной ориентации и частоты ее штрихов. Это целесообразно делать для флуоресцентных объектов, имеющих широкий спектр излучения. Дополнительное спектральное разложение излучения вторичного источника света необходимо для получения спектротомографических проекций, по которым восстанавливаются томограммы объекта на разных длинах волн излучения вторичного источника света. Для получения различных спектротомографических проекций регистрацию двумерного распределения интенсивности излучения производят по многим каналам одновременно или последовательно во времени. В каждом канале осуществляют разложение излучения в спектр по различным длинам волн. Эту операцию можно выполнить с помощью дифракционного оптического элемента, которого меняется ориентация и частота штрихов.

Поставленная задача решается также тем, что в конфокальном сканирующем томографическом микроскопе, содержащем точечный первичный источник света, устройство перемещения исследуемого трехмерного объекта, линзу-конденсор, фокусирующую излучение от точечного первичного источника света в точке, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта при его размещении на указанном устройстве перемещения микрообъектив, формирующий изображение вторичного источника света, образованного при фокусировании излучения от точечного первичного источника света, точечную диафрагму расположенную в плоскости изображения вторичного источника света, и детектор излучения, согласно изобретению, детектор излучения размещен на расстоянии за точечной диафрагмой и выполнен в виде матрицы фотоприемников.

В известном микроскопе детектор излучения расположен сразу за точечной диафрагмой и выполнен в виде одиночного интегрального фотоприемника. Применение многоэлементного матричного фотоприемника позволяет зарегистрировать двумерное распределение интенсивности излучения, в то время, как интегральный фотоприемник может регистрировать только весь световой поток падающего на него излучения. Для того, чтобы согласовать размеры светового пятна с размерами площадки чувствительности матричного фотоприемника последний необходимо расположить на некотором расстоянии от точечной диафрагмы. Это расстояние зависит от числовой апертуры микрообъектива. Регистрация двумерного распределения интенсивности излучения позволяет уменьшить число направлений сканирования и сформировать двумерные параллельные проекции, по которым осуществляют реконструкцию трехмерной томограммы объекта.

Если в конфокальном сканирующем томографическом микроскопе между точечной диафрагмой и матрицей фотоприемников разместить дифракционный оптический элемент, то тогда появляется возможность регистрации спектротомографических проекций от полихроматического объекта. При этом дифракционный оптический элемент выполняет роль многоканального диспергирующего элемента, разлагающего падающее на него излучение в набор спектров, пространственно разделенных и непересекающихся. В качестве такого дифракционного оптического элемента может служить комбинированная дифракционная решетка, состоящая из нескольких решеток с различной ориентацией и частотой штрихов. Количество таких элементарных решеток определяет число спектротомографических проекций. По полученным проекциям определяют число спектротомографических проекций. По полученным проекциям осуществляют реконструкцию четырехмерной томограммы объекта. При этом под четырехмерной томограммой мы понимаем набор трехмерных пространственных томограмм для различных длин волн излучения.

На фиг.1 приведена принципиальная схема микроскопа, реализующего способ конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии, на фиг.2 - схема зондирования объекта конусным пучком света, на фиг. 3 - три позиции сканирования вторичного источника света относительно объекта.

Схема микроскопа, реализующего способ конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии, состоит из точечного первичного источника 1 (фиг.1) света, линзы-конденсора 2, фокусирующей излучение от точечного первичного источника 1 света в точке О, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта 3 с образованием в этой точке вторичного источника света. Исследуемый трехмерный объект 3 размещен на двухкоординатном устройстве 4 перемещения. Микроскоп содержит также микрообъектив 5, формирующий изображение вторичного источника света, точечную диафрагму 6, расположенную в плоскости изображения вторичного источника света, и детектор 7 излучения, размещенный на расстоянии s за точечной диафрагмой 6. Детектор 7 излучения выполнен в виде матрицы фотоприемников.

Предлагаемый способ конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии осуществляют следующим образом.

Излучение от точечного первичного источника 1 света линзой-конденсором 2 фокусируют в точке О, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта 3 с образованием вторичного источника света. Пусть эта точка имеет координаты (x,у) в неподвижной системе координат (x,y,z), связанной с объектом 3. Далее с помощью микрообъектива 5 формируют изображение вторичного источника света в плоскости, в которой расположена точечная диафрагма 6. С помощью этой диафрагмы 6 осуществляют пространственную фильтрацию излучения вторичного источника света. Прошедшее излучение детектируют путем регистрации двумерного распределения одного из параметров этого излучения в плоскости детектора 7, расположенного на некотором расстоянии s от диафрагмы 6. Расстояние s выбирают исходя из размеров площадки чувствительности детектора 7 и числовой апертуры микрообъектива 5, т.е. от угла θ_max на фиг.1. В качестве детектора 7 используется матричный (координатно-чувствительный) фотоприемник, например, ПЗС-матрица (ПЗС - прибор с зарядовой связью). На каждый чувствительный элемент этого детектора, имеющего декартовы координаты (ξ,η), попадает свой луч АВ (.фиг. 2), который проходил через точку О объекта 3 под угловыми координатами (θ,ϕ) относительно неподвижной системы координат (x,y, z). Таким образом, между декартовыми координатами детектора 7 и угловыми координатами луча есть взаимно однозначное соответствие. Если предположить без ограничения общности, что угловое увеличение микрообъектива 5 равно единице, то это соответствие можно выразить следующими соотношениями:

Таким образом, регистрация двумерного распределения одного из параметров излучения на сетке nхn элементов сразу дает информацию о n² лучах, проходящих через объект 3 под различными полярным и азимутальным углами θ и ϕ. В зависимости от типа объекта, регистрации подвергаются различные параметры этого излучения. Одно будет общим для всех типов объектов, это то, что информация об объекте вдоль этих лучей будет суммироваться. В томографии такая информация носит название луч-суммы. Следовательно, при регистрации двумерного распределения одного из параметров излучения получают целый набор луч-сумм вдоль лучей, равномерно заполняющих конус с вершиной в точке с координатами (x,y) внутри объекта 3. Полученные данные запоминают, например, в компьютере.

После этого выполняют позиционное сканирование исследуемого объекта 3 с помощью двухкоординатного устройства 4 перемещения или вторичного источника света друг относительно друга в одной плоскости (x,y), перпендикулярной оптической оси, проходящей через точечный первичный источник 1 света и вторичный источник света. При этом вторичный источник света перемещается в точку О' с координатами (x', y') (см. фиг.3). Для каждой новой позиции сканирования повторяют все предыдущие операции и, соответственно, регистрируют двумерное распределение одного из параметров излучения для другого конуса лучей, вершина которого находится в точке О' внутри объекта 3. Для примера на фиг.3 схематично изображены три позиции сканирования.

Из зарегистрированных значений двумерных распределений далее выбирают значения в точках с одинаковыми координатами на детекторе 7, например точки В, B',B''. На фиг. 3 видно, что для разных позиций сканирования О, O', O'' в эти точки приходят лучи AB, A'B' и A''B'', которые будут параллельны друг другу. Следовательно, из луч-сумм вдоль этих прямых можно образовать двумерные параллельные проекции исследуемого трехмерного объекта. Причем угловые координаты такой проекции определяются по соотношениям (1), (2). Если функция f(x, y,z) описывает искомый трехмерный объект, то уравнение образованных из луч-сумм проекций можно записать в виде:

где (θ,ϕ) - угловые координаты направления проецирования, связанные с пространственными координатами лучей (ξ,η) в плоскости детектора соотношениями (1), (2); (x_i, y_j) - прямоугольные координаты позиций сканирования, i, j = 1,2,..., N; N - общее количество позиций сканирования по одному направлению. Таким образом, проекции будут заданы на сетке N•N точек, а количество проекций (число угловых направлений проецирования) зависит от общего числа элементов в матричном фотоприемнике. Траектория проецирования определяется видом геометрической кривой, на которой лежат выбранные точки на матричном детекторе. Задавая различные последовательности опроса элементов фотоприемника, можно получать произвольные двумерные траектории проецирования. Описанная схема сбора проекций имеет конечный полярный угол обзора, ограниченный числовой апертурой микрообъектива 5. Для 100-кратного иммерсионного микрообъектива с числовой апертурой 1,25 угол обзора по полярному углу θ может достигать выше 90^o. По азимутальному углу ϕ ограничений нет и диапазон углов может составлять 360^o.

По образованным двумерным проекциям (3) производится реконструкция томограмм для всего трехмерного объекта, т.е. решение этого интегрального уравнения относительно трехмерной функции f(x,y,z). Для реконструкции томограмм в условиях ограниченного угла обзора можно применять итерационные алгоритмы.

Предложенный способ позволяет только за счет сканирования в одной плоскости z = 0 получать данные, необходимые для реконструкции томограмм всего трехмерного объекта. С помощью способа, принятого за прототип, за аналогичное сканирование восстанавливается, во-первых, только одно изображение а, во- вторых, это изображение не является томограммой, а является так называемым суммарным изображением сечения z=0 объекта. Одна точка такого изображения образуется за счет суммирования различных луч-сумм вдоль лучей, равномерно заполняющих конус с вершиной внутри объекта (фиг. 2). Поэтому такое изображение будет с искажением передавать истинное распределение искомых оптических неоднородностей объекта. Суммарное изображение отличается от томограммы так же, как рентгеновская компьютерная томограмма отличается от классической аналоговой томограммы, получаемой на рентгеновских установках с синхронным перемещением пары источник излучения - регистратор. Суммарное изображение в некотором приближении можно рассматривать как сильно расфокусированную томограмму.

Для различных типов объектов регистрируются различные параметры оптического излучения.

Для флуоресцентных объектов, которые описываются трехмерным пространственным распределением интенсивности I(x,y,z) собственного свечения на длине волны излучения, отличающейся от длины волны возбуждающего излучения (света накачки), регистрируемым параметром излучения служит интенсивность флуоресцентного излучения. Детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения интенсивности излучения вторичного (флуоресцентного) источника света. Из этих данных формируются проекции (3), по которым реконструируют томограммы флуоресцентного объекта. В выражении (3) для проекции в этом случае функция f(x,y,z)= I(x,y,z). По восстановленному пространственному распределению интенсивности флуоресцентного свечения судят о пространственном распределении плотности флуоресцирующего вещества (красителя, лекарства).

Поглощающие (амплитудные) объекты описываются трехмерным пространственным распределением коэффициента поглощения α (x,y,z) для света от первичного источника излучения. В этом случае детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения амплитуды излучения вторичного источника света. Если обозначить через A₁ амплитуду излучения от первичного источника света для какого-либо луча, то после прохождения через объект амплитуду излучения можно описать выражением:
A = A₁exp[-∫αdl], (4)
где dl-дифференциал пути вдоль луча. После регистрации амплитуды А излучения, зная амплитуду A₁ излучения от первичного источника света, проекции (3) формируются из следующего соотношения:
Φ = -ln(A/A₁) (5)
Для амплитудных объектов функция f(x,y,z) = α (x,y,z) в выражении для проекции (3). Длина волны излучения первичного источника света совпадает с длиной волны излучения вторичного источника света. По восстановленному пространственному распределению коэффициента поглощения судят о пространственном распределении плотности поглощающего (красящего) вещества.

Оптически прозрачные (фазовые) объекты описываются разностью между трехмерным пространственным распределением показателя преломления объекта n(x,y,z) и показателем преломления окружающей среды n₀. В этом случае детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения фазы излучения вторичного источника света. Если обозначить через A₁ комплексную амплитуду излучения от первичного источника света для какого-либо луча, то после прохождения через объект амплитуду излучения можно описать выражением
A = A₁exp[i(2π/λ)∫(n-n₀)dl], (6)
где λ - длина волны излучения первичного источника света, которая совпадает с длиной волны излучения вторичного источника света. Отсюда видно, что фаза комплексной амплитуды излучения несет информацию о проекции (3) фазового объекта, т.е.

Φ= arg(A) (7)
Функция f из (3), описывающая объект, в этом случае равна
f(x,y,z) = (2π/λ)[n(x,y,z)-n₀]. (8)
Для регистрации фазы излучения и получения количественных ее значений можно использовать интерференционный метод. По восстановленному пространственному распределению показателя преломления судят о пространственном распределении плотности объекта или введенных в него веществ, например, лекарств.

Для флуоресцентных объектов, которые описываются четырехмерным пространственно-спектральным распределением интенсивности I(x,y,z λ ) собственного свечения объекта на различных длинах волн излучения λ, задача исследования такого объекта распадается на несколько частей. Вначале формируют двумерные по пространственным координатам распределения интенсивности излучения вторичного источника света. Но, так как собственное флуоресцентное излучение объекта в этом случае является полихроматическим (многоцветным), то эти распределения реально описываются трехмерной функцией и третьей переменной служит длина волны λ. В работе (Булыгин Ф.В., Вишняков Г.Н., Левин Г.Г., Карпухин Д.В. "Оптика и спектроскопия", 1991, т.71, N 6, стр. 974-978) для исследования такого абстрактного трехмерного объекта предложено применять специальный метод томографии, который получил название спектротомографии. Проекциями в этом случае служат спектрограммы, полученные с помощью бесщелевых спектрометров с различными дисперсией и/или направлением "растяжения" в спектр. Для формирования таких спектротомографических проекций при регистрации двумерного распределения интенсивности излучения вторичного источника света дополнительно осуществляют многоканальное спектральное разложение этого излучения с помощью дифракционного оптического элемента различной ориентации и частоты ее штрихов. Так как само двумерное распределение интенсивности излучения занимает небольшую часть (всего 16х16 элементов для получения 256 проекций) площади матричного приемника, то оставшуюся часть элементов можно использовать под одновременную регистрацию разных спектротомографических проекций. Зарегистрированные значения двумерных спектротомографических проекций запоминают для каждой позиции сканирования.

После окончания сканирования и сбора данных производится обработка данных, формирование проекций и реконструкция томограмм. Сначала для каждой позиции сканирования по полученным двумерным спектротомографическим проекциям восстанавливают двумерные изображения распределения интенсивности излучения вторичного источника света на разных длинах волн, так называемые спектротомограммы. Методика восстановления изображений по спектротомографическим проекциям такая же, как и для обычных томограмм. Разрешение по спектру зависит от количества спектротомографических проекций.

Далее по восстановленным изображениям для каждой фиксированной длины волны λ =const выбирают значения интенсивности в точках с одинаковыми координатами и образуют двумерные пространственные параллельные проекции исследуемого объекта, по которым реконструируют трехмерную томограмму. Эта томограмма будет отражать трехмерное пространственное распределение интенсивности флуоресцентного излучения на выбранной длине волны λ =const. Далее производят формирование проекций и реконструкцию трехмерной томограммы на другой длине волны. И так для всех длин волн из спектра излучения вторичного источника света. В результате восстанавливается набор трехмерных томограмм объекта на различных длинах волн или его четырехмерная томограмма.

Согласно изобретению в конфокальном сканирующем томографическом микроскопе, в котором между точечной диафрагмой 6 и матрицей фотоприемников детектора 7 может быть размещен дифракционный оптический элемент 8 (фиг. 1), этот элемент осуществляет многоканальное спектральное разложение излучения вторичного источника света. Например, это может быть дифракционная решетка, имеющая много порядков дифракции. Дисперсия в каждом порядке дифракции будет разная, поэтому такая решетка дает сразу несколько спектротомографических проекций по числу порядков дифракции. Если использовать аналогичную решету, но с другой ориентацией штрихов, то можно получать спектротомографические проекции по другому направлению. Соответственно, дифракционный оптический элемент, состоящий из суммы таких решеток, будет формировать одновременно все эти проекции.

Суть изобретения заключается в том, что с помощью линзы-конденсора фокусируют излучение от точечного первичного источника света в точке, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта при размещении его на устройстве перемещения, с помощью микрообъектива формируют изображение вторичного источника света. Пространственную фильтрацию излучения вторичного источника света в плоскости его изображения осуществляют с помощью точечной диафрагмы. Детектирование излучения вторичного источника света, т.е. регистрацию двумерного распределения одного из параметров этого излучения, осуществляют детектором излучения, выполненным в виде матрицы фотоприемников. Позиционное сканирование исследуемого объекта или вторичного источника света выполняют в одной плоскости сканирования, перпендикулярной оптической оси, проходящей через точечный первичный и вторичный источники света. Для каждой позиции сканирования повторяют формирование изображения вторичного источника света, пространственную фильтрацию его излучения и детектирование этого излучения. Запоминают зарегистрированные значения двумерных распределений, из которых выбирают значения в точках с одинаковыми координатами и образуют из них параллельные проекции исследуемого объекта, по которым реконструируют его томограммы. Предложенный способ конфокальной сканирующей микроскопии позволяет только за счет сканирования в одной плоскости получать данные, необходимые для реконструкции томограмм всего трехмерного объекта. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 3 ил.

1. Способ конфокальной сканирующей трехмерной микроскопии, заключающийся в том, что фокусируют излучение от точечного первичного источника света в точке, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта, с образованием вторичного источника света, формируют изображение вторичного источника света и осуществляют пространственную фильтрацию излучения вторичного источника в плоскости его изображения с последующим детектированием этого излучения, выполняют позиционное сканирование исследуемого трехмерного объекта или вторичного источника света, повторяя для каждой позиции формирование изображения вторичного источника света, пространственную фильтрацию излучения вторичного источника света и детектирование этого излучения, отличающийся тем, что позиционное сканирование исследуемого объекта или вторичного источника света выполняют в одной плоскости сканирования, перпендикулярной оптической оси, проходящей через точечный первичный и вторичный источники света, последовательно для каждой позиции сканирования детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения одного из параметров этого излучения в плоскости, параллельной плоскости сканирования и отстоящей от плоскости изображения вторичного источника света, после чего запоминают зарегистрированные значения двумерных распределений, из которых выбирают значения в точках с одинаковыми координатами и образуют из них двумерные параллельные проекции исследуемого трехмерного объекта, по которым реконструируют его томограммы. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения интенсивности излучения вторичного источника света. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения амплитуды излучения вторичного источника света. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование излучения осуществляют путем регистрации двумерного распределения фазы излучения вторичного источника света. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что при регистрации двумерного распределения интенсивности излучения вторичного источника света дополнительно осуществляют многоканальное спектральное разложение этого излучения с помощью дифракционного оптического элемента различной ориентации и частоты его штрихов. 6. Конфокальный сканирующий томографический микроскоп, содержащий точечный первичный источник света, устройство перемещения исследуемого трехмерного объекта, линзу-конденсор, фокусирующую излучение от точечного первичного источника света в точке, расположенной внутри исследуемого трехмерного объекта, при его размещении на указанном устройстве перемещения, микрообъектив, формирующий изображение вторичного источника света, образованного при фокусировании излучения от точечного первичного источника света, точечную диафрагму, расположенную в плоскости изображения вторичного источника света, и детектор излучения, отличающийся тем, что детектор излучения размещен на расстоянии за точечной диафрагмой и выполнен в виде матрицы фотоприемников. 7. Конфокальный сканирующий томографический микроскоп по п.6, отличающийся тем, что между точечной диафрагмой и матрицей фотоприемников размещен дифракционный оптический элемент.