Способ индентификации штаммов вируса ящура Советский патент 1976 года по МПК C21K1/00 

в момент наибольшего различия гомологичной и гетерологччной систем по этому показателю, либо по количеству гемоглобина в реагирующей смеси после прерывания гемолиза, например, центрифугированием.

На фиг, 1 графически изображена кинетика иммунного гемолиза; на фиг. 2 - результаты реакции с 5Ш(Урным анигеном Ост на фиг. 3 - результаты реакции с сывороткой крови бычка, взятой через 21 дней после экспериментального заражения вирусом Я1дура А22Способ осуществляют следующим образом.

i Заранее готовят гемолитическую систему и рабочий раствор комплемента, которые хранят в течение 7-10 дней в холодильнике при температуре 4°С. Реакцию ставят в плавающей панели, изготовленной из тонкого .органического стекла, с луночками объемом, 0,25-0,4 мл, В трех рядах луночек готовят разведения испытуемого антигена от 1:4 до 1:256 в-объеме 0,1мл добавляют по 0,025 мл рабочего разведения антисывороток: в луночки первого ряда - , второго Д2р третьего

- Ост. При необходимости можно изменить набор штаммов и количество рядов разведений антигена.

Затем во.все луночки вносят по 0,О25 мл раствора комплемента, и панель опускают в вод5шую баню при ЗТ-С на 5-10 мин. Панель должна плавать на поверхност воды. По истечении 5-1О мин., в момент наиболее интенсивного связывания комплемен та в гомологичной системе во все луночки впося1 по О,О25 мл гемсистемы, и панель опускают в ту же водяную башр. На дне бани должен быть лист белой пластмассы с четкой черной сеткой. Степень гемолиза отмечают через каждые 5 мин. Через 10 мин, отмечают первые результаты реакции. Отрицательная реакция - через содержим мое луночек видна сетка на дне водяной бани, положительная реакция - сетки не видно. Учет результатов производят до тех пор, пока не наступит четкое различие сред по степени мутности в гомологичной и гетерол;огичной системах, т.е. различие в титрах антигена с антисыворот- ками различных типов вируса ящура. Результаты реакции заносят в таблицу, обозначая цифрой время прохождейий гемолиза в каждой луночке в минутах. Обычно читку заканчивают на 15-о.й минуте.

Результат реакции может быть получен через 30 мин. после поступления антигена на исследование. Подобным же споообом можно исследовать и ящурные антисыворотки.

Результаты реакции могут быть определены при прерывании гемолиза.

Для этого берут 8 центрифужных пробирок, в три первые пробирки наливают по 3 мл испытуемого антигена в разведении 1:100 - 1:200, а в остальные - по 3,2 мл физиологического раствора (рН 7,0.7,2). Затем к ним добавляют по 2 дозы антисывороток (антител) в объеме 0,2 мл: .

в первую и четвертую пробирку - О ,

1У Tt

ВО вторую и пятую - А „, в третью и

«

шестую - Ост, При необходимости можно изменить или увеличить набор щтаммов. После этого, в первые 6 пробирок добавляют по 1 мл рабочего разведения комплемента, а в 7 и 8 пробирки по 1 мл физиологического растьора, Все пробирки на 10 мин. помещают в водяную баню при 37°С, По истечении 1О мин. в момент наиболее интенсивного связывания комплемен. та в гомологичной системе во все пробирки добавляют гемсистему: в 1, 2, 3, 4, :5 и 6 пробирки по 0,2 мл, в седьмую О, 15 мл, в восьмую - 0,1 мл. Пробирки помещают в ту же водяну.ю баню и выдерживают до тех пор, пока мутность жидкое-

0 ;ти в 1, 2 и 3 пробирках будет меньше мутности жидкости в 7 пробирке и приблизится к мутности жидкости в 8 пробирке (обычно 8-15 мин,), т,е, до наступления значительных различий в ходе гемоли5за гомологичной и гетерологичной систем.

Этот момент определяется по специальр но поставленному контролю реакции. Затем иммунный гемолиз прерывают путе;. центрифугирования реагирующей смеси или путем

0 добавления ледяного (при ООС) 5%-ного раствора лимоннокислого натрия. Прерывание Иммунного гемолиза осаждением эритроцитов путем центрифугирования; дает лучщие результаты, так как при этом не про5исходит дополнительного разведения среды.

Все пробирки .центрифугируют При ЮОО в течение Ю мин, что вызывает осаждение нелизированных эритроцитов и прекращение их лизиса, надосадочную жидкость перели0вают в кюветы спектрофометра: в ячейку опыта-поочередно из 1, 2 и 3 пробирок, а в ячейку контроля - соответственно из 4, 5 и 6 пробирок. После записи результатов получают три кривых, характеризующих раз5личие количества гемоглобина между средами контроля и опыта. При использовании спектрофотометра Перкин Эльмер запись кривых ведут на волнах в диапазоне 39О- 420 нм, при использовании спектрофото0метров или фотоэлектрокалориметров других систем - НА волне 412 нм. По высо Т€ пиков спектрофотограммысз- дят о типовой и варчантиой принадлежности Hcc;ie- дуемого вируса, ящура, а также об актив- ности антигена. Пик, характеризующий реа цию в гомологичной системе, должен быть выше других пиков не менее, чем на 1,5 .см (Е О,15) (см. график 2 на фиг, 2). В данном случае пик 1 выше пиков 2 и 3 на S см (Е 0,8). Следовательно, 1испытуемый антиген относится к Ост, Подобным же образом исследуют и сыворотки крови переболевших ящуром живот :ных, в этом случае вместо рабочих разведений антисывороток 5ерут рабочие раз- ведения антигенов. В качестве примера ;на фиг, 3 показан результат реакции при исследовании сыворотки крупного рогатого скота, взятой после болезни ящуром, Вирус, вызвавший заболевание животного, отнесен к , так как пик, характеризующий реакцию с данным антигеном, на 11,2 см (Е 1,12) выше остальных пиков. Предложенный способ идентификещии штаммов вируса ящура с помощью реакции связывания комплемента позволяет быстро определг ь тип и вариант вируса ящура при высокой специфичности реакции. Результаты исследования могут быть получены через 30-4О мин после поступления антигена. Чувствительность реакции способа значительно выше чувствительности реакции, поставленной по известной методике, что достигается регистрацией реакции в процессе гемолиза эритроцитов (кинетическая реакция), при этом он является, экономичным, так как значительно уменьшен объем смесей компонентов реак. ции, количество рабочих разведений сыпороток и гемолитической снстемь: и антигена, необходимых для постаноркн реакции. Предложенный способ целосообра. использовать в практических ветеринарных лабораториях для быстрой идентификапин .эпизоотических штаммов вирусл ящура и определения соответствия эпизоотических штаммов вируса производственным, для исследования различных вируссодержащих субстратов и определения незначительных количеств ящурного антигена при проведр|нии различных научных исследований. Формула .изобретения Способ ндентификаиши штаммов вируса ящура, включающий соединение спе ;цифического комплекса антиген-антитело с комплементом с последующим добавлением к реакционной смеси гемолитической |сьстемы для проведения иммунного г-емо лиза, по результатам которого судят о типовой и вариантной принадлежности вируса, отличаюшийс я тем, что, с целью ускорения и повышения чувст вительности реакции, соединение специфи- . ческого ко шлекса антиген-антитело проводят в присутствии двойного количества комплемента в течение 5-10 мин, а после добавления к реагирующей смеси гемолитической системы результаты реакции учитывают по степениуменьшения мутности реагирующей смеси в процессе гемолиза, либр при последующем прерывании гемолиза, например, ;центрифутированием, по количеству гемоглобина в надосадочиой жидкости этой смеси. 20 22 2 Время, мин Фиа 1 26

§

(иг.2

л г

л -i .

Cte904

«

//2.J