Способ определения вирусов и антител к ним Советский патент 1993 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано при диагностических исследованиях для определения вирусов и антител к ним.

Целью изобретения является ускорение и упрощение способа, повышение его чувствительности и универсальности.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения вирусов и антител к ним в реакции нейтрализации, включающем смешивание вируса с сывороткой, внесение этой смеси в систему репродукции вируса, ее инкубацию и учет результатов реакции, в соответствии с изобретением инкубацию смеси вируса с сывороткой в системе репродукции вируса ведут в течение 15-20 мин при Зб-38°С, затем в нее добавляют флуоресцентный зонд и через 12-15 мин осуществляют учет результатов реакции по отношению интенсивности флуоресценции смеси в опыте и контроле и при значении ее показателя, равном 1,5 и выше, определяют наличие инфекционного агента, а при значении этого показателя менее 1,5, в случае образования специфического комплекса вирус-антитело определяют наличие антител к нему.

Обнаружение вирусов и вирусоспеци- фических антител проводится по феномену торможения адсорбции вируса антителами на клеточной мембране. При образовании комплекса вирус-антитело вирус теряет способность связываться со специфическими рецепторами клетки. В этом случае, состояние мембраны клеток не изменяется. А в случае, если остается свободный вирус, то он адсорбируется на клеточной мембране, что, соответственно, приведёт к изменению

ч

00 vj

ю XI кэ

со

состояния клеточной мембраны, которое можно определить с помощью флуоресцентного зонда.

Сущность изобретения поясняется примерами его исполнения, которые не ограничивают его объем.

П р и м е р 1, Определение типа вируса ящура. .......

К 0,3 ил разведения испытуемой пробы (вирус ящура) добавляют 0,3 мл соответствующего разведения ящурной диагностической сыворотки .Затем Г в 0,5 мл суспензии клеток ВНК-21 вносят 0,1 мл полученной смеси вирус-сыворотка и инкубируют 20 мин при 37°С, Затем, в нее добавляют флуоресцентный зонд ДСМ до конечной концентрации 1,0 мкМ и выдерживают 15 мин и после этого проводят учет результатов реакции. Подготовленные образцы флуори- метрируют с помощью микроскопа Л ЮМАМ . И-2 при длине волны возбуждающего света 405 нм и длине волны флуоресценции 515 нм. Среднюю интенсивность флуоресценции (F) клеток рассчитывают по формуле

ft .- П 1-1-; v где FJ -интенсивность флуоресценции 1-ой

клетки;

п - число клеток (не менее 20-30 в каж дом опыте).

Для удобства ввели константу флуоресценции (К) - постоянную величину, равную

отношению г- опыта . За положительную

контроля

константу взяли величину, равную или больше 1,5. В случае, если возбудитель не нейтрализован гомологичными антителами, то он адсорбируется на клеточных рецепторах, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции зонда по сравнению со свечением его на интактных клетках в 1,5 и более раз. При значении показателя интенсивности флуоресценции, равном 1,5 и выше, определяют наличие инфекционного агента. Наличие вируса ящура определяют в течение 40 мин. Вирус ящура относят к тому типу, какими антителами он нейтрализован.

П р и м е р 2. Определение антител к вирусу ящура.

К 0,3 мл соответствующих разведении вируса ящура типов А,0 и С добавляют по 0,3 мл соответствующих разведении используемой сыворотки крупного рогатого скота, перебрлевшего ящуром. Затем, в 0,5 мл суспензии клеток ВНК-21 вносят 0,1 мл полученной смеси вирус-сыворотка и инкубируют при 37°С - 15 мин. После этого, в смесь добавляют зонд ДСМ до конечной

концентрации 5 мкММ и выдерживают с зондом 15 мин. Подготовленные образцы флуориметрируют с помощью микроскопа Л ЮМАМ И-2 при длине волны возбуждаю- щего света 405 нм и длине волны флуоресценции 515 нм.Среднюю интенсивность флуоресценции (F) клеток рассчитывают по формуле:

10

1 ,,

где FJ - интенсивность флуоресценции 1-ой клетки;

п - число клеток (не менее 20-30 в каждом опыте).

Для удобства учета предложена константа флуоресценции (К) - постоянная величина, равная отношению с опыта .

«контроля

За положительную константу берут величину, равную или больше 1,5. Эта величи- на характерна для проб, содержащих

культуру клеток, вирус ящура, гетерологич- ные антитела к нему и зонд. В случае нейтрализации вируса ящура гомологичными антителами, этот показатель меньше 1,5. Определение антител к вирусу ящура осуществляют в течение 60 мин.

Эффективность способа подтверждена результатами экспериментов, сведения о которых представлены в таблицах 1-3. В таблице 1 приведены результаты определения активности сыворотки крови, отобранной от крупного рогатого скота, привитого вакциной из лапинизированного вируса ящура А22 с помощью флуоресцентного зонда на культуре клеток ВНК-21.

Результаты табл. 1 свидетельствуют о том, что существует прямая зависимость Между дозой вируса и титром антител, С уменьшением количества вируса, используемого для постановки реакции нейтрализации с помощью флуоресцентных зондов, увеличивается количество антител, т.е. титр антител.

Таким образом, показано, что показатель интенсивности флуоресценции, равный 1,5 и выше, свидетельствует о наличии вируса, а значение этого показателя меньше 1,5 в.пробах, содержащих вирус + антитело, свидетельствуете нейтрализации вируса гомологичными антителами. .

В табл. 2 приведены данные определения антител к вирусу ящура А22 в реакции нейтрализации с-флуоресцентным зондом на культуре клеток СП в гипериммунной сыворотке морских свинок, используемой для постановки РСК.

Данные табл. 2 подтверждают показатели, представленные в табл. 1 и подтверждают, что результаты предлагаемого способа не зависят от происхождения сыворотки и культуры клеток.

В табл. 3 приведены результаты опытов, свидетельствующих об универсальности предлагаемого способа. Предлагаемый способ испытан с положительными результатами на примере возбудителей 10 разных вирусных болезней. Эти вирусы относятся к 7 разным семействам. Предлагаемый способ пригоден для выявления вирусов и антител к ним независимо оттого, являются ли они РНК или ДНК-содержащими.

Использование предлагаемого способа определения вирусов и антител к ним обеспечивает по сравнению с реакцией нейтрализации следующие преимущества:

1) Универсальность

2) Значительное сокращение времени на исследования

3) Доступность, дешевизна

4} Повышение чувствительности

5) Значительное упрощение постановки опытом с имеющимися методиками

6) Повышение достоверности Исследования, особенно при исследовании вирусов, имеющих замедленный цикл репродукции

7) Возможность обнаружения вирусов, размножающихся без видимого ЦПД. Формула изобретения Способ определения вирусов и антител

к ним, включающий смешивание вируса с сывороткой, внесение этой смеси в систему репродукции вируса, инкубацию ее и учет результатов, о т л и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения и упрощения способа, инкубацию системы репродукции вируса проводят в течение 15-20 мин при 36-38°С, далее, в нее добавляют флуоресцентный зонд, экспонируют в течение 12-15 мин, определяют интенсивность флуоресценции, рассчитывают индекс флуоресценции и при значении его 1,5 и выше определяют наличие вируса, а при значении его менее 1,5 определяют наличие антител к вирусу.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано при диагностических исследованиях для определения вирусов или антител к ним. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа, повышение его чувствительности. Цель достигается тем, что получают смесь из равных объемов вируса и сыворотки, которую вносят в систему репродукции вируса и инкубируют 15-20 мин при 37°С. В смесь добавляют флуоресцентный зонд со временем экспозиции 12-15 мин. Учет результатов реакции ведут по отношению интенсивности флуоресценции смеси в опыте и контроле и при значении ее показателя, равном 1,5 и выше, определяют наличие инфекционного агента, а при значении этого показателя менее 1,5 в случае образования специфического комплекса вирус-антитело определяют наличие антител к нему. 4 табл. ел

Таблица1 Зависимость показателей активности сыворотки от дозы вируса ящера А22

Табл и ца2

Результаты шахматного титрования сывороток морских свинок к вирусу ящура предлагаемым способом на культуре клеток СП

Характеристика вирусов и антител к ним, используемых для испытания предлагаемогоспособа

Таблица 3