СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА "БИФАЦИД" Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 C12N1/20 C12R1/23 C12R1/01 

Изобретение относится к медицине, микробиологической и пищевой промышленности и может быть использовано для производства сухого препарата для нормализации микрофлоры кишечника у детей и взрослых, профилактики острых желудочно-кишечных заболеваний, для повышения иммунитета организма, а также в качестве добавки к питанию.

Преимущества сухих бактериальных препаратов по сравнению с кисломолочными продуктами заключается в более длительном сроке их хранения, удобстве транспортирования и применения.

Известен способ получения биопрепарата, содержащего живые клетки консорциума ацидофильных культур Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-6007 (АС-1) и сухого микробного полисахарида, привнесенного биомассой кефирных грибков, используемой в качестве защитной среды при сублимационной сушке биомассы консорциума.

В качестве накопительной питательной среды для наращивания биомассы консорциума L. acidophilus АС-1 используют обезжиренное молоко с содержанием сухих веществ 16-18 мас. и лимоннокислый натрий в количестве 0,6-0,8 мас. смесь стерилизуют при температуре 112^oC (0,5 ати) в течение 7-10 мин и охлаждают до 37^oC. Заквашивают закваской, приготовленной на консорциуме L. acidophilus АС-1, перемешивают, сквашивают в течение 5-6 ч до кислотности 60-80^oT, смешивают с прогретой биомассой кефирных грибков и сушат сублимационной сушкой (Ru, патент N 2001580, кл. C 23 C 9/12, C 12 N 1/20, опубл. 1993).

К недостаткам данного способа получения биопрепарата относится то, что предлагается только одна питательная среда для наращивания биомассы; используется один вид бактерий (представителей нормальной микрофлоры кишечника); не проводится корректировка pH перед сублимационной сушкой, что отрицательно сказывается на выживаемости бактерий.

Наиболее близким к предложенному по достигаемому техническому результату является способ получения биопрепарата "Бифацид", состоящего из живых клеток L.acidophilus АТ и Bifidobac adolescentis В-1, предназначенного для непосредственного употребления или в качестве добавки в питание для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, дисбактериоза кишечника.

Способ предусматривает приготовление питательной среды, стерилизацию среды, охлаждение до температуры термостатирования, заквашивание и сквашивание, смешивание полученных биомасс с защитной средой, розлив во флаконы или лотки и сублимационную сушку (ТУ 10-02-02-789-92 на биопрепарат "Бифацид". Госстандарт N 2862 от 10.02.92).

К недостаткам способа можно отнести то, что для наращивания биомасс исходных культур используют среды, традиционные для каждого из видов. Так, для выращивания бифидобактерий готовят кукурузно-лактозную среду, а для ацидофильных палочек стерильное обезжиренное молоко. Причем через установленные сроки производственно-ценные свойства штаммов требуют проверки. При получении биопрепарата применяют по одному штамму ацидофильных бактерий и бифидобактерий.

Предложенный способ получения сухого бактериального препарата заключается в том, что при получении биомассы бактерий из молочнокислых бактерий используют штаммы Lactobacillus acidophilus АТ-41, АТ-44, АГ-7, или сочетание одного или двух штаммов L.acidophilus с 1-2-мя дополнительными штаммами бифидобактерий видов Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum, обладающих аналогичными свойствами; для наращивания биомасс как ацидофильных палочек, так и бифидобактерий используют универсальную питательную среду, содержащую в равных количествах молочную сыворотку и гидролизованное молоко, натрий лимоннокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, сульфат марганца, α-цистин и воду дистиллированную, pH среды 7,1-7,3 или смесь обезжиренного молока с содержанием сухих веществ 14-16 мас. с 0,75 мас. лимоннокислого натрия для ацидофильных палочек и ту же смесь, но дополнительно содержащую 5 мас. гидролизованного молока для наращивания биомассы бифидобактерий.

Для наращивания биомассы бифидобактерий рекомендуется использовать обезжиренное молоко с добавлением 5 мас. гидролизованного молока, но в этом случае для проведения сублимационного замораживания потребуется введение защитной среды.

Наличие последней потребуется в случае наращивания биомассы обеих культур на универсальной питательной среде, содержащей в качестве основы смесь молочной сыворотки и гидролизованного молока.

Использование в качестве питательной среды стерильного обезжиренного молока с массовой долей сухих веществ 14-16% с лимоннокислым натрием и гидролизованным молоком позволяет улучшить качество и увеличить срок хранения получаемого биопрепарата за счет использования повышенного содержания белков молока в качестве защитного фактора для клеток бифидобактерий от воздействия температурных режимов сублимационной сушки.

Молочная сыворотка (подсырная или творожная, можно использовать сухую) является источником лактозы для развития ацидофильных бактерий.

Раздельное культивирование ведут при температуре (37±1)^oC до достижения кислотности 60-70^oT и жизнеспособных клеток в 1 см³ 10⁹-10¹³ каждой культуры, смешивают накопленную биомассу культурацидофильной палочки и бифидобактерий в соотношении 1:1, проводят коррекцию pH 5%-ным раствором аммиака до 6,0-6,4, охлаждают до температуры (5±3)^oC и лиофильно высушивают разлитый препарат. Хранят препарат в течение одного года при температуре 2-8^oC.

Применение предлагаемого способа позволяет получить препарат "Бифацид", обладающий комплексом свойств, присущих как ацидофильным бактериям, так и бифидобактериям.

Используемые для получения препарата специально подобранные штаммы обладают высокой антагонистической активностью, характеризующейся подавлением развития патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, что способствует восстановлению бифидобактерий и лактобактерий в кишечнике; штаммы обладают устойчивостью к фенолу, желчи, поваренной соли и антибиотикам, что характеризует их способность выживать и развиваться в кишечнике людей на фоне антибиотикотерапии.

Одновременное введение в препарат штаммов Lactobacillus и Bifidobacterium, вегетирующих в разных зонах кишечника, отличающихся антагонистической активностью и устойчивостью к антибиотикам позволяет усилить лечебную эффективность препарата. Штаммы Bifidobacterium выделены из фецес здорового ребенка, Lactobacillus из фецес здорового человека. Селекцию отобранных штаммов проводили по физиолого-биохимическим свойствам, обусловливающих их лечебно-профилактический эффект:
активности и энергии кислотообразования;
антагонистической активности по отношению к кишечным палочкам, шигеллам Зонне и Флекснера, коагулазоположительным стафилококкам, палочкам протея и др. гибель которых составляла 90-10% при совместном культивировании со штаммами в течение 72 ч;
устойчивости к антибиотикам, широко используемым в медицине (оксациллину, мономицину, канамицину, гентамицину, полимиксину, стрептомицину, левомицитину и нистатину);
устойчивости к 0,4-0,6% фенола в молоке;
устойчивости к 2-4% aC в молоке;
устойчивости к 20-30% желчи в молоке;
способности к росту при pH 8,3;
урожайности.

Устойчивость штаммов и препарата, получаемого на их основе, представлена в табл. 1.

Устойчивость к антибиотикам представлена в табл. 2.

Максимальные дозы антибиотиков в крови, при которых происходит рост штаммов и их комбинации в препарате "Бифацид"
Пример 1. 4 дм³ обезжиренного молока с массовой долей сухих веществ 16% и с 0,75% лимоннокислого натрия разливают по 400 см³ во флаконы или колбы, при этом в 5 флаконов дополнительно вносят 5% гидролизованного молока, стерилизуют при температуре 112^oC в течение 12 мин, охлаждают до температуры 38^oC. В 5 флаконов со стерильным обезжиренным молоком с массовой долей сухих веществ 16% и 0,75% лимоннокислого натрия вносят 1% чистой культуры ацидофильных бактерий L. acidophilus AT-41, а в 5 флаконов со стерильным обезжиренным молоком с массовой долей сухих веществ 16% 0,75% лимоннокислого натрия и 5% гидролизованного молока вносят 5% чистой культуры B.adolescentis B-1 и культивируют при температуре 37^oC; ацидофильную культуру выращивают в течение 8 ч, а бифидобактерии 14 ч до образования сгустка с кислотностью 65^oT. В стерильной емкости смешивают полученную биомассу ацидофильных бактерий и бифидобактерий в соотношении 1:1, тщательно перемешивают, корректируют pH 5%-ным раствором аммиака до 6,2 и охлаждают до температуры 5^oC. Полученную смесь тщательно перемешивают и разливают в стерильные флаконы или лотки, которые помещают в сублимационную установку. Замораживание проводят при -30^oC в течение 4 ч, сушку проводят в течение 18 ч при температуре досушивания препарата не выше 30^oC. Флаконы стерильно укупоривают, а массу, высушенную на лотках, расфасовывают в пакеты. Хранят готовый препарат при температуре не выше 6^oC в течение 12 месяцев. В дозе препарата должно быть не менее 10⁸ живых клеток ацидофильных бактерий и бифидобактерий.

Пример 2. 4 дм³ обезжиренного молока разливают в 10 флаконов или колб по 400 см³ в каждой, при этом в 5 флаконов дополнительно вносят 5% гидролизованного молока, стерилизуют при температуре 112^oC в течение 15 мин, охлаждают до 38^oC. В 5 флаконов со стерильным обезжиренным молоком вносят 1% чистой культуры ацидофильных палочек L. acidophilus AT-44, а в 5 флаконов со стерильным обезжиренным молоком и 5% гидролизованного молока вносят 5% чистой культуры бифидобактерий B. adolescentis B-1 и сквашивают при температуре 37^oC; ацидофильную культуру выращивают в течение 9 ч, а бифидобактерии 16 ч до образования сгустка с кислотностью 60^oT. В стерильной емкости смешивают полученную биомассу ацидофильных бактерий и бифидобактерий в соотношении 1: 1, тщательно перемешивают, корректируют pH 5%-ным раствором аммиака до pH 6,2 и охлаждают до температуры 8^oC. Затем полученный комплексный препарат смешивают в соотношении 6: 4 с защитной средой. В качестве защитной среды используют сахарозо-желатиновую среду. Полученную смесь тщательно перемешивают и разливают в стерильные флаконы или лотки, которые помещают в сублимационную установку. Замораживание проводят при -30^oC в течение 4 ч, сушку проводят в течение 20 ч при температуре досушивания препарата не более 30^oC. Флаконы стерильно укупоривают, а массу, высушенную на лотках, расфасовывают в пакеты. Хранят готовый препарат при температуре 6^oC. В дозе препарата должно быть не менее 10⁸ живых клеток ацидофильных бактерий и бифидобактерий.

Пример 3. В ферментеры вносят универсальную питательную среду, стерилизуют, охлаждают до температуры 40^oC. В один ферментер вносят 8% чистой культуры бифидобактерий (B.adolescentis B-1), в другой ферментер вносят 3% чистой культуры ацидофильных бактерий (L.acidophilus AT-41). Культивирование ведут при температуре 37^oC с периодической коррекцией pH до 5,8, после чего на бактофуге получают биомассу с содержанием 10⁹-10¹² живых клеток в 1 г или 1 см³. Полученную биомассу бифидобактерий и ацидофильных бактерий смешивают в соотношении 1:1, корректируют pH до 6,0, после чего смешивают с защитной средой (сахарозо-желатиновая), разливают во флаконы или на лотки и сушат методом сублимации. После сушки флаконы стерильно укупоривают; массу, высушенную на лотках, расфасовывают в пакеты. Хранят готовый препарат при температуре 6^oC. В дозе препарата должно быть не менее 10⁸ живых клеток ацидофильных бактерий и 10⁸ живых клеток бифидобактерий.

Пример 4. 4,8 дм³ обезжиренного молока с массовой долей сухих веществ 14% и с 0,75% лимоннокислого натрия разливают по 400 см³ во флаконы или колбы, при этом в 6 флаконов дополнительно вносят 5% гидролизованного молока, стерилизуют при температуре 112^oC в течение 10 мин, охлаждают до температуры 38^oC. Во флаконы со стерильным обезжиренным молоком с массовой долей сухих веществ 14% и с 0,75% лимоннокислого натрия вносят по 1% чистых культур ацидофильных палочек: в 2 флакона штамм L.acidophilus AT-41; в 2 флакона L. acidophilus AT-44; в 2 флакона - L.acidophilus АГ-7. Во флаконы со стерильным обезжиренным молоком с массовой долей сухих веществ 14% с 0,75% лимоннокислого натрия и 5% гидролизованного молока вносят по 5% чистых культур бифидобактерий: в 2 флакона штамм B.longum B-1; в 2 флакона штамм B. bifidum ВКБ-21; в 2 флакона штамм B. bifidum ГСБ-15. После чего культивирование ведут при температуре 37^oC; ацидофильные культуры выращивают в течение 9 ч, а бифидобактерии 16 ч. до образования сгустка с кислотностью 65^oT. В стерильной емкости смешивают полученную биомассу ацидофильных бактерий и бифидобактерий в соотношении 1:1, тщательно перемешивают, корректируют pH 5% -ным раствором аммиака до 6,0 и охлаждают до температуры 6^oC. Полученную смесь тщательно перемешивают и разливают в стерильные флаконы или на лотки, которые помещают в сублимационную установку. Замораживание проводят при -35^oC в течение 4 ч, сушку проводят в течение 18 ч при температуре досушивания препарата не выше 30^oC. Флаконы стерильно укупоривают, а массу, высушенную на лотках, расфасовывают в пакеты. Хранят готовый препарат при температуре 6^oC в течение 12 мес. В дозе препарата должно быть не менее 10⁸ живых клеток ацидофильных бактерий и бифидобактерий.

Пример 5. В ферментеры вносят универсальную питательную среду, стерилизуют, охлаждают до температуры 38^oC. В один ферментер вносят 3% штаммов L. acidophilus АТ-41; во второй ферментер 3% штамма L. acidophilus АТ-44; в третий ферментер вносят 5% чистой культуры B. adolescentis В-1, а в четвертый 5% B. longum ВГБ-21. Культивирование ведут при температуре 37^oC с периодической коррекцией pH до 5,6. После чего на бактофуге получают биомассу с содержанием 10¹⁰-10¹² живых клеток в 1 г или 1 см³. Полученную биомассу бифидобактерий и ацидофильных бактерий смешивают в равных количествах, корректируют pH до 6,0, затем смешивают с защитной средой (сахарозо-желатиновая), разливают во флаконы или на лотки и сушат методом сублимации. После сушки флаконы стерильно укупоривают; массу, высушенную на лотках, расфасовывают в пакеты. Хранят готовый препарат при температуре 6^oC. В дозе препарата должно быть не мене 10⁸ живых клеток ацидофильных бактерий и 10⁸ живых клеток бифидобактерий.

Биопрепарат "Бифацид" прошел клиническую апробацию в рамках "Программы государственных испытаний биопрепарата "Бифацид" на взрослых и детях", утвержденной заместителем председателя федеральной комиссии по МИБП и дез. средствам. Результаты апробации показали выраженный клинический и терапевтический эффект препарата, при использовании его для лечения желудочно-кишечных инфекций, коррекции микробиоценоза кишечника и др.

На основании положительных результатов клинической апробации биопрепарата "Бифацид" разработана инструкция по его применению в медицинской практике. Фармакопейным комитетом предложено разработать и утвердить фармакопейную сталью на биопрепарат "Бифацид" с целью широкого внедрения его в медицинскую практику.

Использование: биотехнологическая, медицинская промышленность и может быть использовано для лечения желудочно-кишечных инфекций. Сущность изобретения: для получения биопрепарата применяют ацидофильные бактерии и бифидобактерии. Причем можно получать биопрепарат как на основе одного штамма ацидофильных бактерий и одного штамма бифидобактерий, так и на основе сочетания двух или трех штаммов ацидофильных бактерий и бифидобактерий. Для получения биомассы бактерий в качестве исходного сырья используют смесь обезжиренного молока с массовой долей сухих веществ 14-16%, с 0,75% лимоннокислого натрия и 5% гидролизованного молока или универсальную среду на основе сыворотки и гидролизованного молока, термическую обработку которых ведут при 0,5 атм и температуре 112^oC в течение 10-15 мин, при этом биомассу компонентов препарата получают путем раздельного культивирования ацидофильных культур и бифидобактерий до достижения 10⁹-10¹² жизнеспособных клеток в 1 см³, затем смешивают их в соотношении 1:1, проводят коррекцию pH до (6,2±0,2) и охлаждают до температуры (6±3)^oC перед сублимационной сушкой препарата. 2 табл.

Способ получения бактериального препарата "Бифацид", предусматривающий приготовление питательной среды, термическую обработку ее, охлаждение до температуры инкубирования, внесение молочнокислых культур Lactobacillus acidophilus АТ и бифидобактерий Bifidobacterium В-1, раздельное культивирование с накоплением биомассы бактерий, смешивание их в равных количествах и сублимационное высушивание, отличающийся тем, что из молочнокислых бактерий используют штаммы Lactibacillus acidophilus АТ-41, АТ-44, АГ-7, или сочетание одного или двух штаммов Lactobacillus acidophilus с 1 2-я дополнительными штаммами бифидобактерий видов Bifidobacterium longum и Bifidobacterum bifidum, обладающих аналогичными свойствами, для накопления биомассы ацидофильных культур используют смесь обезжиренного молока с содержанием сухих веществ 14 16 мас. с 0,75 мас. лимоннокислого натрия, для накопления биомассы бифидобактерий используют смесь обезжиренного молока с содержанием сухих веществ 14 16 мас. с 0,75 мас. лимонокислого натрия и 5 мас. гидролизованного молока, или для накопления биомассы ацидофильных культур и бифидобактерий питательную среду, содержащую компоненты, г/л:
Натрий лимоннокислый 5,8 6,2
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 2,3 2,7
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,8 2,2
Сульфат магния 0,12 0,15
α - Цистин 0,12 0,2
а также, мл/л:
Сыворотка молочная 240 260
Молоко гидролизованное 240 260
Вода дистиллированная Остальное
pН смешанной биомассы устанавливают равным 6,0 6,4 и охлаждают ее перед сублимационным высушиванием до 2 8^oС.