АЛЛОТРАНСПЛАНТАТ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА ПРИ ПОВРЕЖДЕНИЯХ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ Российский патент 1999 года по МПК A61L27/00 

Изобретения относятся к биологии и медицине, а именно к транспланталогии.

В клинической практике известен целый ряд различных способов восстановления поврежденного кожного покрова с помощью культивированных in vitro эпидермальных клеток кожи. Однако широкому использованию трансплантатов из кератиноцитов препятствуют довольно существенные технологические недостатки: сложность культивирования кератиноцитов, необходимость использования дорогостоящих питательных сред, ростовых добавок и субстратов, значительное отдаление сроков лечения клеточным аутотрансплататом, ограничение в использовании первичных аллокератиноцитов вследствие невозможности их достаточной аттестации, а также большая зависимость результата трансплантации от степени подготовленности ожоговой раны.

Использование для восстановления кожного покрова альтернативного источника трансплантируемых клеток - фибробластов - дает ряд преимуществ. Поскольку фибробласты посредством синтеза компонентов экстрацеллюлярного матрикса стимулируют как адгезию кератиноцитов, так и пролиферацию их с последующей дифференцировкой, трансплантаты из культивированных фибробластов можно использовать в большом числе случаев, когда нет тотального поражения кожных покровов и возможна стимуляция пролиферации собственных эпидермоцитов в сохранившихся его очажках без пересадки эпидермальных пластов.

Известны технические решения, в которых поверхностно-зависимые культуры клеток, в частности клетки кожи, иммобилизуют на субстратах, сформированных из синтетических и природных полимеров, а также на основе проницаемых фильтров и перевязочного материала. Использование данных субстратов в качестве подложки для клеток кожи перспективно в плане облегчения процедуры переноса клеточного материала на раневую поверхность, а также позволяет избежать излишней травматизации клеток во время их ферментативного снятия.

Однако применение вышеуказанных материалов ограничивается либо их высокой стоимостью, что особенно касается биологических материалов, либо практической недоступностью, например, для вновь синтезируемых материалов, либо большими неудобствами контроля роста клеток и процесса заживления раны, что связано с использованием непрозрачных фильтров и перевязочного материала.

Наиболее близким к заявленному изобретению по технологическому исполнению и полученным результатам является аллотрансплантат аллофибробластов на мембране для восстановления кожного покрова обожженных. Согласно данному способу трансплантат аллофибробластов получают путем ферментации дермы обожженных, после чего клетки подвергают 5 - 7 кратному пассированию. Последнее субкультивирование проводят в чашках "Heraus", 3 - 5 суточный монослой доставляют в операционную и трансплантируют вместе с мембраной на кожные раны.

Несмотря на то, что данный способ зарекомендовал себя как достаточно эффективный при лечении обожженных с различной глубиной ожога, а также при лечении длительно незаживающих донорских ран, он имеет некоторые недостатки. Данный способ предполагает использование нестандартизованного клеточного материала, что может привести к непредсказуемым результатам и трудностям в отработке схемы лечения. Необходимость работы с первичной культурой, а также ее предварительная аттестация увеличивают как время подготовки клеточного материала до трансплантации, так и требуемые материальные затраты. Кроме того, выращивание фибробластов в чашках "Heraus" также ведет к удорожанию данного метода.

Техническими задачами изобретения являются создание аллотрансплантата на основе аттестованной культуры клеток фибробластов и дешевого и доступного сырья для подложки и разработка эффективного способа лечения повреждений кожи различной этиологии с использованием полученных аллотрансплантатов при одновременном снижении трудоемкости и материальных затрат.

Поставленные задачи решаются получением аллотрансплантата путем культивирования аттестованного диплоидного штамма фибробластов легкого эмбриона человека на подложке из целлофана и желатина и последующего перенесения полученного аллотрансплантата на ожоговые поверхности, длительно незаживающие кожные раны или другие кожные дефекты.

Сущность изобретения. Аллотрансплантат. Клетки диплоидного штамма фибробластов легкого человека Л-68 высевают в концентрации 80 - 100 • 10⁵ клеток/см² на целлофановую подложку.

Характеристика диплоидного штамма легкого эмбриона человека Л-68:
1. Наименование штамма - Л-68
2. Шифр коллекционный - ИМБ-141
3. Видовая принадлежность - Человек
4. Источник ткани - Легкое эмбриона человека 11 нед.

5. Тип роста, жизненный цикл - Фибробластоподобный, 40±10
6. Описание кариотипа - 2п = 46 (XX)
7. Наличие маркерных хромосом - Отсутствуют
8. Процент плоидности - Полиплодия - 22 клетки на 1000 метафаз
9. Структурные нарушения - 25 на 1000 клеток
10. Контроль видовой идентичности - Кариотип человека
11. Контаминация бактериями, грибами, вирусами, микоплазмами - Отсутствует
Получение аллотрансплатата. Для получения аллотрансплатата используют диплоидный штамм фибробластов легкого эмбриона человека Л-68 [15], посевной и рабочие банки которого были аттестованы ГИСКом для производства иммунобиологических препаратов [16].

Для культивирования ампулу с клетками Л-68 размораживают на водяной бане при температуре 37^oC, суспензию переносят в культуральный сосуд, инкубируют в питательной среде ИГЛА МЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37^oC и пассируют до получения необходимого объема клеток. Последнее субкультивирование проводят на целлофановой пленке, помещенной на дно чашек Петри.

Подложку для культивирования готовят следующим образом. Целлофановую пленку вырезают по размеру дна чашки, помещают в раствор детергента 7x на 2 ч, после чего промывают проточной и дистиллированной водой, высушивают, обезжиривают этиловым спиртом и автоклавируют при 1,1 атм в течение 20 мин. В стерильных условиях подложку переносят в чашку Петри и обрабатывают 1%-ым раствором желатина для лучшего прикрепления пленки ко дну чашки и равномерного распределения клеток. На приготовленную подложку высевают клеточную суспензию в концентрации 80-100 • 10⁵ клеток/см², добавляют ростовую среду до нужного объема, культивируют при температуре 37^oC в CO₂-инкубаторе в течение 1-5 суток, после чего чашки с подготовленными аллотрансплантатами передают в перевязочную.

Существенными признаками изобретения являются:
- использование при получении аллотрансплантата в качестве культуры клеток фибробластов легкого эмбриона человека Л-68, которые ранее для этой цели не применялись; клетки Л-68 заранее аттестованы и заложены на хранение в достаточном количестве ампул;
- подложка для культивирования представляет собой специальным образом обработанную целлофановую пленку.

Из литературных данных известно, что фетальные фибробласты более эффективны в отношении стимуляции эпидермоцитов, и в отличие от аналогичных клеток взрослого человека активно мигрируют в зоны механического повреждения клеточного слоя. Рядом авторов также показано, что фетальные фибробласты способствуют заживлению ран без образования рубцов, что обусловлено их метаболизмом. Однако, как показано в эксперименте, что обусловлено их метаболизмом. Однако, как показано в эксперименте, по сравнению с фетальными фибробластами кожи человека индекс пролиферации для культуры клеток Л-68 выше в 1,5-2,0 раза, что облегчает процесс масштабирования при культивировании.

Подготовленная указанным способом целлофановая пленка обладает хорошими адгезивными свойствами, а также влагопроницаема и нетоксична, что само по себе важно как для культивирования клеток, так и для ведения раны [19]. Кроме того, прозрачность пленки позволяет контролировать как рост клеток in vitro, так и состояние раны. Немаловажным фактором является дешевизна и доступность материала.

Подобные аллотрансплантаты впервые получены авторами, не известны из литературных источников, что позволяет говорить о соответствии технического решения критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ восстановления кожного покрова. С помощью пинцета подготовленный аллотрансплантат переносят на рану больного клетками вниз и покрывают асептической повязкой. На 2-5 сутки после пересадки под диском на ране появляется белая "пленочная", после чего подложка удаляется. На 5-8 сутки раны эпителизируются.

Существенным признаком изобретения является применение аллотрансплантата, содержащего клетки диплоидного штамма фибробластов легкого эмбриона человека Л-68, нанесенного на целлофановую подложку. Подложку с клетками наносят на рану клетками вниз. После эпителизации подложку удаляют.

Использование для восстановления кожного покрова аллотрансплантата на основе фетальных фибробластов легкого человека Л-68, культивируемых на целлофановой пленке в качестве подложки не известно из литературных источников, свидетельствует о соответствии заявляемого изобретения критерию "новизна" и "изобретательский уровень".

Ниже следуют примеры осуществления предлагаемого изобретения.

Пример 1. У больной Б. (история болезни N 1869), с диагнозом: ожог пламенем туловища и конечностей I - IIIа и IIIб - IV степени после химической некрэктомии выполнили аутодермопластику расщепленным кожным лоскутом, взятым с передней поверхности правого бедра. В послеоперационном периоде раны донорских участков нагнаивались, при консервативном лечении тенденции к заживлению не наблюдалось. 3.04.97 г. на раны донорских участков были пересажены аллотрансплантаты с клетками Л-68. На третьи сутки при удалении целлофановых дисков отмечалось очищение раны от гноя, на 7 сутки раны полностью эпителизировались.

Пример 2. Больному К. (история болезни N-1155) с диагнозом: отморожение пальцев и кистей II-III степени после очищения раны левой кисти, где шла вялая, медленная эпителизация, на раневую поверхность 28.01.97 г. перенесли аллотрансплантаты с клетками Л-68. На 3-и сутки наблюдали выраженную краевую эпителизацию, на 8-е сутки после трансплантации - полную эпителизацию.

Пример 3. Больной С., 20 лет (история болезни N-9091), поступил в отделение с диагнозом: флегмона передней поверхности правой голени. Выполнили операцию некрэктомии, в результате чего образовалась рана голени 18 х 10 см. Несмотря на комплексное лечение тенденции к заживлению раны не отмечали. После того как рана заполнилась нежными грануляциями, 31.12.96 г. провели операцию аутодермопластики расщепленным кожным лоскутом, который лизировался в послеоперационном периоде. 28.01.97 г. на образовавшуюся после лизиса раневую поверхность пересадили аллотрансплантат с клетками Л-68. На 2-ой день под дисками, особенно с краев раны, наблюдали выраженную краевую эпителизацию в виде белой каймы шириной 3-4 мм. На 8 сутки рана закрылась нежной белесоватой кожей. Гистологическое исследование подтвердило закрытие раны эпителием.

Пример 4. Больной И., 44 года (история болезни N-1671) с ожогами пламенем IIIа и IIIб степени была произведена трансплантация культивированных аллофибробластов (клетки Л-68 на целлофановых дисках). На участках с поражением IIIа на 12-ые сутки произошла уже полная эпителизация, на небольших участках 15-30 см² с поражением IIIб наблюдалось сокращение размеров ран в результате краевой эпителизации по сравнению с контрольными, для лечения которых не использовались культивированные клетки.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что используемые аллотрансплантат и способ восстановления кожного покрова оказываются эффективными при лечении кожных ран различной этиологии: ожоговых; донорских, образующихся после забора кожного лоскута при выполнении операции аутодермопластики; полученных в результате отморожения, флегмонозного воспаления. Трансплантируемые на подложке фибробласты стимулируют краевую и островковую эпителизацию собственных тканей, ускоряют процесс заживления кожного покрова. Более того, данные примеры свидетельствуют о том, что трансплантируемые эмбриональные фибробласты при инфецировании ран способствуют очищению раневой поверхности от гноя.

Клеточная культура Л-68 доступна в достаточном количестве, аттестована и хранится в замороженном состоянии. Основываясь на примерах успешного лечения повреждений кожи логично говорить о соответствии изобретений критерию "промышленная применимость".

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к транспланталогии. Аллотрансплантат представляет собой клетки диплоидного штамма фибробластов легкого эмбриона человека Л-68, нанесенного на целлофановую пленку. Пленку обрабатывают детергентом, обмывают, обезжиривают и наносят клетки фибробластов легкого эмбриона человека. Данный способ восстановления кожного покрова оказывается эффективным при лечении кожных ран различной этиологии: ожоговых, донорских, образующихся после забора кожного лоскута при выполнении операции аутодермопластики, полученных в результате отморожения, флегмонозного воспаления. Трансплантируемые на подложке фибробласты стимулируют краевую и островковую эпителизацию собственных тканей, ускоряют процесс заживления кожного покрова и при инфицировании ран способствуют очищению раневой поверхности от гноя. 3 с.п.ф-лы.

1. Аллотрансплантат для восстановления кожного покрова, содержащий полимерную подложку с нанесенными на нее клетками человека, отличающийся тем, что полимерная подложка выполнена из целлофана, а в качестве клеток человека используют аттестованные клетки диплоидного штамма фибробластов легкого эмбриона человека Л-68 в концентрации 80 - 100 • 10⁶ клеток/см² на подложку. 2. Способ получения аллотрансплантата для восстановления кожного покрова, отличающийся тем, что он включает обработку целлофановой подложки детергентом, промывку ее дистиллированной водой, сушку, обезжиривание этиловым спиртом, покрытие 1%-ным желатином, нанесение аттестованных клеток диплоидного штамма легкого эмбриона человека Л-68 в концентрации 80 - 100 • 10⁵ клеток/см² подложки, предварительно выращенных в суспензии, которая культивируется в течение 1 - 5 суток в среде для роста при 37^oC и СО₂-инкубаторе. 3. Способ восстановления кожного покрова при повреждениях различной этиологии путем нанесения аллотрансплантата на полимерной подложке клетками вниз на рану, отличающийся тем, что аллотрансплантат, полученный по п.2, покрывают асептической повязкой, удаляют после появления эпителизации.