СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА У ТЯЖЕЛООБОЖЖЕННЫХ Российский патент 1994 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к хирургии термической травмы, и может быть использовано при лечении обширных глубоких ожогов.

Известны способы восстановления кожного покрова у тяжелообожженных. Одним из них является способ восстановления кожного покрова, включающий нанесение на раневую поверхность культуры кератиноцитов в виде суспензии клеток (Khalfan H. , Aziz Hamza A. , Saeed T. et al. Novel method of skin substitution in plastic surgery. // Burns-1989. v. 15, n. 5-p. 335-337). Известен также способ восстановления кожного покрова, заключающийся в трансплантации многослойного клеточного пласта аутологичных кератиноцитов на рану (Gallico G. G. , O'Connor N. E. , Compton C. C. et al. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium. // N. Engl. J. Med. -1984- v. 311, n8-p488-451). Кроме этого, известен способ восстановления кожного покрова посредством сложного комплекса, состоящего из синтетической подложки из коллагена, на которой находится пласт аутологичных кератиноцитов (патент США N 88/08303, кл. А 61 К 37/00). Общими недостатками указанных способов являются высокая сложность и трудоемкость технологии, сравнительно низкая эффективность им высокая стоимость.

Наиболее близким к заявленному по технической сущности является способ восстановления кожного покрова у тяжелообожженных посредством трансплантации культуры аутологичных кератиноцитов в виде суспензии клеток (Khalfan H. , Aziz Hamza A. , Saeed T. et al. Novel method of skin substitution in plastic surgery. Burns - 1989. - v. 15, n. 5-p 335-337). Согласно этому способу, кератиноциты из биоптата кожи обожженного получают посредством обработки последней коллагеназой, после чего осуществляют культивирование клеток на подложке во флаконах с плоским дном. После достижения конфлюентности культуры клеток (примерно на 7-e сутки), осуществляют пересев клеток, для чего клеточный пласт обрабатывают смесью трипсина и ЭДТА и пересевают в новые флаконы в виде суспензии, и далее выращивают вторичную культуру кератиноцитов. На 14-е сутки, после достижения конфлюентности пассируемой культуры клеток, последняя подвергается воздействию раствора трипсина, что приводит к образованию суспензии из единичных клеток - кератиноцитов, которые собирают центрифугированием при 600 об/мин в течение 10 мин и ресуспендируют в стерильной пробирке в бессывороточной среде, далее выдерживают в термостате при 37,0^оС с содержанием в атмосфере 5% СО₂ в течение 20 мин. После этого культура клеток готова к трансплантации. Суспензию клеток распределяют по поверхности ран. Сверху раны покрывают стерильным неадгезивным покрытием.

Недостатками указанного способа являются сравнительно низкая эффективность, высокая сложность технологии и стоимости лечения. Это обусловлено, в частности, необходимостью выращивания кератиноцитов в культуральных флаконах с плоским дном, при этом площадь формирующегося клеточного пласта определяется размерами используемой посуды. Для увеличения количества клеток необходимо осуществить пересев, что достигается обработкой клеточного пласта раствором трипсина и ЭДТА с последующим ресуспендированием и центрифугированием, в результате чего клетки повреждаются, жизнеспособность их снижается. В целом процедура выращивания и подготовки клеточной культуры к пластике ран многоэтапна и сложна, требует наличия специального оборудования, больших количеств дорогостоящих импортных реактивов, сред, сывороток и посуды, в силу этого не может использоваться широко. Кроме того, выделение и выращивание эпидермальных кератиноцитов занимает, как минимум, 10-14 суток, что ограничивает использование метода для закрытия ран после некрэктомии. Сложным является распределение взвеси кератиноцитов по поверхности ран и контроль равномерности ее распределения, т. к. клетки не видны невооруженному глазу. Метод требует идеального состояния раны перед трансплантацией, в связи с чем необходима постоянная связь между группами, осуществляющими культивирование и готовящими раны к пластине, что в определенной степени ограничивает возможности (временные) по пластическому закрытию ран.

Целью изобретения является упрощение технологии, повышение эффективности и снижение стоимости лечения.

Поставленная цель достигается тем, что кератиноциты высевают на коллагеновые микроносители и культивируют в роллерных бутылях или иных биотехнических системах в течение 1-7 суток, после чего суспензию микроносителей с прикрепленными к ним клетками наносят на рану и покрывают неадгезивной антисептической повязкой на 6-7 дней, после чего проводят лечение с традиционно используемыми препаратами для местного лечения. Для восстановления кожного покрова могут использоваться аутологичные кератиноциты, а также аллогенные клетки (для лечения глубоких дермальных ожогов III степени) и микст-культуры.

Использование для культивирования кератиноцитов микроносителей из коллагена, выполняющих роль подложки и находящихся во вращающихся роллерных бутылях или иных биотехнических системах, а также нанесение на рану взвеси микроносителей с прикрепленными к ним кератиноцитами свидетельствует о соответствии заявляемого решения критерию "новизна".

Использование иной техники подготовки клеток кожи к трансплантации и нанесение на рану комплекса, состоящего из микроносителя с прикрепленными к нему кератиноцитами, а также исключение процедуры обработки клеток ферментами и ЭДТА с последующим их центрифугированием и ресуспендированием позволяет ускорить процесс подготовки клеток к трансплантации и облегчить технологию. Использование совокупности настоящих признаков в их функциональном единстве для достижения поставленной задачи свидетельствует о соответствии решения критерию "существенные отличия".

Использование данных признаков предложения позволяет получить новый положительный эффект - упростить технологию подготовки кератиноцитов к трансплантации и ее осуществления, а именно отказаться от культивирования клеток на подложке, которой является дно культуральных флаконов, избежать необходимости производить через каждые 7-10 дней культивирования (по мере достижения конфлюентности культуры), пересев клеток в новые культуральные флаконы, исключить необходимость обрабатывать клетки растворами ферментов и ЭДТА с последующим центрифугированием и ресуспендированием, несколько упростить процедуpу переноса клеток на раневую поверхность, т. к. взвесь микроносителей видна невооруженному глазу и отсутствует необходимость в концентрации клеток перед их трансплантацией. Использование технологии культивирования в роллерных вращающихся бутылях или иных биотехнических системах на микроносителях из коллагена позволяет полностью отказаться от использования дорогостоящей импортной посуды, а также снизить расход культуральных сред, сывороток и ростовых добавок. За счет исключения необходимости осуществлять пересев клеток, для чего в способе - прототипе клеточную культуру обрабатывают растворами трипсина и ЭДТА с последующим центрифугированием, предотвращается возможность повреждения клеток и нарушения их жизнеспособности, а также достигается сокращение сроков подготовки культуры к трансплантации, т. е. повышается эффективность лечения.

Следовательно, заявленное техническое решение соответствует критерию изобретения "положительный эффект".

П р и м е р. 1. Способ апробирован и реализован при выполнении пластики гранулирующих ран у крысы посредством пересадки культуры аутологичных кератиноцитов на микроносителях. Протокол опыта N 154, крыса N 1, самец.

15.06.1990 г. на спине у крысы Вистар массой 150 г под анестезией гексеналом вырезан кусочек кожи с подкожно-жировой клетчаткой до фасции площадью 2 см². В края раны для предотвращения ретракции краев раны вшито ригидное кольцо из тефлона. В течение трех суток лечение ран осуществляли посредством ежедневных перевязок с растворами антисептиков (хлоpгексидина и 4% борной кислоты). В течение этого же времени осуществляли культивирование кератиноцитов, выделенных из удаленного кусочка кожи в роллерных бутылях в среде DMEM и F12 (в соотношении 1: 1) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой и эпидермальным фактором роста (10 нг/мл), а также с буфером HEPES 20 мМ. При осмотре раны 18.06.90 г отмечено наличие тонкого слоя розовых мелкозернистых грануляцией, выраженный отпечаток "сетки" на ране, отсутствие воспалительных явлений и высокая адгезивность раны.

Суспензия микроносителей с прикрепленным к ним кератиноцитами осаждена и нанесена на поверхность раны. Рану накрыли парафинизированной повязкой "Paranett". Первую перевязку осуществляли через 7 дней. После удаления всех слоев повязок на дне раны имеется тонкий нежный вновь образовавшийся эпителий. Взят биоптат неокожи на гистологическое исследование. При изучении морфологической структуры восстановленного кожного покрова выявлено наличие нескольких слоев кератиноцитов, клетки различной формы, рогового слоя нет, межклеточные связи выражены слабо.

Оставшаяся часть микроносителей с кератиноцитами трансплантировали на дремальный эквивалент (коллагеновый гель с фибробластами). На следующий день при исследовании в фазовом контрасте обнаружено, что кератиноциты мигрируют с поверхности микроносителя и распространяются на гелевую подложку. Таким же образом происходит миграция кератиноцитов с микроносителей и на гранулирующую рану.

П р и м е р 2. Больной С-в Н. Ф, , 1958 г. р. , история болезни N 32588 находился на лечении в клинике термических поражений ВМедА им. С. М. Кирова с 9. IV. 1991 г по 25. IV. 1991 г. по поводу: Ожог горячей водой 20% (0,2% ) п-IIIб. ст. туловища, верхних конечностей. Травму получил в быту - при купании под душем внезапно пошла горячая вода. За медицинской помощью обратился спустя 18 ч. Произведена катетеризация левой подключичной вены, начата инфузионная терапия по схеме ожогового шока I степени тяжести. Больной помещен на кровать "Клинитрон". С левого плеча под местной инфильтрационной анестезией скальпелем срезан полнослойный кожный трансплантат площадью 1 см², который помещен во флакон с культуральной средой DMEM c антибиотиками. Выделение и культивирование кератиноцитов начато 10. IV. 1991 г. Посредством обработки кожи коллагеназой выделены кератиноциты, часть из которых (большая) пpедназначена для выращивания клеточных пластов на подложке во флаконах, а другая - внесена в роллерную бутыль с культуральной средой следующего состава: DMEMи F 12 (1: 1) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, с добавлением 10 нг/мл эпидермального фактора роста и 5 мкг/мл инсулина в присутствии HEPES 20 мМ. В культуральную среду добавлена взвесь микроносителей, сделанных из коллагена, имеющих сферическую форму и размеры от 60 до 200 мкм. Культивирование осуществляли при температуре 37,0^оС при вращении бутыли со скоростью 1,8 об/мин в течение 5 сут. 15.04.91 г. культивирование прекращено, взвесь из микроносителей с прикрепленными к ним кератиноцитами осаждена на дно бутыли, которая доставлена в ВМедА.

16.04.91 под общей анестезией произведено иссечение ожогового струпа в пределах жизнеспособных тканей до уровня подкожно-жировой клетчатки на участки в области большой грудной мышцы, где имелись несомненные признаки глубокого поражения на площади 20 см². После тщательно выполненного гемостаза микроносители перенесены на рану и закрыты парафинизированной повязкой "Paranett". Сверху наложены асептические повязки. Первая перевязка - на 6-е стуки, когда удалены марлевые повязки до последнего слоя (кроме "Paranett"). В ячейках последней виден молодой, нежный, неокрепший эпидермис. Через сутки удалена повязка "Paranett". Участки кожи, восстановленные посредством трансплантации кератиноцитов на микроносителе по своему внешнему виду не отличались от таковых, восстановленных посредством трансплантации расщепленных кожных трансплантатов. В последующем перевязки проводили с использованием мази левосин.

После отторжения тонкого струпа на остальных участках тела выяснилось, что поражение - на уровне дермы, и под воздействием местного консервативного лечения произошла эпителизация ожоговых ран. В связи с этим трансплантация клеточного пласта клеток не проводилась.

Таким образом, трансплантация культуры кератиноцитов была выполнена спустя 8 суток после получения травмы или спустя 5,5 суток после начала культивирования. Кератиноциты прижили после пересадки на свежеиссеченную до подкожно-жировой клетчатки рану. За это время клетки, выращиваемые посредством традиционной техники, успели только сформировать конфлюентную культуру.

Больной выписан из клиники 25.04.1991 г, в удовлетворительном состоянии с восстановленным кожным покровом.

Помимо приведенного клинического примера кожный покров посредством трансплантации аутологичных кератиноцитов восстановлен на ограниченной по площади ране у 2-х больных. Кроме того, двум больным осуществили трансплантацию культуры на микроносителях аллогенных кератиноцитов.

Ожидаемый эффект от внедрения в практику лечения предлагаемого способа восстановления кожного покрова представляется весьма значительным и связан с сокращением сроков лечения пострадавших, получением возможности лечения критических и сверхкритических ожогов, а также уменьшением расходов медикаментозных препаратов на лечение. (56) Burns, 1989, N 15, п. 5, с. 335-337.

Использование: в медицине для лечения обширных ожогов с использованием культур кератиноцитов для восстановления кожного покрова. Сущность изобретения. Культуру кератиноцитов высевают на коллагеновые микроносители, культивируют в роллерных бутылях или прочих биотехнических системах в течение 1 - 7 сут, после чего суспензию микроносителей с прикрепленными к ним кератиноцитами наносят на раневую поверхность и покрывают неадгезивным асептическим покрытием на 6 - 7 сут.

СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА У ТЯЖЕЛООБОЖЖЕННЫХ , включающий выделение и культивиpование кеpатиноцитов с последующей их тpансплантацией на pаны, отличающийся тем, что кеpатиноциты культивиpуют на коллагеновых микpоносителях в течение 1 - 7 дней, после чего суспензию микpоносителей с пpикpепленными к ним кеpатиноцитами наносят на pаневую повеpхность.