ШТАММ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2006 года по МПК C12N5/08 

Изобретение касается создания новых аттестованных штаммов диплоидных клеток человека для заместительной терапии, относится к биологии, косметологии, ветеринарии, медицине и может быть использовано при корреляции патологических процессов в организме путем трансплантации выращенных in vitro диплоидных клеток человека.

Диплоидные клетки широко используются в биологии и медицине. Штамм диплоидных клеток характеризуется морфологически однородной популяцией клеток, стабилизированной в процессе культивирования; ограниченным сроком жизни; сохраняет в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани; свободен от контаминантов и не обладает онкогенными потенциями. В литературе описаны методы получения и аттестации диплоидных клеток. Получено большое количество диплоидных штаммов из тканей и органов человека и животных. Вместе с тем лишь немногие из них удовлетворяют требованиям Международного Комитета по клеточным культурам и разрешены для использования в качестве субстрата производства медицинских иммунобиологических препаратов.

Известны штаммы диплоидных клеток легкого эмбриона человека WI-38 и MRC-5, полученные в США (Hayflisc L., Moorchead P. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. - Symp.International Sosiety Cell, 1961, 3. p.155-173). Штаммы используются для научных исследований и в производстве вирусных вакцин. Эти штаммы являются дорогостоящими, приобретение их связано с рядом трудностей, основные из которых обусловлены затратами на транспортировку и таможенные расходы. Применение их ограничено, так как срок жизни диплоидных клеток составляет 45-50 генераций. Кроме того, отсутствуют данные о применении диплоидных клеток WI-38 и MRC-5 в заместительной терапии.

Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом, является штамм диплоидных клеток легкого эмбриона человека ЛЭЧ-4(81), используемый для диагностики вирусных инфекций (Авторское свидетельство СССР №1147748, МПК С 12 N 7/00, опубл. 30.03.1985 г.). Согласно данному изобретению штамм получен из ткани легкого 12-недельного эмбриона человека путем дробной щадящей трипсинизации кусочков ткани в 0,25%-ном растворе трипсина. Диплоидный штамм накоплен в результате пассирования и заложен на хранение в количестве 150 ампул в период от 4 до 11-го пассажа. Известно применение указанного штамма диплоидных клеток ЛЭЧ-4(81) в качестве клеточной культуры для заместительной терапии (Патент РФ №2213775, МПК С 12 N 5/08, опубл. 10.10.2003 г.).

Однако известно, что культура диплоидных клеток имеет ограниченный срок жизни, который составляет не более 45-50 генераций. Таким образом, за более 20-летний "срок жизни" данного штамма диплоидных клеток ЛЭЧ-4(81), вначале используемого для диагностики вирусных инфекций, а сейчас - для заместительной терапии (примерно с 1982 по 2004 г.г.), ресурс его в настоящее время очень ограничен.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание новых аттестованных штаммов диплоидных клеток человека для заместительной терапии, обеспечивающих расширение ресурсов диплоидных клеток для заместительной терапии.

Указанный технический результат достигается созданием двух вариантов штаммов диплоидных клеток:

- штамм диплоидных клеток человека из ткани легкого эмбриона для заместительной терапии (авторское название ФЭЧ 16-1);

- штамм диплоидных клеток человека из кожно-мышечной ткани эмбриона для заместительной терапии (ФЭЧ 16-2).

Указанные варианты штаммов обладают одинаковым терапевтическим эффектом при использовании в заместительной терапии.

Штамм диплоидных клеток человека из ткани легкого эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-1 зарегистрирован во НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под номером НИИМБ-265.

Штамм диплоидных клеток человека из кожно-мышечной ткани эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-2 зарегистрирован во НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под номером НИИМБ-266.

В результате поиска по источникам патентной и научно-технической информации не выявлено сведений о новых аттестованных штаммах диплоидных клеток кожно-мышечной ткани и ткани легкого эмбриона человека, аналогичных заявляемым.

Заявляемые штаммы диплоидных клеток получают из ткани легкого и кожно-мышечной ткани 8-10 недельных эмбрионов, абортированных у женщин, которые не имеют онкологических, венерических, генетических заболеваний и врожденных аномалий. Сыворотку крови женщины предварительно исследуют на отсутствие вируса иммунодефицита человека, цитомегаловируса, гонореи, хламидий, уреаплазмы, микоплазмы, вируса клещевого энцефалита, сифилиса, гепатита, туберкулеза, герпеса, токсоплазмоза и острых стрепто- и стафилококковых инфекций с помощью методов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции.

Ткань легкого или кожно-мышечную ткань с соблюдением правил асептики механически очищают от жира, мелких кровеносных сосудов, промывают в растворе Хенкса с добавлением антибиотиков, измельчают и помещают в раствор 0,125%-ного трипсина при температуре 4°С на 10-12 час, затем фильтруют и центрифугируют, осадок ресуспендируют в питательной среде Игла MEM. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток. Суспензию клеток разводят до концентрации 2×10⁵ клеток в 1 мл питательной средой Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы и переносят во флаконы для культивирования. Клетки культивируют при температуре 37°С, через сутки после посева проводят смену среды. После образования монослоя клетки снимают со стекла смесью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в соотношении 2:1, ресуспендируют в питательной среде и рассевают 1:2. Дальнейшее субкультивирование проводят на 3-4 сутки с коэффициентом разведения суспензии 1:2 в фазе активного роста. После стабилизации культуральных свойств через 4-5 последовательных пассажей проводят испытание на стерильность и на отсутствие микоплазм экспресс-методом окраски клеток ДНК-интеркалирующими флюорохромами. При отсутствии контаминации культуру клеток накапливают в результате пассирования и на 6-ом пассаже замораживают.

Суспензию первичной культуры клеток или культуральную жидкость исследуют на микробиологическую стерильность, отсутствие микоплазм и вирусов. Микробиологическую стерильность определяют методом посева на селективную питательную среду. Выявление микоплазм проводят методом посева на питательную среду для выявления микоплазм и методом полимеразной цепной реакции. Отсутствие микобактерий туберкулеза подтверждается высевом на среду Левенштейна-Иенсена и иммуноферментным методом. Отсутствие сифилиса исследуют иммуноферментным методом. Контроль на наличие хламидий проводят иммуноферментным методом и методом полимеразной цепной реакции. Отсутствие токсоплазмоза определяют иммуноферментным методом. Контроль на отсутствие вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ-1 и ВИЧ-2), гепатита, краснухи, герпеса, цитомегалии проводят иммуноферментным методом и методом полимеразной цепной реакции. Онкогенные потенции первичной культуры клеток исследуют с помощью метода гетеротрансплантации клеток иммуносупрессивным животным. Контроль на наличие ретровирусов проводят методом определения активности обратной транскриптазы.

После проведения контролей и наработки достаточного количества клетки ампулируют и криоконсервируют. Для этого клетки снимают со стекла смесью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в соотношении 2:1, центрифугируют и ресуспендируют в среде для консервации, состоящей из 70% питательной среде Игла MEM, 20% сыворотки крови плодов коровы и 10% глицерина. Проводят подсчет жизнеспособных клеток. Суспензию клеток разводят средой для консервации до концентрации 1,0×10⁶ в 1 мл, разливают в стерильные ампулы по 1 мл. Ампулы герметизируют, маркируют, криоконсервируют и хранят в жидком азоте при температуре минус 196°С.

Для восстановления диплоидных клеток после криоконсервации ампулу с замороженной суспензией оттаивают, вскрывают, суспензию клеток переносят в культуральные флаконы, добавляют питательную среду Игла MEM, клетки ресуспендируют. Проводят подсчет жизнеспособных клеток. Жизнеспособность культуры после размораживания составляет 90-92%. Суспензию клеток разводят питательной средой Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы до концентрации 2,0×10⁵ клеток в 1 мл и помещают в культуральный флакон. Клетки культивируют при температуре 37°С.

Аттестацию диплоидных штаммов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 проводят согласно требованиям, предъявляемым к клеточным линиям-субстратам производства медицинских иммунобиологических препаратов. В процессе работы исследуют морфологические признаки, культуральные свойства, кариологию, видовую идентичность, отсутствие посторонних агентов, онкогенные потенции.

Штаммы характеризуются следующими признаками:

1. Морфологические признаки.

Культура клеток представлена фибробластоподобными клетками с четко выраженной поточностью. Цитоплазма с характерной мелкой зернистостью, ядро содержит 1-4 ядрышка. Клетки прозрачны, расположены параллельными группами, ориентированными в различных направлениях. Рисунок культуры определяется контактной ингибицией роста - свойством, характерным для нормальных клеток, и не меняется в течение всего периода активной пролиферации.

2. Культуральные признаки.

Штаммы диплоидных клеток поддерживают на питательной среде Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы. Клетки субстрат-зависимы. Репассирование клеток осуществляют с помощью смеси 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в соотношении 2:1. Кратность рассева 1:2 или 1:3, посевная доза составляет (1-3)×10⁵ клеток в 1 мл. Формирование клеточного монослоя завершается через 3-4 суток после пересева.

3. Кариологическая характеристика.

Кариологический анализ проводят на уровне 15-го и 30-го пассажа. Распределение числа хромосом определяют подсчетом числа хромосом в 100 метафазных пластинках. Кариологическая характеристика диплоидных клеток представлена в таблице. Кариотип диплоидных клеток легкого и кожно-мышечной ткани эмбриона человека стабилен, соответствует нормальному кариотипу человека, 2n=46, XX. Клетки имеют диплоидный набор хромосом. Основной набор состоит из хромосом с 1-й по 23-ю пару. Маркерные хромосомы не обнаружены. Модальный класс четко выражен и представлен в основном клетками с 46 хромосомами.

4. Контроль видовой идентичности.

Видовую идентичность оценивают методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле для определения изоферментов. Показано, что клетки имеют глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу медленного В типа, лактатдегидрогеназа представлена пятью изоформами, характерными для клеток человека.

5. Контроль контаминации.

Диплоидные клетки исследуют на стерильность, отсутствие микоплазм и вирусов. Испытание на стерильность проводят методом прямого посева культуральной жидкости на тиогликолевую среду. Показано, что штаммы диплоидных клеток свободны от бактерий и грибов.

На фиг.1 представлены данные по выявлению микоплазм методом полимеразной цепной реакции, где:

(а - первый раунд; в - второй раунд).

1 - отрицательный контроль (буфер ТЕ); 2 - ФЭЧ 16-1; 3 - ФЭЧ 16-1 (повтор);

4 - ФЭЧ 16-2; 5 - ФЭЧ 16-2 (повтор); 6 - положительный контроль (ДНК микоплазмы);

7 - маркер молекулярного веса.

Отсутствие микоплазм подтверждено микробиологическим посевом суспензии диплоидных клеток на питательные среды для выявления микоплазм, люминесцентной микроскопией в сочетании с окраской 0,0005%-ным раствором Hoechst-33258 и полимеразной цепной реакцией.

Впервые при аттестации штаммов диплоидных клеток эмбриона человека использовали современный, высокочувствительный, информативный метод полимеразной цепной реакции. Данный метод позволяет выявить наиболее распространенные и изученные виды микоплазм, такие как Acholeplasma laidlawii, M.alkalescens, M.arginini, M.arthritidis, M.bovis, M.buccale, M.canis, M.fermentans, M.gallisepticum, M.hominis, M.hyorhinis, M.orale, M.pulmonis, M.salivarium.

Контроль на отсутствие посторонних вирусов проводят на взрослых и сосунках белых мышей, морских свинках, кроликах, куриных эмбрионах, а также на перевиваемой культуре клеток Vero и диплоидной линии клеток легкого эмбриона человека Л-68 в соответствии с требованиями ВОЗ. Введение животным внутримышечно суспензии диплоидных клеток показало, что ни одно из взятых в эксперимент животных (мыши-сосунки, мыши, морские свинки и кролики) не погибло. При введении суспензии клеток в аллантоисную полость, в желточный мешок и на хорионаллантоисную оболочку куриных эмбрионов все эмбрионы оставались живыми, при этом ни в одной пробе аллантоисной жидкости не были выявлены гемагглютинирующие и гемадсорбирующие агенты. Контроль, проведенный в клеточных культурах, не выявил цитопатогенных, гемагглютирирующих и гемадсорбирующих вирусов в диплоидных клетках ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2.

6. Контроль онкогенных потенций.

Онкогенные потенции исследовали с помощью метода гетеротрансплантации диплоидных клеток иммуносупрессивным животным. Показано, что при инокуляции животных диплоидными клетками ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 патологических изменений в месте введения клеток, в лимфатических узлах, легких, почках и печени, не наблюдалось.

Метод определения активности обратной транскриптазы был использован для выявления в диплоидных клетках онковирусов. Результаты представлены на фиг.2. В диплоидных клетках обратно-транскриптазная активность отсутствует, эндогенные онковирусы не обнаружены, диплоидные клетки ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 канцерогенной активностью не обладают.

На фиг.2 представлена активность обратной транскриптазы, где: отрицательный контроль - полимеразный буфер; 1 - ФЭЧ 16-1; 2 - ФЭЧ 16-1 (повтор); 3 - ФЭЧ 16-2; 4 - ФЭЧ 16-2 (повтор); положительный контроль - проба, содержащая 50 нг рекомбинантной обратной транскриптазы ВИЧ-1.

Штаммы диплоидных клеток легкого человека ФЭЧ 16-1 и кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2 имеют высокую пролиферативную активность; типичную морфологию; кариотип и энзимограмму, характерную для клеток донора; не содержат посторонних агентов; являются онкогенно безопасными; сохраняют стабильность биологических свойств в течение культивирования. Штаммы депонированы в коллекции клеточных культур ГНЦ ВБ "Вектор". Посевные и рабочие банки диплоидных клеток легкого эмбриона человека и кожно-мышечной ткани эмбриона человека рекомендованы ГИСК им. Л.А.Тарасовича для использования в заместительной терапии.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение штаммов диплоидных клеток легкого эмбриона (ФЭЧ-1) и кожно-мышечной ткани человека (ФЭЧ 16-2).

Фетальные ткани получают из гинекологических отделений, помещают в раствор Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 500 ед/мл) и доставляют в лабораторию. С соблюдением правил асептики кусочки ткани тщательно отмывают от эритроцитов в растворе Хенкса или в питательной среде Игла MEM, измельчают и помещают в 0,125%-ный раствор трипсина при температуре 4°С. Через 10 час ткань ресуспендируют, фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в питательной среде Игла MEM. Отбирают пробу и подсчитывают количество жизнеспособных клеток. Суспензию клеток разводят до концентрации 2×10⁵ клеток в 1 мл питательной средой Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы. Клетки переносят во флаконы для культивирования, инкубируют при температуре 37°С.После образования монослоя, ростовую среду из культурального флакона сливают, клетки заливают смесью 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в соотношении 2:1 и оставляют на 3-5 минут, затем жидкость сливают. После полного отделения клеток от стекла во флакон добавляют питательную среду Игла MEM, тщательно ресуспендируют до однородной взвеси, разбавляют питательной средой Игла MEM с 10% сыворотки плодов коровы в соотношении 1:2. Суспензию клеток разливают во флаконы и культивируют при температуре 37°С. Дальнейшее субкультивирование проводят в фазе активного роста через 3-4 суток. После стабилизации культуры через 6 последовательных пассажей диплоидные клетки кожно-мышечной ткани человека криоконсервируют и хранят в жидком азоте.

Пример 2. Получение посевного и рабочего банка диплоидных клеток легкого эмбриона (ФЭЧ-1) и кожно-мышечной ткани человека (ФЭЧ 16-2).

Для получения посевного банка восстанавливают диплоидные клетки, замороженные на уровне 6-го пассажа. Для этого ампулу с клетками оттаивают, вскрывают, суспензию клеток переносят в культуральный флакон, инкубируют в питательной среде Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы при температуре 37°С, проводят 5 последовательных пассажей с коэффициентом рассева 1:3. Суспензию клеток замораживают на 11-ом пассаже в количестве 312 ампул (посевной банк). Рабочий банк получают из посевного банка, суспензию клеток пассируют до получения необходимого объема клеток и замораживают на уровне 15-го пассажа в количестве 256 ампул.

Пример 3. Использование диплоидных клеток человека для лечения ожогов. Больная К. 65 лет, поступила в ожоговый центр в тяжелом состоянии через 2 часа после травмы с ожогом II-IIIАБ-IV степени верхних и нижних конечностей, ягодиц, площадь глубоких ожогов составила 24% поверхности тела. Сразу же начато проведение интенсивной противошоковой инфузионно-трансфузионной терапии. Применялась химическая некрэктомия с использованием 40% салициловой мази. По мере очищения ожоговых поверхностей и формирования гранулирующих ран на площади около 10% на 21-е сутки с момента травмы начато поэтапное оперативное закрытие ран. Для одновременного закрытия их с целью предотвращения развития ожогового истощения с возможностью применения лоскута с большим коэффициентом перфорации выполнена операция трансплантации диплоидных клеток кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16-2 на площади 800 кв.см на гранулирующие раны. Через сутки проведена аутодермопластика на площади 900 кв.см, перфорация лоскута в отношении 1:4. Через 8 дней трансплантанты полностью жизнеспособны. Далее были выполнены этапные аутодермопластики 500, 700, 450, 180 кв.см с коэффициентом перфорации 1:2-1:4. Больная выписана на 72 день с момента травмы с полностью восстановленным кожным покровом.

Пример 4. Использование диплоидных клеток человека для лечения трофических язв.

Больная Р. 73 лет, поступила в ожоговый центр с диагнозом: посттромботическая болезнь правой нижней конечности III степени. Трофическая язва правой голени больших размеров. Из анамнеза известно, что язва существует около 10 лет и, несмотря на проведение консервативного лечения (аутодермопластика дважды), устранить ее не удавалось. В отделении проведена санация раны. Выполнена операция трансплантации диплоидных клеток легкого человека ФЭЧ 16-1 на площади 150 кв.см, с предварительным тангенциальным иссечением грануляционной ткани. На 9-й день после операции констатировано отсутствие ран, и больная была выписана из стационара.

Приведенные примеры показывают, что получены новые штаммы диплоидных клеток фетальных тканей человека ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2, созданы и аттестованы посевные и рабочие банки клеток, диплоидные клетки высокоэффективны при использовании в заместительной терапии.

Преимущества по сравнению с прототипом:

- получение новых штаммов диплоидных клеток не только из легкого, но и из кожно-мышечной ткани человека;

- использование в качестве исходной кожно-мышечной фетальной ткани человека;

- проведение многоступенчатого контроля, включающего в себя контроль сыворотки крови донора, суспензии клеток первичного материала и диплоидных штаммов клеток;

- использование при аттестации штаммов диплоидных клеток человека современных, высокочувствительных и информативных методов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции, которые позволяют выявить микобактерии туберкулеза, токсоплазмоза, сифилиса, гонореи, хламидий, острых стрепто- и стафилоккоковых инфекций, цитомегаловируса, вируса простого герпеса, вируса гепатита, клещевого энцефалита, вируса иммунодефицита человека, а также наиболее распространенных и изученных видов микоплазм;

- создание запасов стандартного аттестованного материала клеток в виде посевных и рабочих банков, заложенных на хранение в достаточном количестве (250 и более ампул в каждом);

- использование стандартных аттестованных диплоидных клеток в качестве донорского материала в заместительной терапии;

- высокая эффективность диплоидных штаммов ФЭЧ 16-1 и ФЭЧ 16-2 для заместительной терапии при лечении ран различной этиологии.

Изобретение относится к области биологии, ветеринарии, медицине и косметологии. Предложено два штамма диплоидных клеток человека из ткани легкого эмбриона и из кожно-мышечной ткани эмбриона. Штаммы обладают высоким терапевтическим эффектом при заместительной терапии при лечении ран различной этиологии. Изобретение может быть использовано в медицине и косметологии. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Штамм диплоидных клеток человека из ткани легкого эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-1, зарегистрированный в НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор», регистрационный номер НИИМБ-265.2. Штамм диплоидных клеток человека из кожно-мышечной ткани эмбриона для заместительной терапии ФЭЧ 16-2, зарегистрированный в НИИ клеточных культур Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор», регистрационный номер НИИМБ-266.