КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ РАСТВОР ДЛЯ ХРАНЕНИЯ В КРИОГЕННЫХ УСЛОВИЯХ (ВАРИАНТЫ), РАСТВОР ДЛЯ ХРАНЕНИЯ В КРИОГЕННЫХ УСЛОВИЯХ, СПОСОБ КРИОГЕННОГО ХРАНЕНИЯ КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ КРИОГЕННОГО ХРАНЕНИЯ И РЕГЕНЕРАЦИИ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК, СПОСОБ КРИОГЕННОГО ХРАНЕНИЯ, РЕГЕНЕРАЦИИ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2000 года по МПК A01N1/02 F25D3/10 C12N5/00 

Изобретение относится к растворам для хранения при низкой температуре. Более определенно изобретение направлено на растворы для хранения в криогенных условиях, которые особенно подходят для использования в хранении при низкой температуре различных типов клеток, циркулирующих в крови или найденных в костном мозгу, таких как гематопоэтические стволовые клетки и недифференцированные клетки-предшественники.

Изобретение также относится к способам хранения в криогенных условиях и регенерации клеток, хранимых при низкой температуре.

Предпосылки изобретения
Кровь
Морфологически узнаваемые и функционально активные клетки, циркулирующие в крови включают эритроциты, нейтрофильные, эозинофильные и базофильные гранулоциты, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, не-В-лимфоциты, не-Т-лимфоциты и тромбоциты. Эти зрелые клетки происходят и заменяются, если нужно, морфологически узнаваемыми делящимися клетками предшественников при соответственных однолинейных разведениях, такими как эритробласты для серии эритроцитов, миелобласты, промиелоциты или миелоциты для серии гранулоцитов и мегакариоциты для серии тромбоцитов.

Гематопоэтические стволовые клетки и недифференцированные клетки-предшественники.

Клетки-предшественники происходят из более примитивных клеток, которые упрощенно можно разделить на две больших подгруппы: стволовые клетки и недифференцированные клетки-предшественники. Определение стволовых клеток и недифференцированных клеток-предшественников является операционным и зависит скорее от функциональных, чем от морфологических критериев. Стволовые клетки обладают большой способностью к самообновлению и самоподдержанию. Некоторые стволовые клетки дифференцируются при необходимости, но некоторые стволовые клетки или их дочерние клетки производят другие стволовые клетки для поддержания ценного фонда этих клеток. Следовательно, в дополнение к поддержанию собственного вида стволовые клетки имеют большие возможности и способны к дифференциации на несколько подлиний клеток-предшественников с более ограниченной способностью к самообновлению или без способности к самообновлению. Эти клетки-предшественники в конечном итоге приводят к морфологически узнаваемым клеткам- предшественникам. Клетки-предшественники способны к размножению и дифференцированию по одному или больше, чем одному, миелоидному пути дифференциации.

Стволовые клетки и клетки-предшественники составляют очень малый процент ядросодержащих клеток в костном мозгу, селезенке и крови, относительно костного мозга в селезенке присутствует примерно в десять раз меньше таких клеток и еще меньше присутствует в зрелой крови. В качестве примера приблизительно одна из тысячи ядросодержащих клеток костного мозга является клеткой - предшественником; стволовые клетки встречаются еще реже.

Восстановление гематопоэтической системы обеспечивается трансплантацией костного мозга. Лоренц и сотрудники показали, что мыши могут быть защищены от летального облучения внутривенным вливанием костного мозга (Lorenz, 20Е, и др. , 1951, J.NatI. Cancer Inst. 12:197-201). Более позднее исследование продемонстрировало, что защита возникает из-за колонизации костного мозга реципиента введенными клетками (Lindsley, D.L., и др., 1955, Proc.Soc. Exp. Biol.Med. 90:512-515; Nowell, P.С., и др., 1956, Cancer Res. 16:258-261; Mitchison, N. A. , 1956, Br.J.Exp.Pathol. 37:239-247; Thomas, E.D., et al., 1957, N. Engl. J.Med. 257:491-496). Следовательно, стволовые клетки и клетки-предшественники в донорском костном мозгу могут размножаться и заменять клетки крови, ответственные за защитный иммунитет, заживление ткани, свертывание и другие функции крови. При успешной трансплантации костного мозга кровь, костный мозг, селезенка, тимус и другие органы иммунитета вновь заселяются клетками донора.

Костный мозг использовался с возрастающим успехом для лечения смертельных или калечащих заболеваний, включая некоторые типы анемий, таких как гипопластическая анемия (Thomas, E.D., и др., 5 февраля, 1972, The Lancet, с. 284-289), синдром Фанкони (Gluckman, Е., и др., 1980, Brit. J.Haematol. 45: 557-564; Gluckman, Е. , и др. , 1983, Brit.J.Haematol. 54:431-440; Gluckman, Е., и др., 1984, Seminars in Haematology 21(1): 20-26), иммунодефицит (Good, R.A., и др., 1985, Cellular Immunol. 82: 36-54), виды рака, такие как лимфомы или лейкемии (Cahn, J.Y., и др., 1986, Brit.J.Haematol. 63: 457-470; Blume, K.J. and Forman, S.J., 1982, J.Cell.Physioi.Supp. 1:99-102; Chever, M. A. , и др. , 1982, N. Engl.J.Med.307 (8):479-481), карциномы (Blijham, G. , и др. , 1981, Eur.J.Cancer 17(4):433-441), разные твердые опухоли (Ekerz, H. , и др., 1982, Cancer 49:603-609; Spitzer, G., и др., 1980, Cancer 45:3075-3085), и генетические заболевания гематопоэза.

Недавно трансплантация костного мозга была использована для лечения болезней депонирования (Hobbs, J.R., 1981, Lancet 2:735-739), большой талассемии (Thomas, E. D., и др., 1982, Lancet 2:227-229), серповидно-клеточной анемии (Johnson, F.J., и др., 1984, N.Engl.J.Med. 311:780-783) и остеопетроза (Coccia, P.F., и др., 1980, N.Engl.J.Med. 302:701-708) (для общей дискуссии смотри Storb, R. и Thomas, E.D., 1983, Immunol.Rev. 71:77-102;.1984, Sem. Hematol. 21(3): 188-221; 1969. Хранение, культивирование и трансплантация костного мозга. Сообщения экспертов, Москва, Июль 22-26, 1968, Международное Агентство по Атомной Энерги., Вена; McGlave, P.В., и др., 1985, в Недавних Успехах Гематологии, ред. Hoffbrand, А. V., ed., Churchill Livingstone, Лондон, с. 171-197).

В настоящем использование трансплантация костного мозга несколько ограничена, так как очень сложно идеально подобрать (генетически идентичных) доноров, за исключением случаев, когда доступны идентичные близнецы или когда клетки костного мозга пациента в ремиссии хранятся в жизнеспособном замороженном состоянии. Но даже в такой аутогенной системе опасность, обусловленная необнаруживаемым загрязнением злокачественными клетками и необходимостью иметь пациента, здоровье которого позволяет обеспечить такую заготовку, представляет серьезные ограничения. Помимо таких аутогенных случаев существует проблема плохого генетического соответствия, которое влечет за собой серьезные и иногда летальные осложнения. Эти осложнения двух типов. Первый - это когда у больного происходит иммунное отторжение клеток чужого костного мозга (реакция хозяин против трансплантата). Второй - это когда даже в случае адаптации донорных клеток костного мозга они могут поражать больного (заболевание трансплантат против хозяина), которого узнают как чужого. Даже в случае близко подобранных семейных доноров осложнения из-за частичного несоответствия являются причиной смертности и заболеваемости, прямо обусловленных трансплантацией костного мозга от генетически различных индивидуумов.

Периферическая кровь также была исследована как источник стволовых клеток для восстановления гематопоэза (Nothdurtt, W., и др., 1977, Scand.J.Haematol. 19: 470-471; Sarpel, S.C., и др., 1979, Exp.Hematol. 7:113-120; Ragharachar, А. , и др., 1983, J.Cell.Biochem. Suppi. 7A:78; Juttner, C.A., и др. , 1985, Brit.J.Haematol. 61:739-745; Abrams, R.A., и др., 1983, J.Cell. Biochem. Suppi. 7A:53; Prummer, О., и др., 1985, Exp.Hematol. 13:891-898). В некоторых исследованиях хорошие результаты были получены среди больных разными формами лейкемии (Reiffers, J., и др., 1986, Exp.Hematol. 14:312-315 (использование клеток, хранившихся в криогенных условиях); Goidman, J.M., и др. , 1980, Brit.J.Haematol. 45:223-231; Tilly, H., и др., 19 июля 1986, The Lancet, с. 154-55; смотри также То, L.B. и Juttner, C.A., 1987, Brit.J.Haematol. 66: 285-288, и ссылки, цитируемые в ней, и лимфомой (Korbling, М., и др. , 1986, Blood 67:529-532). Это значит, что способность аутогенной периферической зрелой крови восстанавливать гематопоэтическую систему, наблюдаемая у некоторых раковых больных, связана с появлением большого числа циркулирующих клеток-предшественников в периферической крови, получаемых после циторедукции вследствие интенсивной химиотерапии и/или облучения (симптом отдачи) (То, L.B. и Juttner, С.А., 1987, Annot.Brit.J.Haematol. 66:285-288; смотри также 1987, Brit.J.Haematol. 67:252-253 и ссылки, цитируемые там). Другие исследования с использованием периферической крови не дали эффекта восстановления (Hershko, С., и др., 1979, The Lancet 1:945-947; Ochs, H.D., и др., 1981, Pediatr. Res. 15 (4 часть 2): 601).

Изучалась также трансплантация эмбриональных клеток печени (Cain, G.R., и др., 1986, Transplantation 41(1):32-35; Ochs, H.D., и др., 1981, Pediatr. Res. 15(4 часть 2): 601; Paige, C.J., и др., 1981, J.Exp.Med. 153:154-165; Touraine, J.L., 1980, Exerpta Med. 514:277; Touraine, J.L., 1983, Birth Defects 19: 139; смотри также Good R.A., и др., 1983, Cellular Immunol. 82: 44-45 и ссылки, цитированные там) или клеток печени новорожденных (Yunis, E. J. , и др., 1974, Proc. Nati. Acad.Sci. U.S.A. 72:4100) в качестве источника стволовых клеток для восстановления гематопоэза. Клетки тимуса новорожденных также были трансплантированы в опытах по восстановлению иммунитета (Vickery, А. С. , и др., 1983, J.Parasitol. 69(3):478-485; Hirokawa, К., и др., 1982, Clin.lmmunol. Immunopathol. 22:297-304).

Растворы и методы хранения при низкой температуре
Замораживание давно использовали, чтобы сохранить живые клетки, такие как клетки крови, после их удаления и выделения из донора. Хранение при низкой температуре и регенерация живых клеток, однако, как доказано, являются весьма сложными. Клетки подвергаются относительно жестким условиям во время циклов замораживания и размораживания, включаемых в хранение в криогенных условиях, приводя к низкой степени выживаемости.

Замораживание разрушительно для большинства живых клеток. Как только внешняя среда замерзает, клетки пытаются поддержать равновесие и теряют воду, таким образом увеличивая концентрацию внутриклеточного растворенного вещества, при этом внутриклеточное замораживание происходит при примерно минус 10-15^oC. Обычно считают, что как внутриклеточное замораживание, так и действие раствора, ответственны за повреждение клеток. Например, предполагали, что разрушение при замораживании от внеклеточного льда является по существу повреждением плазматической мембраны вследствие осмотической дегидратации клетки.

Много времени и усилий было затрачено на то, чтобы максимизировать жизнеспособность оттаявших клеток. Такие усилия обычно фокусировали на разработке криозащитных средств и установлении оптимальных скоростей охлаждения.

Криозащита добавлением растворенного вещества, как полагают, протекает по двум возможным механизмам: (i) внутриклеточном - снижением количества льда, образующегося внутри клетки; и/или (ii) внеклеточном - уменьшением воды, выходящей из клетки в ответ на пониженное давление пара, обусловленное образованием льда в растворенном веществе, окружающем клетки.

Различные оптимальные скорости охлаждения были описаны для разных клеток. Разные группы рассматривали влияние скорости охлаждения или хранения при низкой температуре на выживание или эффективность трансплантации замороженных клеток костного мозга и красных клеток крови (Lovelock, J.E., и Bishop, M.W.H., 1959, Nature 183:1394-1395; Ashwood-Smith, M.J., 1961, Nature 190: 1204-1205; Rowe, A.W. и Rinfret A.P., 1962, Blood 20:636; Rowe, A.W. и Felling, J. , 1962, Fed.Proc. 21:157; Rowe, A.W., 1966, Cryobiology 3(1): 12-18; Lewis, J.P., и др., 1967, Transfusion 7(l):17-32; Rapatz, G., и др., 1968, Cryobiology 5(1):18-25; Mazyr, P., 1970, Science 168:939-949; Mazur, P., 1977, Cryobiology 14:251-272; Rowe, A.W., и Lenny, L.L., 1983, Cryobiology 20: 717; Stiff, P.J., и др., 1983, Cryobiology 20:17-24; Gorin, N.C., 1986, Clinics in Haematology 15(1):19-48). Обычно, оптимальные результаты по замораживанию гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников могут быть достигнуты при скорости охлаждения примерно 1-2^oC в минуту и конечной температуре хранения от примерно -70 до примерно -196^oC; для других клеток крови интервалы обычно такие же.

Описана успешная регенерация клеток костного мозга человека после длительного хранения в жидком азоте (1983, Американская Коллекция Типов Культур, Квартальный выпуск 3(4):1). В дополнение, стволовые клетки в костном мозгу, как было показано, способны выдерживать хранение при низкой температуре и размораживании (Fabian, 1., и др., 1982, Exp. Hematol. 10(l):119-122).

Широко применяемым промышленным стандартным криопротектором для использования в хранении в криогенных условиях большинства клеток, включая цельную кровь, пуповинную кровь, костный мозг, гранулоциты, нейтрофилы, тромбоциты и гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, является диметилсульфоксид (ДМСО). Это объясняется широким распространением опыта и мнением, что ДМСО обеспечивает наилучшую защиту и максимальную жизнеспособность клеток. Однако при том, что ДМСО весьма эффективен для этих целей, также известно, что он является физиологически вредным, особенно при высокой концентрации, и имеет тенденцию вызывать раздражение как в системе, подвергаемой хранению при низких температурах, так и у больного, которому вводят клетки хранившихся при низкой температуре, приводя к гипертензии, рвоте и тошноте. Пернициозная природа ДМСО, как полагают, приводит к более низкой in vitro жизнеспособности клеток, хранившихся при низкой температуре.

Соответственно, существует необходимость в простом, физиологически совместимом, альтернативном растворе для криогенного хранения, способном обеспечить сравнимый уровень жизнеспособности клеток in vivo и in vitro.

Сущность изобретения
Был разработан простой, недорогой, физиологически совместимый раствор для хранения при низкой температуре, который включает безвредные компоненты (i) глицерин, (ii) хлорид щелочного металла, (iii) моносахарид и (iv) сывороточный альбумин.

Основным компонентом раствора для хранения в криогенных условиях является глицерин (также известный как глицерол). Хлорид щелочного металла повышает жизнеспособность клеток в цикле замораживание-размораживание. Моносахарид является источником углерода для клеток. Сывороточный альбумин действует как источник белка, который покрывает мембрану клетки-мишени, так чтобы обеспечить ее защиту в течение цикла замораживание-размораживание и хранение замороженных клеток. Сывороточный альбумин, как полагают, также действует как ловушка свободных радикалов кислорода, которые, как известно, отрицательно воздействуют на жизнеспособность различных клеток-мишеней, таких как эритроцит, нейтрофильный, эозинофильный и базофильный гранулоциты, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, не-В-лимфоциты, не-Т- лимфоциты и тромбоциты, указанные ранее. Источник сывороточного альбумина предпочтительно подбирают в соответствии с особенностями субъекта, которому защищенные клетки-мишени будут введены.

Раствор для хранения при низкой температуре может быть как концентрированным, так и сильно разбавленным.

Концентрированный раствор может быть разбавлен до необходимой концентрации просто добавлением разбавителя, такого как вода, которую соответственно обрабатывали для инъекции. Разбавителем является предпочтительно физиологически уравновешенный солевой раствор, такой как физиологический раствор.

Использование раствора для хранения при низкой температуре и последующее терапевтическое использование клеток-мишеней, таких как цельная кровь, умбиликальная пуповинная кровь, костный мозг, гранулоциты, нейтрофилы, тромбоциты и гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, включая клетки, идентифицированные как клетки CD 34+, включает стадии (i) соответствующего разбавления концентрированного раствора для хранения в криогенных условиях, (ii) введения клеток-мишеней в разбавленный раствор, (iii) замораживания защищенных клеток-мишеней, (iv) размораживания раствора до комнатной температуры, (v) введение размороженных клеток-мишеней субъекту, нуждающемуся в таких клетках-мишенях. Размороженные клетки-мишени и раствор для хранения при низкой температуре предпочтительно нагревают до температуры тела (т.е., примерно, 37^oC) перед введением субъекту. Физиологическая совместимость раствора для хранения при криогенной температуре позволяет вводить субъекту размороженные клетки-мишени без разделения клеток-мишеней и раствора для хранения при низкой температуре.

Подробное описание изобретения.

Был получен простой, недорогой, физиологически совместимый раствор для хранения в криогенных условиях, который состоит из (i) глицерина, (ii) хлорида щелочного металла, (iii) моносахарида и (iv) сывороточного альбумина.

Как предусмотрено здесь, за исключением формулы изобретения, "вес.%", использование в связи с компонентами раствора для хранения при низкой температуре основывается на общем весе концентрированного раствора для хранения при низкой температуре, если не оговорено особо.

Концентрированный раствор для хранения при низкой температуре включает от примерно 60 до примерно 80 вес.% глицерина. Концентрации, меньше примерно 60 вес.%, приводят к снижению жизнеспособности клеток, в то время как растворы, содержащие больше примерно 80 вес.%, глицерина, приводят к образованию раствора с неприемлемо высоким осмотическим давлением (т.е. больше примерно 2000 мОсм/кг).

Хлориды щелочных металлов, пригодные для использования в этом изобретении, включают хлорид натрия и хлорид калия. Хлорид щелочного металла, как полагают, повышает жизнеспособность клеток в цикле замораживания-размораживания установлением осмотического давления раствора для хранения при низкой температуре между примерно 500 и 2000 мОсм/кг, которое измеряют на осмометре давления пара, модель Вескор 5500 в соответствии с протоколом, имеющемся в инструкции/руководстве по эксплуатации прибора. По имеющимся данным физиологическое осмотическое давление крови обычно находится в интервале от примерно 260 до 320 мОсм/кг. Оптимальное осмотическое давление в этом общем интервале зависит от нескольких факторов, включающих специфические клетки-мишени, специфический состав раствора для хранения в криогенных условиях и скорость замораживания-размораживания. В качестве примера осмотическое давление от примерно 700 до 1700 обычно предпочтительно для криогенного хранения гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников.

Концентрированный раствор для хранения при низкой температуре содержит от примерно 5 до примерно 10 вес.% хлорида щелочного металла. Концентрация меньше примерно 5 вес.% и больше 10 вес.% хлорида щелочного металла приводят к снижению жизнеспособности клеток в цикле замораживания-размораживания, причем при концентрации больше 10 вес.% они также чувствительны к повреждающей кристаллизации.

Моносахарид, такой как глюкоза, действует как источник углерода для клеток. Доступность моносахарида способствует сохранению клеток в цикле замораживания-размораживания и хранению замороженных клеток, гарантируя присутствие достаточного количества питательных веществ внутри клетки.

Альбумин сыворотки действует как источник белка, который обеспечивает покрытие вокруг мембраны клетки-мишени для того, чтобы защитить мембрану во время цикла замораживания-размораживания и хранения замороженных клеток. Сывороточный альбумин, как полагают, также действует как ловушка свободных радикалов кислорода, которые, как известно, отрицательно влияют на жизнеспособность различных клеток-мишеней, таких как эритроцит, нейтрофильный, эозинофильный и базофильный гранулоциты, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, не-В-лимфоциты, не-Т-лимфоциты и тромбоциты, указанные ранее. Источник сывороточного альбумина предпочтительно подбирают в соответствии с особенностями субъекта, которому защищенные клетки-мишени будут введены.

Эффективные концентрации могут быть достигнуты введением от примерно 0,2 до 1 вес.% моносахарида в концентрированный раствор для хранения при низкой температуре. Концентрация меньше примерно 0,2 вес.% не является достаточной и снижает жизнеспособность в цикле замораживания- размораживания, в то время как концентрации больше примерно 1 вес.% не дают пропорционального роста жизнеспособности клеток и вредно действуют на концентрации других компонентов.

Альбумин сыворотки действует как источник белка, который обеспечивает покрытие вокруг мембраны клетки-мишени для того, чтобы защитить мембрану во время цикла замораживания-размораживания и хранения замороженных клеток.

Эффективные концентрации могут быть достигнуты введением от примерно 20 до 30 вес.% сывороточного альбумина. Концентрации меньше примерно 20 вес.% альбумина сыворотки приводят к снижению жизнеспособности, в то время как концентрации больше примерно 30 вес.% не дают пропорционального повышения жизнеспособности клеток и имеют тенденцию увеличивать осмотическое давление раствора выше верхнего предела примерно 2000 мОсм/кг.

Концентрированный раствор для хранения в криогенных условиях может быть разбавлен до концентрации использования добавлением подходящего растворителя (например, 0,9 вес.% физиологического раствора, состоящего из ультрафильтрованной воды, воды для инъекции и аутогенной плазмы) при отношении примерно 1-10 частей, обычно 1-2 части, разбавителя к 1 части концентрированного раствор для хранения при низкой температуре. Обычно разбавленный раствор для хранения в криогенных условиях состоит существенным образом из (i) примерно 20-40 вес.% глицерина, (ii) примерно 1,5-5 вес.% хлорида щелочного металла, (iii) примерно 0,1-0,5 вес.% моносахарида и (iv) примерно 6-15 вес.% сывороточного альбумина в расчете на разбавленный раствор для хранения при низкой температуре. Разбавителем доводят раствор до конечного общего количества.

Концентрированный раствор для хранения при низкой температуре должен быть составлен так, чтобы обеспечить pH между примерно 7 и 7,5.

Клетки-мишени обычно могут быть криогенно сохранены с использованием раствора для хранения при низкой температуре просто (i) введением клеток-мишеней в разбавленный раствор для хранения в криогенных условиях и (ii) замораживанием или криогенным хранением защищенных клеток-мишеней. Объем разбавленного раствора для хранения при низкой температуре, который следует добавить к клеткам-мишеням, зависит от объемного отношения раствора, содержащего клетки-мишени, к раствору для хранения в криогенных условиях и отношения клетки-мишени к раствору для хранения при низкой температуре.

Объемное отношение раствора, содержащего клетки-мишени, к раствору для хранения при низкой температуре обычно должно быть примерно 1:1-1:10, а отношение клеток-мишеней к раствору для хранения при низкой температуре 1•10⁵ клеток/мл - 1•10⁹ клеток/мл, предпочтительно 2•10⁸ клеток/мл - 3•10⁸ клеток/мл. Отношения, превышающие указанные, приводят к уменьшению концентрации жизнеспособных клеток, вследствие несоответствия раствора для хранения при низкой температуре, в то время как отношения меньше указанных просто приводят к неэффективному использованию раствора и необходимости вводить избыточный раствор для хранения при низкой температуре субъекту для того, чтобы ввести эффективное количество клеток-мишеней. Клетки-мишени часто используют для хранения в разбавленной форме, в качестве основного компонента биологической жидкости (например, стволовые клетки, концентрированные из периферической крови, обычно содержат стволовые клетки в концентрации от примерно 1•10⁶ клеток/мл до 3•10⁸ клеток/мл с остатком из других компонентов крови, таких как плазма и тромбоциты). Эти биологически разбавленные образцы обычно должны быть смешаны с раствором для хранения при низкой температуре в объемном соотношении от примерно 2:1 до 1:4 (зависящим, от ряда факторов, включая специфический состав разбавленного раствора для хранения при низкой температуре, концентрации клеток-мишеней в биологически разбавленном образце, типа клеток-мишеней т. д. ), чтобы достичь оптимального отношения клеток-мишеней к раствору для хранения при низкой температуре. Конечный раствор, содержащий клетки-мишени, обычно должен содержать примерно 4-12 вес. % глицерина и примерно 2-10 вес.% альбумина, с различными внешними границами этого общего интервала, рассматриваемыми для определенных применений.

Хранившиеся в криогенных условиях защищенные клетки-мишени должны быть разморожены перед их введением субъекту. Благодаря физиологической совместимости раствора для хранения при низкой температуре размороженные клетки-мишени могут быть введены субъекту без их разделения с раствором. Размороженные клетки-мишени могут находится несколько часов при комнатной температуре без заметной потери их жизнеспособности. Размороженный раствор может быть медленно разбавлен физиологическим раствором или другим ионным раствором для того, чтобы уменьшить осмотическое давление с давления криогенного хранения 500-2000 мОсм/кг до физиологического 260-320 мОсм/кг. Таким образом снижается опасность разрушения клеточных стенок, вызванная быстрыми изменениями осмотического давления.

Регулированная медленная скорость охлаждения часто может быть эффективной для достижения оптимальной жизнеспособности клеток. Обычно считают, что разные типы клеток имеют разные скорости охлаждения (смотри, например, Rowe, A. W. и Rinfret, A.P., 1962, Blood 20:636; Rowe, A.W., 1966, Cryo Biology 3(l): 12-18; Lewis, J.P., и др., 1967, Transfusion 7(l):17-32; Mazur, P. , 1970, Science 168:939-949 по влиянию скорости охлаждения на выживание стволовых клеток мозга и возможности трансплантации).

Раствор для хранения в криогенных условиях может находиться при комнатной температуре перед использованием, а смешиваемые клетки-мишени могут быть выдержаны при комнатной температуре в течение тридцати минут перед началом замораживания без заметной потери жизнеспособности клеток. Это контрастирует с токсичным криопротектором ДМСО, который должен быть охлажден до примерно 4^oC перед добавлением клеток-мишеней для того, чтобы ускорить процесс замораживания, при этом необходимо, чтобы процесс замораживания начался немедленно после добавления ДМСО к клеткам, снижая таким образом гибель клеток, вызываемую ДМСО.

Регулируемое замораживание может быть выполнено с использованием замораживающего прибора с программным управлением. Программируемый аппарат замораживания позволяет определять оптимальные скорости охлаждения и облегчает стандартное воспроизводимое охлаждение.

Контейнер, содержащий клетки должен быть устойчивым к криогенным условиям и должен обеспечивать быстрый теплоперенос для эффективного контроля как замораживания, так и размораживания. Для малых количеств (1-2 мл) можно использовать герметичные пластмассовые ампулы (например, ампулы Нанка и Уитона) или стеклянные ампулы, а большие объемы от 100 до 200 мл можно замораживать в полиолефиновых мешках, таких как выпускает Фенвал, которые находятся между металлическими пластинами.

Замороженные клетки затем можно перенести в криогенный сосуд длительного хранения. В предпочтительном варианте образцы можно криогенно хранить в жидком азоте (-196^oC) или парах жидкого азота (-105^oC). Такое хранение значительно облегчается доступностью высокоэффективных холодильников на жидком азоте.

Если необходимо, замороженные клетки быстро размораживают и сохраняют при 37^oC до использования. Так как раствор для хранения при низкой температуре физиологически совместим, то его не надо удалять перед введением субъекту.

Криогенно сохраненные и размороженные умбиликальные пуповинные клетки, тромбоциты и гематопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники могут быть использованы терапевтически для восстановления гематопоэтических систем у подходящих больных. Клетки можно вводить любым известным методом, но системное вливание обычно предпочтительно.

Восстановление гематопоэтической системы (или иммунной системы) может иметь терапевтическую ценность для большого числа заболеваний и нарушений. Вливание криогенно сохраненных гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников для восстановления гематопоэза может быть с пользой использовано для лечения тех заболеваний, которые, как известно, в настоящее время излечиваются трансплантацией костного мозга.

Заболевания, которые могут быть вылечены вливанием стволовых клеток, включают, но не ограниваются ими, пять широких категорий. Первая - это заболевания, возникающие от недостаточности или дисфункции нормального производства клеток крови и созревания (например, гипопластическая анемия и гипопролиферативные заболевания стволовых клеток). Вторая группа включает опухолевые злокачественные заболевания в гематопоэтических органах (например, лейкемия и лимфомы). Третья группа включает больных с широким спектром злокачественных твердых опухолей негематопоэтической природы. Вливание стволовых клеток этим больным служит процедурой спасения костного мозга, которая назначается больному после химиотерапии и облучения злокачественной опухоли. Четвертая группа заболеваний состоит из аутоиммунных состояний, когда стволовые клетки служат в качестве источника замещения аномальной иммунной системы. Пятая группа заболеваний содержит ряд генетических заболеваний, которые могут быть исправлены вливанием гематопоэтических стволовых клеток, предпочтительно сингенных, которые перед трансплантацией подвергались генной терапии.

Изобретение предназначено для использования при хранении при низкой температуре различных типов клеток, циркулирующих в крови или найденных в костном мозгу. Также изобретение относится к способам хранения в криогенных условиях и регенерации клеток, хранимых при низких температурах. Физиологически совместимый раствор для хранения в криогенных условиях содержит безвредные компоненты: глицерин, хлорид щелочного металла, моносахарид, сывороточный альбумин. Представлены соотношения компонентов. Введение размороженных клеток-мишеней субъекту осуществляют без разделения клеток-мишеней раствора для хранения при низкой температуре. Раствор прост, физиологически совместим и способен при хранении в криогенных условиях обеспечить сравнимый уровень жизнеспособности клеток in vivo и in vitro. Способы хранения клеток в этом растворе, а также их регенерации и терапевтического применения обеспечивают достижение оптимальной жизнеспособности клеток и возможность их длительного хранения. 7 с. и 25 з.п. ф-лы.

1. Концентрированный раствор для хранения в криогенных условиях, содержащий глицерин, отличающийся тем, что указанный раствор является физиологически совместимым и содержит также хлорид щелочного металла в количестве, эффективном для повышения жизнеспособности клеток, моносахарид, способный к биологическому метаболизму, в количестве, эффективном для поддержания клетки в окружающих условиях, и сывороточный альбумин в количестве, эффективном для сохранения целостности мембраны плазмы. 2. Раствор для хранения в криогенных условиях по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит разбавитель. 3. Раствор для хранения в криогенных условиях по п.1, отличающийся тем, что pH раствора составляет примерно 7-7,5. 4. Раствор для хранения в криогенных условиях по п.1, отличающийся тем, что концентрат содержит (а) примерно 60-80 вес.% глицерина, (б) примерно 5-10 вес.% хлорида щелочного металла, (в) примерно 0,2-1 вес.% моносахарида и (г) примерно 20-30 вес.% сывороточного альбумина. 5. Раствор для хранения в криогенных условиях по п.2, отличающийся тем, что он содержит (а) примерно 20-40 вес.% глицерина, (б) примерно 1,5-5 вес.% хлорида щелочного металла, (в) примерно 0,1-0,5 вес.% моносахарида и (г) примерно 6-15 вес.% сывороточного альбумина и (д) остаток - разбавитель. 6. Концентрированный раствор для хранения в криогенных условиях по п.1, отличающийся тем, что хлорид щелочного металла представляет собой хлорид натрия. 7. Раствор для хранения в криогенных условиях по п.2, отличающийся тем, что хлорид щелочного металла представляет собой хлорид натрия. 8. Концентрированный раствор для хранения в криогенных условиях по п.1, отличающийся тем, что моносахаридом является глюкоза. 9. Раствор для хранения в криогенных условиях по п.2, отличающийся тем, что моносахаридом является глюкоза. 10. Концентрированный раствор для хранения в криогенных условиях по п.1, отличающийся тем, что сывороточным альбумином является альбумин сыворотки человека. 11. Раствор для хранения в криогенных условиях по п.2, отличающийся тем, что сывороточным альбумином является альбумин сыворотки человека. 12. Концентрированный раствор для хранения в криогенных условиях, содержащий глицерин, отличающийся тем, что указанный раствор является физиологически совместимым и содержит также хлорид щелочного металла, глюкозу и сывороточный альбумин, при этом соотношение компонентов составляет примерно 60-80 вес.% глицерина, примерно 5-10 вес.% хлорида щелочного металла, примерно 0,2-1 вес.% глюкозы, примерно 20-30 вес.% сывороточного альбумина. 13. Раствор для хранения в криогенных условиях, содержащий глицерин, отличающийся тем, что указанный раствор является физиологически совместимым и содержит также хлорид щелочного металла, глюкозу, сывороточный альбумин и разбавитель, при этом соотношение компонентов составляет примерно 20-40 вес. % глицерина, примерно 1,5-5 вес.% хлорида щелочного металла, примерно 0,1-0,5 вес. % глюкозы, примерно 6-15 вес.% сывороточного альбумина и остаток - разбавитель. 14. Способ криогенного хранения клеток, включающий в себя введение клеток-мишеней в раствор для хранения в криогенных условиях, содержащий глицерин, отличающийся тем, что указанный раствор является физиологически совместимым и содержит также хлорид щелочного металла в количестве, эффективном для повышения жизнеспособности клеток, моносахарид, способный к биологическому метаболизму в количестве, эффективном для поддержания клетки в окружающих условиях, и сывороточный альбумин в количестве, эффективном для сохранения целостности мембраны плазмы, и дополнительно разбавитель, причем хранение защищенных клеток-мишеней осуществляют при криогенных температурах. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что объемное отношение раствора, содержащего клетки-мишени, к раствору для хранения в криогенных условиях составляет примерно 1: 1 - 1:10, а отношение клеток-мишеней к раствору для хранения в криогенных условиях составляет примерно 1 • 10⁵ - 1 • 10⁹ клеток/мл. 16. Способ по п.14, отличающийся тем, что клетки-мишени являются гематопоэтическими стволовыми клетками или клетками-предшественниками. 17. Способ по п.14, отличающийся тем, что клетки-мишени являются клетками тромбоцитов крови. 18. Способ по п.14, отличающийся тем, что клетки-мишени являются клетками, идентифицируемыми как клетки CD 34+. 19. Способ по п. 14, отличающийся тем, что клетки-мишени получают из пуповинной крови. 20. Способ криогенного хранения клеток, включающий в себя введение клеток-мишеней в раствор для хранения, содержащий глицерин, отличающийся тем, что раствор содержит также хлорид щелочного металла, глюкозу, сывороточный альбумин и разбавитель, при этом соотношение компонентов составляет примерно 20-40 вес.% глицерина, примерно 1,5-5 вес.% хлорида щелочного металла, примерно 0,1-0,5 вес. % глюкозы, примерно 6-15 вес.% сывороточного альбумина и остаток - разбавитель, причем хранение защищенных клеток-мишеней осуществляют при криогенных температурах. 21. Способ по п.20, отличающийся тем, что объемное отношение раствора, содержащего клетки-мишени, к раствору для хранения в криогенных условиях составляет примерно 1: 1 - 1:10, а отношение клеток-мишеней к раствору для хранения в криогенных условиях составляет примерно 1 • 10⁵ - 1 • 10⁹ клеток/мл. 22. Способ по п.20, отличающийся тем, что защищенные клетки-мишени охлаждают со скоростью 1-2^oС в минуту до температуры примерно (-70) - (-196)^oС. 23. Способ криогенного хранения и регенерации жизнеспособных клеток, включающий введение клеток-мишеней в раствор для хранения в криогенных условиях, содержащий глицерин, хранение и размораживание защищенных клеток-мишеней, отличающийся тем, что указанный раствор является физиологически совместимым и содержит также хлорид щелочного металла в количестве, эффективном для повышения жизнеспособности клеток, моносахарид, способный к биологическому метаболизму, в количестве, эффективном для поддержания клетки в окружающих условиях, сывороточный альбумин в количестве, эффективном для сохранения целостности мембраны плазмы, и дополнительно разбавитель, причем хранение защищенных клеток-мишеней осуществляют при криогенных температурах. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что объемное отношение раствора, содержащего клетки-мишени, к раствору для хранения при низкой температуре составляет примерно 1: 1 - 1:10, а отношение клеток-мишеней к раствору для хранения при низкой температуре составляет примерно 1 • 10⁵ - 1 • 10⁹ клеток/мл. 25. Способ по п.23, отличающийся тем, что клетки-мишени являются гематопоэтическими стволовыми клетками или клетками-предшественниками. 26. Способ криогенного хранения, регенерации и терапевтического применения клеток, включающий введение клеток-мишеней в раствор для хранения при низкой температуре, содержащий глицерин, хранение защищенных клеток-мишеней, размораживание защищенных клеток-мишеней и введение размороженных клеток-мишеней субъекту, отличающийся тем, что указанный раствор является физиологически совместимым и содержит также хлорид щелочного металла в количестве, эффективном для повышения жизнеспособности клеток, моносахарид, способный к биологическому метаболизму, в количестве, эффективном для поддержания клетки в окружающих условиях, сывороточный альбумин в количестве, эффективном для сохранения целостности мембраны плазмы, и дополнительно разбавитель, а введение размороженных клеток-мишеней субъекту осуществляют без разделения клеток-мишеней и раствора для хранения при низкой температуре, причем хранение защищенных клеток-мишеней осуществляют при криогенных температурах. 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что объемное отношение раствора, содержащего клетки-мишени, к раствору для хранения при низкой температуре составляет примерно 1: 1 - 1:10, а отношение клеток-мишеней к раствору для хранения при низкой температуре составляет примерно 1 • 10⁵ - 1 • 10⁹ клеток/мл. 28. Способ по п.26, отличающийся тем, что клетки-мишени являются гематопоэтическими стволовыми клетками или клетками-предшественниками. 29. Способ по п.26, отличающийся тем, что клетки-мишени являются клетками тромбоцитов крови. 30. Способ по п.26, отличающийся тем, что клетки-мишени являются клетками, идентифицируемыми как клетки CD 34+. 31. Способ по п. 26, отличающийся тем, что клетки-мишени получают из пуповинной крови. 32. Способ по п.26, отличающийся тем, что субъектом является человек.