СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 A61B17/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в гнойно-септической хирургии для прогнозирования течения раневого процесса и ранней диагностики возникающих гнойно-септических осложнений.

Известно, что нейтрофильные лейкоциты являются одним из первых клеточных факторов естественной неспецифической резистентности организма, контактирующих с инфекционными агентами и от их функциональной и морфологической полноценности зависит дальнейшая динамика развития воспалительного процесса в условиях антигенной перегрузки. Их изучение представляет особый интерес в связи с тем, что в лейкоцитах происходит основной комплекс превращений, свойственных организму человека в целом, и, таким образом, изменение метаболической активности лейкоцитов отражает в определенной степени метаболизм целостного организма.

При анализе различных цитохимических показателей необходимо также учитывать, где происходят реактивные изменения нейтрофила - на периферии или в процессе гранулопоэза, так как дефекты его ферментных систем могут приобретаться на уровне зрелых клеток. Они могут возникать при контакте нейтрофилов с продуктами жизнедеятельности бактерий, при избыточной продукции оксидантов на фоне недостатка их инактиваторов и др. С другой стороны, повреждающие факторы внешней среды могут являться стимуляторами биологической активности нейтрофилов. Их активация есть репаративное явление. Она возникла в эволюции как механизм адаптации. Суть этого механизма заключается в том, что в ситуации резкого изменения условий существования клетки, грозящей ей гибелью, она пытается приспособить к ним свой обмен веществ. При этом по сигналу с клеточной поверхности включается аварийный статус, и происходит массивная депрессия генома. Срочно экспрессируется весь (либо ключевой) набор транскриптов. Этим путем геном предлагает клетке выбор. При наличии метаболической необходимости в новых транскриптах экспрессия данной части программы эпигенно закрепляется, а ее реализация начинает поддерживаться транскрипционно-трансляционным конвейером. Если эти меры позволят клетке адаптироваться к ситуации и наладить гомеостаз, то сигнал к активации прекращается, а транскрипция ненужных генов, не поддерживаемая метаболическим способом, затухает. Перепрограммирование закончено.

Внешне признаки активации нейтрофилов могут проявляться в изменении физико-химических свойств хроматина их ядер, изменении активности хемотаксиса, комплемент-зависимого и комплемент-независимого фагоцитоза, степени проницаемости клеточных мембран, интенсивности расходования протективных субстратов цитоплазмы в очаге воспаления. Следует учитывать, что ведущим и сравнительно легко определяющимся признаком активации нейтрофила является изменение физико-химических свойств хроматина их ядер, которое должно предшествовать всем остальным явлениям активации.

Таким образом, признаки измененной реактивности нейтрофильных лейкоцитов необходимо искать не только в циркулирующих в периферической крови клетках. Они могут быть сильнее выражены в тканевом пуле, непосредственно в раневом барьере, то есть непосредственно там, где совершаются основные реакции нейтрофилов. Такой подход в оценке функционального состояния организма (периферия-очаг) носит универсальный характер и касается не только цитохимического изучения нейтрофильных лейкоцитов, но и других методов исследования - иммунологических, биохимических и т.д.

В настоящее время известны попытки локальной оценки гнойного очага - рН-метрия, метод раневых отпечатков, биохимическое исследование гнойного отделяемого и ряд других методов.(Фенчин К.М. Заживление ран.- Киев, 1979.- 168 с.). Однако эти методы широкого распространения не получили ввиду своей малой информативности и больших погрешностей в результатах исследований. Причин этому много - разнородный состав гноя, изменение его свойств в зависимости от вида возбудителя, количество в отделяемом погибших нейтрофилов и т.д.

За прототип принят метод определения миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов по A.Sato (1927),(Kaplow L.S. Simplified myeloperoxidase Stain using benzidine dihydrochloride // Blood.- 1966. - Vol. 26. - N 3. - P. 215), основанный на окислении бензидина системой перекись водорода - пероксидаза с образованием окрашенного продукта реакции. Однако забор крови для цитохимических исследований в классическом варианте осуществляется из пальца пациента или кубитальной вены. Изучение крови, взятой непосредственно из раневого барьера, не производилось, что существенно снижает информативность проводимых исследований, так как изменения ряда показателей в периферической крови наблюдаются уже при достаточно выраженном патологическом процессе, когда имеет место уже системный ответ макроорганизма в ответ на распространение инфекционного агента. В тех случаях, когда гнойный процесс носит локальный характер, явных данных, говорящих о функциональном истощении нейтрофильных лейкоцитов, в периферической крови может и не быть. В то время как в гнойном очаге в эти сроки уже имеются признаки развивающейся декомпенсации.

Цель изобретения: обеспечение ранней диагностики возникающих гнойно-септических осложнений и прогнозирование течения раневого процесса.

Задача: повысить информативность существующих методов оценки течения раневого процесса.

Сущность изобретения: одновременное изучение показателей, характеризующих функциональное состояние макроорганизма как в периферической крови, так и непосредственно в гнойном очаге, с последующим определением их корреляционной взаимосвязи.

Способ осуществляется следующим образом. В периферической крови исследования проводят по общепринятым методикам. Одновременно с забором крови из периферии осуществляют забор крови из гнойного очага с помощью стерильного капилляра путем скарификации стенки раны стерильным инструментом. Полученную таким образом кровь затем изучают также по общепринятым методикам. При получении результатов сопоставляют полученные данные в периферической крови и в гнойном очаге.

Для примера можно привести цитохимические методы определения НСТ-теста и миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов, физико-химическое состояние хроматина ядер лейкоцитов, а также определение эффективной концентрации альбумина у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей.

Забор материала для исследования (периферическая кровь и кровь из раневого барьера) осуществлялся с 9-00 до 10-00 ежедневно во время перевязок с помощью стерильных гепаринизированных капилляров. Исследование ферментных систем проводили по стандартным методикам с последующим вычислением СЦК по L.S.Kaplow и построением гистограмм.(Kaplow L.S. Histochemical procedure for localizing and evaluating leukocyte alkaline phosphatase activity in smears of blood marrow // Blood. - 1955. - Vol. 10. - P. 1023-1029).

Результаты проведенных исследований.

1. НСТ-тест. Постановку реакции для определения НСТ-теста проводили по общепринятой методике И.В. Нестеровой (Нестерова И.В. Интралейкоцитарная микробицидная система нейтрофильных гранулоцитов у здоровых детей при гнойно-септических заболеваниях: Автореф. дис.канд. мед. наук. - М., 1980. - 20 с. ). При изучении НСТ-теста в периферической крови выполнялся спонтанный НСТ-тест, в ране, учитывая контакт нейтрофилов с бактериальными антигенами, НСТ-тест рассматривали как стимулированный. При этом НСТ-тест в периферической крови (НСТ-п) характеризовал степень активации нейтрофилов на определенные нарушения гомеостаза, то есть степень выраженности воспалительного процесса, в то время как НСТ-тест в ране (НСТ-р) характеризовал функциональный резерв нейтрофилов, вскрывая их потенциальную способность к завершенному фагоцитозу. Для локализованных форм гнойно-воспалительного процесса с благоприятным клиническим течением была характерна высокая степень активации нейтрофилов в НСТ-р-тесте (2.19±0.02) при низких показателях НСТ-п-теста (1.31±0.03), в то время как при торпидном течении раневого процесса, при склонности к гнойно-септическим осложнениям, наблюдалось снижение формазан-позитивных клеток в НСТ-р-тесте при высокой степени раздраженности нейтрофилов в периферической крови. Следует отметить, что наиболее информативными были цитохимические показатели в ране, которые прямо коррелировали с динамикой раневого процесса и реагировали на изменения в течение 4-6 часов (повторное снижение НСТ-р совместно с МП-р при повышении НСТ-п, свидетельствующие о патологии кислородзависимых механизмов бактерицидности нейтрофилов и (или) гуморального звена фагоцитарной системы), в то время как в периферической крови статистически достоверные различия в динамике показателей отмечались лишь при тяжелых гнойно-септических осложнениях и в более поздние сроки (табл. 1, фиг. 1).

2. Миелопероксидаза. На первые сутки послеоперационного периода у всех больных отмечалось значительное снижение уровня миелопероксидазы в клетках, сопровождающееся выбросом кристаллов фермента за пределы нейтрофила (МП-р с 2.38±0.02 унижался до 1.56±0.06, МП-п с 2.46±0.02 до 2.01±0.02 соответственно), что являлось результатом бактерицидного и антитоксического действия нейтрофила в ответ на операционную травму, причем наиболее выражены эти изменения были в ране (МП-р). В последующие сутки послеоперационного периода при неосложненном течении происходило неуклонное возрастание уровня МП в клетке (на 7-е сутки МП-р 2.58±0.01, МП-п 2.55±0.02), которое находилось в обратной зависимости от уровня бактериальной обсемененности ран.

При торпидном течении раневого процесса, при бареактивных состояниях или при возникновении гнойных осложнений выравнивания показателя МП-р не отмечалось в течение длительного промежутка времени (табл. 2, фиг. 2).

3. Эффективная концентрация альбумина. Альбумин играет большую роль в связывании различных токсических низко- и среднемолекулярных органических веществ, поступающих в кровь, выступая, тем самым, в качестве важного звена дезинтоксикационной системы организма. Эта способность реализуется благодаря наличию в молекуле альбумина нескольких активных центров, предназначенных для связывания различных токсических веществ. При соединении токсических метаболитов с альбумином количество свободных активных центров в молекуле уменьшается, приводя к снижению эффективной концентрации альбумина.

Таким образом, этот показатель можно использовать для оценки общей интоксикации организма.

Измерение флуоресценции может быть произведено на любом флуометре, имеющем длину волны возбуждения в области 410-450 нм и длину волны регистрации флуоресценции в области 510-550 нм.

В наших исследованиях использовался анализатор AKЛ-01 "ЗОНД-3". Калибровка анализатора осуществляется с помощью флуоресцентных калибраторов, входящих в комплект прибора, и результат измерения представляется на цифровом индикаторе прибора уже в единицах эффективной концентрации альбумина (ЭКА, г/л).

В результате проведенных исследований нами получены следующие результаты (табл. 3, фиг. 3). В течение первых трех суток с момента операции общая концентрация в крови и в гнойном очаге активных альбуминовых центров у всех больных находилась примерно на одном уровне: ЭКА-п 60.0±3.52 г/л; ЭКА-р - 20.1±3.43 г/л (P<0.001). В дальнейшем, в зависимости от течения раневого процесса, динамика показателей ЭКА в периферической крови и, особенно в ране, существенно отличалась. При неосложненном течении раневого процесса колебания показателя ЭКА-п в течение всего периода наблюдения были несущественны, постепенно повышаясь от 60 до 64.7 г/л к 9-м суткам наблюдения (P>0.05), при переходе дегенеративно-некротической и дегенеративно-воспалительной фаз в регенераторную у больных отмечался достаточно резкий подъем показателя ЭКА-р, который к концу периода наблюдения приближался к показателям ЭКА в кубитальной вене (61.3±3.11 г/л). Наиболее наглядным была динамика показателя ЭКА при торпидном и осложненном течении раневого процесса, причем наиболее информативными были эти показатели в раневом барьере, которые в более ранние сроки и в большей степени реагировали на возникновение гнойных осложнений, в то время как в периферической крови существенное снижение ЭКА наблюдалось лишь при наличии у больного тяжелой гнойной интоксикации.

В периферической крови в таких случаях ЭКА-п составляла 40.3±3.18 г/л в первые сутки, достигая 43.5±3.22 г/л на 9-е сутки, в то время как в ране ЭКА-р прогрессивно снижалась с 1-х по 5-е сутки при возникновении несанированных септических гнойников, постепенно повышаясь до 14±3.31 г/л на 9-е сутки после их вскрытия.

Прослежена прямая корреляционная взаимосвязь (г=0.87) динамики показателей эффективной концентрации альбумина с цитохимическими показателями нейтрофильных лейкоцитов, характеризующих их бактерицидно-антитоксический потенциал (НСТ-р-тест, миелопероксидаза), обратная корреляционная связь с НСТ-п-тестом (г=0.91).

4. Анизотропия хроматина клеточных ядер лейкоцитов. Физико-химическое состояние хроматина ядер лейкоцитов является важным критерием оценки функционального состояния клетки в целом. Увеличение доли конденсированного хроматина свидетельствует о снижении функциональной активности клеток, а ее снижение является признаком обратных процессов. Степень конденсации хроматина можно определить путем измерения анизотропии хроматина клеточных ядер, возникающей после их окраски толуидиновым синим при pH 5.0. При сравнительном изучении анизотропии ядер нейтрофильных лейкоцитов, полученных из периферической крови и раневого отделяемого хирургических больных, было установлено, что на первые сутки послеоперационного периода наблюдается статистически достоверное снижение анизотропии хроматина ядер сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов, полученных из операционной раны по сравнению с аналогичными клетками периферической крови этих же больных (табл. 4, фиг. 4).

Полученные данные свидетельствуют, что у обследованных больных имеет место активация тканевого пула сегментоядерных нейтрофилов.

Таким образом, сравнительный анализ различных показателей гомеостаза в периферической крови и в ране позволяет повысить информативность этих методов при оценке функционального состояния раневых барьеров и прогнозировании течения раневого процесса.

Пример.

Больной В. - 57 лет (история болезни N 32578) поступил в клинику 24.04.96 г. Через 10 суток с момента заболевания с постинъекционным абсцессом правой ягодичной области. Из анамнеза установлено, что 14.04.96 г. в условиях поликлиники 5 дней назад была произведена внутримышечная инъекция реопирина по поводу остеохондроза поясничного отдела позвоночника.

Состояние при поступлении относительно удовлетворительное. Больной повышенного питания. Температура тела 38,2^oC. Пульс 90 ударов в минуту удовлетворительных качеств. АД = 160/90 мм рт.ст. При осмотре незначительная гиперемия и инфильтрация в верхне-наружном квадрате правой ягодичной области (20 х 10 см). Анализ крови: эритроциты - 4,3 т/л, лейкоциты - 9,0 г/л, палочкоядерные - 9%, сегментоядерные - 77%, лимфоциты - 12%, моноциты - 2%, СОЭ - 27 мм/час, сахар крови - 5,5 ммоль/л.

24.04.96 г. под внутривенным обезболиванием (сомбревин) через центр инфильтрата размером до 20 см вскрыт абсцесс - получено до 100 мл гноя (бактериологический посев - золотистый стафилококк в ассоциации с кишечной палочкой). При ревизии установлено, что полость абсцесса размером 16х18х4 см имеет многокамерное строение. Лечение проводилось с обработкой гнойного очага низкочастотным ультразвуком, однако существенного улучшения общего самочувствия больного не наблюдалось.

На 3-й сутки послеоперационного периода у больного повторно отмечался повышение температуры тела до 38^oC. Проведенные исследования дали следующие результаты: МП-п - 2.51 у.е. (исходный уровень - 2.46 у.е.), МП-р - 1.64 у. е. (исходный уровень - 2.38 у. е.); НСТ-п - 2.16 у.е. и 2.12 у.е. соответственно, НСТ-р - 1.67 у.е. и 1.98 у.е. соответственно; ЭКА-п - 30.43 г/л и 40.35 г/л соответственно; ЭКА-р - 9.91 г/л и 21.11 г/л соответственно (фиг. 5). Таким образом, приведенные результаты исследований свидетельствуют: в гнойном очаге на 3-й сутки отмечается резкое снижение ЭКА-р, МП-р, НСТ-р, свидетельствующее о наличии несанированного гнойного очага и прогрессирующей декомпенсации бактерицидно-антитоксического потенциала нейтрофильных, лейкоцитов непосредственно в гнойном очаге, в то время как в периферической крови эти изменения запаздывают на сутки и цитохимические показатели говорят о еще сохранившейся компенсации макроорганизма и отсутствии опасности генерализации гнойного процесса. На основании имеющихся результатов можно выбрать лечебную тактику к каждому конкретному больному.

28.04.96 г. выполнена повторная ревизия гнойного очага, выявлен глубокий гнойный карман. Наложена контрапертура и установлен дренаж для аспирационно-промывного дренирования.

На восьмые сутки от момента операции раневой дефект закрыт вторичным натяжением, дренаж удален. Больной выписан на 10 сутки от момента поступления с хорошим косметическим ффектом.

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в гнойно-септической хирургии для прогнозирования течения раневого процесса и ранней диагностики гнойно-септических осложнений. У пациента с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей исследуют показатели периферической крови, характеризующие функциональное состояние макроорганизма, причем показатели в периферической крови определяют одновременно с показателями крови, взятой из раны. Устанавливают корреляционную взаимосвязь между этими показателями и при обнаружении обратной корреляционной взаимосвязи прогнозируют торпидное или осложненное течение раневого процесса, а при прямой корреляционной взаимосвязи - неосложненное течение раневого процесса. Способ обеспечивает раннюю диагностику гнойно-септических осложнений и прогнозирование течения раневого процесса, которые, в свою очередь, позволяют существенным образом улучшить результаты лечения больных с гнойной хирургической патологией. 5 ил., 4 табл.

Способ прогнозирования течения раневого процесса при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей, включающий исследование показателей периферической крови, характеризующих функциональное состояние макроорганизма, отличающийся тем, что показатели в периферической крови и в крови, взятой из раны, определяют одновременно, устанавливают коррелляционную взаимосвязь между этими показателями и при обратной коррелляционной взаимосвязи прогнозируют торпидное или осложненное течение раневого процесса, а при прямой коррелляционной взаимосвязи - неосложненное течение раневого процесса.