СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ТРОМБОЦИТАРНОГО ЗВЕНА ГЕМОСТАЗА ПРИ ИНФЕКЦИОННОЙ ПАТОЛОГИИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины, в частности к оценке функционального состояния кровяных пластинок в зависимости от степени агрегации тромбоцитов.

Известен способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии, при котором отбирают кровь у больного путем пункции локтевой вены (самотеком) в смеси с раствором цитрата натрия, затем получают основную концентрацию аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида и снимают прямую зависимость степени агрегации тромбоцитов от концентрации аденозиндифосфата у здоровых лиц и у больного. (Kenneth K.Wu. Platelet activation mechanisms and markers in arterial thrombosis. J.of Internal Medicine, 1996. V 239, N 1-P6 17-34).

Недостатком аналога является невозможность выявить порог чувствительности тромбоцитов при различных патологических состояниях и фазах заболевания.

Известен способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза, при котором отбирают кровь у больного путем пункции локтевой вены смеси с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, в получении обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрофугирования, подготовке бестромбоцитарной плазмы для настройки агрегометра, в получении основной концентрации аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида и снятии агрегационной кривой натрия (Лычев В.Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. М. Медицина, 193,53-56).

В формировании внутрисосудистого тромбообразования тромбоциты играют существенную патогенетическую роль. По существу в него вовлечено такое разнообразие биологически активных веществ, которое делает проблему управляемости тромбоцитарного гемостаза одной из сложнейших клинико- фармакологических задач. Однако в этой работе, посвященной нарушениям гемостаза при различных патологических процессах, не проводится изучение морфофункциональной активности кровяных пластинок. Невозможно выявить порог чувствительности при различных патологических состояниях и фазах заболевания.

Данное изобретение устраняет недостатки и аналога, и прототипа.

Техническим и медицинским результатом данного изобретения являются:
- получение двухволновой агрегатограммы при различных подпороговых значениях концентрациях аденозиндифосфата, что позволяет выявить интенсивность агрегационной активности клеток;
- диагностика нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни;
- выявление характера и степени нарушений в клеточном звене гемостаза в зависимости от формы, тяжести течения и лечения болезни;
- определение интервала, при котором регистрируется двухволновая агрегатограмма, характеризующая состояние гранулярного аппарата кровяных пластинок;
- обоснование применения лекарственных средств, корректирующих функциональную активность кровяных пластинок.

Технический и медицинский результаты достигаются тем, что в способе диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии, заключающемся в том, что в отборе крови у больного путем пункции локтевой вены в смеси с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, в получении обогащенной тромбоцитами плазмы путем цетрифугирования, подготовке бестромбоцитарной плазмы для настройки агрегометра, в получении основной концентрации аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида натрия и снятии агрегационной кривой, основную навеску аденозиндифосфата уменьшают в 10 и 100 раз, а агрегационную активность тромбоцитов исследуют в течение 45-60 минут после забора крови, регистрируют двухволновую агрегатограмму, по которым оценивают нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни.

Сущность изобретения поясняется на различных примерах, приведенных в таблицах 1-5 и на фиг.1 и фиг.2. Во всех таблицах приняты единые обозначения, где:
n - число наблюдений,
p- интервал достоверности,
^* - p < 0,05 (95%)
^** - p < 0,01 (99%)
^*** - p < 0,001 (99,9 %)
А - группа A,
Б - группа Б
B - группа больных,
N - число наблюдений,
M±m-M - средняя величина: m - средняя ошибка.

На фиг. 1 приведены формы агрегационных кривых в контроле (у здоровых лиц) в зависимости от концентрации используемого индуктора (аденозиндифосфата).

На фиг.2 показана агрегация тромбоцитов у больных генерализованной формой иерсиниозов, индуцированная разными дозами аденозиндифосфата (АДФ) в различные периоды болезни.

По оси ординат отложена частота регистрации двухфазной кривой (в процентах).

При осуществлении способа кровь исследуемого забирается путем пункции локтевой вены (самотеком) в пластиковую пробирку в смеси с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Для получения богатой тромбоцитами плазмы кровь центрифугируется на малых оборотах (100g) в течение 15 минут. Производится отбор богатой тромбоцитами плазмы в селиконовую пробирку. Оставшаяся кровь центрифугируется в течение 15 минут при 2000g для получения бестромбоцитарной плазмы, которая используется для настройки агрегометра и для получения необходимой концентрации кровяных пластинок в плазме, используемой в исследовании. Для исследования агрегационной способности тромбоцитов необходима плазма с содержанием тромбоцитов 250-300•10⁹/л.

Для получения основной концентрации (10 мкг/мл=2•10^-5М) сухую навеску АДФ (аденозиндифосфат) разводили физиологическим раствором хлорида натрия (0,9%). Эта концентрация АДФ использовалась как базисная для изучения агрегационной способности клеток у больных и здоровых лиц. Однако эта концентрация не дает полного представления об агрегационной активности тромбоцитов, т.к.:
- при использовании этой концентрации обычно не удается получить двухволновую агрегатограмму;
- при ряде патологических состояний использование этой концентрации АДФ не позволяет выявить истинную интенсивность агрегационной активности кровяных пластинок;
- одна высокая концентрация АДФ (2•10^-5М) не позволяет выявить порог чувствительности тромбоцитов при различных патологических состояниях и фазах заболевания.

В связи с этим для более полной оценки функциональной способности тромбоцитов применяли следующие концентрации АДФ: 2•10^-6 (1 мкг/мл) и 2•10^-7М (1 мкг/мл), разводя базисный раствор АДФ (2•10^-5М) соответственно в 10 и 100 раз. При необходимости производили промежуточные разведения индуктора: 1•10^-5М (5 мкг/мл), 0,5•10^-5М (2,5 мкг/мл), 1-10^-6М (0,5 мкг/мл), 2•10^-8М (0,01 мкг/мл). Исследования агрегационной активности тромбоцитов необходимо проводить в течение 45-60 мин после забора крови.

При ряде инфекционных заболеваний (менингоковая инфекция, дифтерия, вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция, кишечные инфекции и др.) отмечаются манифестные клинические проявления гемокоагуляционных нарушений: выраженная геморрагическая сыпь на коже, кровоизлияния под слизистые оболочки, внутренние органы. Молниеносное развитие и глубина нарушений в системе гемокоагуляции, приводящие к клинически выраженным нарушениям микроциркуляции, в том числе к кровоизлияниям в склеру и слизистые оболочки, носовым и желудочным кровотечениям, множественным геморрагиям на коже, выявляются при тяжелом течении инфекционных заболеваний, особенно в случае развития токсикоинфекционного шока (ТИШ) и острой печеночной недостаточности.

Изучение связи между тяжестью болезни, клиническими проявлениями гемокоагуляционных нарушений и степенью изменения тестов гемостаза позволило выявить зависимость между выраженностью геморрагических проявлений у больных менингококковой инфекцией в момент поступлений больных в стационар и агрегационной способностью тромбоцитов.

Вместе с тем, даже у больных ВИЧ-инфекцией, когда заболевание развивается в течение нескольких лет, нарушения системы гемостаза с клинической манифестацией геморрагического синдрома имеют место, начиная со стадии первичных проявлений 2Б, при отсутствии клинической симптоматики иммунодефицита (табл.1).

Общеизвестно, что ведущую роль в возникновении и развитии тромбогеморрагических нарушений при ряде патологических состояний играет изменение морфофункциональных свойств тромбоцитов. В то же время, нарушения функциональной активности кровяных пластинок с использованием стандартной концентрации АДФ (2•10^-5М), даже при наличии клинических проявлений в системе гемостаза, мы обнаружили только при тяжелом течении болезни. Так, агрегационная активность тромбоцитов (концентрация АДФ - 2•10^-5М) была снижена только у больных ВИЧ-инфекцией на стадиях вторичных заболеваний (3А-3Б), причем максимально низкая величина агрегации зарегистрирована у лиц на стадии 3В (63.4%) от значений здоровых лиц.

Особенно четко вывялено истинное изменение активности тромбоцитов при использовании теста регистрации агрегационной способности тромбоцитов под действием разных доз АДФ (2•10^-8М).

Использование подпороговой концентрации АДФ (2•10^-6М) позволило выявить снижение агрегационной активности у 80-90 % больных ВИЧ-инфекцией на всех стадиях заболевания. При этом, у всех больных средняя величина агрегации была также значительно снижена от 60,8% (стадии 2Б-2В) до 48,5-50,7% (стадии 3Б-3В).

Аналогичные изменения выявлены у больных пищевыми токсикоинфекциями, иерсиниозом и дифтерией: истинное повышение или снижение агрегационной активности тромбоцитов обнаруживалось в большом проценте случаев при применении низких (подпороговых) доз АДФ (1•10^-6 - 2•10^-8 М) (таблица 3).

Так, у больного К., 16 лет (и/б N 15442), находившегося на лечении в КИБ N 2 г. Москвы с диагнозом: Иерсиниоз, генерализованная форма, смешанный вариант, тяжелое течение, наблюдали следующую динамику тромбоцитов: в периоде разгара болезни - использование стандартной дозы АДФ выявляло снижение агрегации клеток (64,7%; контроль - 100%), тогда как подпороговые концентрации (2•10^-7М) выявили высокий порог чувствительности к индуктору (188,2%; контроль - 100%); к моменту выписки из стационара - на стандартной концентрации АДФ (2•10^-5 М) величина агрегации клеток приближалась к значениям контроля (81%), тогда как применение подпороговой концентрации АДФ выявило сохраняющийся высокий порог чувствительности кровяных пластинок (164,7%).

Таким образом, использование подпороговых концентраций АДФ позволяет диагностировать истинные нарушения в клеточном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. Так у больных с локализованной формой дифтерии нарушения в клеточном звене гемостаза на всем протяжении госпитального периода выявляются только при использовании низких доз АДФ (2•10^-6 - 2•10^-7 М) Данные приведены в таблице 4.

Но и у пациентов с токсической дифтерией II-III степени тяжести, поступивших в стационар в течении 48 часов от начала заболевания, удавалось зарегистрировать ТГ-синдром еще на стадии гиперкоагуляции, тогда как у пациентов, госпитализированных спустя 82 часа от начала болезни, имела самые ранние сроки болезни, имело место поражение кровяных пластинок: снижение количества тромбоцитов и способности их к агрегации (таб.5). Приведенные в таблицах примеры показывают, что использование подпороговых концентраций АДФ позволяет установить степень и фазу нарушений в тромбоцитарном звене гемостаза у больных с инфекционной патологией.

Использование изобретения дает возможность оценивать функциональную активность гранулярного аппарата кровяных пластинок по регистрации второй волны агрегации, обусловленной реакцией освобождения. Так, у больных иеросиниозами в периоде разгара заболевания двухфазные агрегационные кривые в 55-60% случаев регистрировались при концентрациях АДФ в пределах от 2•10^-7 до 2•10^-8М, в то время как у здоровых лиц вторая волна агрегации начинала выявляться лишь при концентрации АДФ 0,4•10^-6 М.

При применении различных концентраций АДФ от 2•10^-5 до 2•10^-7М было обнаружено, что у больных ВИЧ-инфекцией для получения второй волны агрегации (высвобождение АДФ из плотных гранул тромбоцитов) необходимы более высокие, по сравнению со здоровыми лицами, концентрации индуктора (2•10^-6М), что указывает на снижение порога чувствительных клеток к АДФ и истощение их гранулярного аппарата. Отсутствие этой волны - характерная черта ряда истинных тромбоцитопатий либо серьезного повреждения клеток в условиях эндотоксинемии (таблицы 2,4,5).

Таким образом, данное изобретение, основанное на использовании подпороговых концентраций АДФ, дает возможность диагностировать нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. Использование набора пороговых и подпороговых концентраций АДФ выявляет характер и степень нарушений в клеточном звене гемостаза в зависимости от формы, тяжести течения и периода болезни, а также дает возможность определить интервал, при котором фиксируют двухволновую агрегатограмму, характеризующую состояние гранулярного аппарата кровяных пластинок.

Перечисленные факторы обосновывают применение лекарственных средств, коррегирующих функциональную активность кровяных пластинок.

Изобретение относится к области медицины, в частности к диагностике нарушений тромбоцитарного звена гемостаза. Способ заключается в том, что при отборе крови у больного путем пункции локтевой вены в смеси с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 получают обогащенную тромбоцитами плазму путем центрифугирования, подготавливают бестромбоцитарную плазму для настройки агрегометра, получают основную концентрацию аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида натрия и снимают агрегационную кривую, основную навеску аденозиндифосфата уменьшают в 10 и 100 раз, а агрегационную активность тромбоцитов исследуют в течение 45-60 мин после забора крови, регистрируют двухволновую агрегатограмму, по которой оценивают нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. Способ обеспечивает диагностику нарушений в тромбоцитарном звене гемостаза на ранних стадиях болезни. 2 ил., 5 табл.

Способ диагностики нарушений тромбоцитарного звена гемостаза при инфекционной патологии, заключающийся в отборе крови у больного путем пункции локтевой вены, в смеси крови с раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, в получении обогащенной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования, в подготовке бестромбоцитарной плазмы для настройки агрегометра, в получении основной концентрации аденозиндифосфата путем разведения сухой навески аденозиндифосфата в физиологическом растворе хлорида и снятии агрегационной кривой, отличающийся тем, что исследуют агрегационную активность тромбоцитов под действием доз аденозиндифосфата в пределах от 10^-5 до 10^-8М, регистрируют двухволновую агретограмму, по которой оценивают нарушения в тромбоцитарном звене гемостаза на разных стадиях болезни.