СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМИНОВОЙ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится, в частности к коагулологии, и может быть использовано для диагностики степени активности плазминового фибринолиза.

Известен способ определения фибринолитической активности, включающий взятие цельной крови, образование сгустка, инкубацию его в цитратно-ацетатном буфере, удаление сгустка из среды, центрифугирование и расчет показателя (Иванов Е.П. Руководство по гемостазиологии. -Минск, Беларусь, 1991). Однако данный способ непригоден для определения плазминовой фибринолитической активности крови.

Известен "Способ диагностики гиперфибринолиза". А.С. СССР N 1675777, G 01 N 33/86, 1989 г.

Способ заключается в том, что образовавшийся сгусток отслаивают от стенок пробирки и переносят в аутологичную сыворотку, не содержащую форменных элементов и после инкубации сгустка определяют количество выделившихся из него форменных элементов, а в качестве контроля используют пробу крови, в которой фибринолитическая активность ингибирована ε-аминокапроновой кислотой, рассчитывают показатель спонтанного фибринолиза.

Однако известный способ, в основном, применяется для определения гиперфибринолиза; он также имеет и другой недостаток - наличие значительных погрешностей при определении, что делает использование данного метода менее ценным. Самое важное заключается в том, что при этом невозможно дать заключение о состоянии плазминовой системы в целом, если не получены данные исследований суммарного фибринолиза и влияния ингибиторов плазмина, в том числе и комплекса гепарин-антитромбин III. Суммарно, при проведении исследований вышеуказанным способом не происходит дифференциального разделения определения фракций фибринолиза, в том числе и плазмина, что в конечном счете не обеспечивает высокую точность анализов.

Изобретение направлено на создание способа определения плазминовой фибринолитической активности крови.

Это достигается тем, что исследуемую пробу крови помещают в раствор протамин-сульфата на вероналовом буфере, инкубируют, образовавшийся сгусток удаляют, измеряют оптическую плотность полученного гемолизата и контрольной пробы крови при длине волны 540-550 нм, а плазминовую фибринолитическую активность определяют отношением оптической плотности гемолизата к оптической плотности контрольной пробы, причем в качестве контрольной пробы используют пробу крови с тем же количеством раствора протамин-сульфата без инкубации.

Сущность заявленного изобретения заключается в том, что протамин-сульфат, являясь ингибитором гепарина и его комплексных соединений, блокирует действие комплекса гепарин-антитромбин III, обладающим мощным антиплазминовым действием. /Д. М.Зубаиров. "Биохимия свертывания крови", -М., Медицина, 1978, с. 138; В.С.Ефимов. "Фармакология и токсикология", 1968, т.31, N 5, с. 601-604/. При использовании протамин-сульфата в качестве инкубационной среды происходит устранение ингибирующего действия комплекса гепарин-антитромбин III на плазминовую активность, показатель активности плазмина становится выше показателя суммарного фибринолиза, то есть предлагаемый способ отражает истинное соотношение противодействующих сил гемостаза, что позволяет полнее и дифференцированнее разъяснять суть происходящего процесса гемокоагуляции с учетом всех его факторов.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь для использования, взятую из вены без консервантов, помещают в три пробирки с раствором протамин-сульфата и вероналовом буфере. Пробирки 1 и 2 инкубируют на водяной бане при температуре 37^oC в течение 3 часов.

Образовавшийся после инкубации сгусток промывают физиологическим раствором и удаляют. К оставшемуся гемолизату добавляют 0,04% раствор аммиака и содержимое пробирок 1 и 2 смешивают и определяют оптическую плотность гемолизата и контрольной пробы крови в пробирке 3, с тем же количеством протамин-сульфата на вероналовом буфере без инкубации на ФЭК при зеленом светофильтре при длине волны 540-550 нм и кювете 0,5 см и рассчитывают плазминовую фибринолитическую активность:

Использование приема смешения содержимого пробирок 1 и 2 предлагается для более точного определения ПФА.

Рабочий раствор протамин-сульфата готовится на вероналовом буфере - 1 мл раствора Михаэлиса смешивают с 0,015 мл 1% раствора протамин-сульфата.

Пример: больная А-А, диагноз: киста печени. Во время операции имела место сильная кровоточивость операционной раны. Кровь взята из вены широкой иглой в количестве 3 мл в сухую силиконированную центрифужную пробирку и немедленно разлита в заранее приготовленные пробирки с растворами таким образом: пробирки 1, 2, 3, 4 - по 0,2 мл в пробирки 5-6 /контроль/ по 0,02 мл. В пробирках 1, 2 и 5, содержащих физиологический раствор хлористого натрия, определяется суммарная фибринолитическая активность крови, а в пробирках 3, 4 и 6, содержащих протамин-сульфат - плазминовую фибринолитическую активность.

Пробы 1, 2, 3 и 4 инкубированы при 37^oC в течение 3-х часов, к ним прилиты по 0,5 мл раствора хлористого натрия. Образовавшиеся сгустки после инкубации промыты физраствором, отжаты стеклянной палочкой и удалены. К оставшейся после удаления сгустков жидкости добавлены по 3,5 мл 0,04% раствора аммиака, после смешения 1 и 2 пробирок измерена оптическая плотность этой смеси против раствора 5 на ФЭК при зеленом светофильтре, при длине волны 540 нм и кювете 0,5 см. Расчет суммарного фибринолиза в %:

Для определения плазминовой активности содержимое пробирок 3 и 4 колориметрируют в тех же условиях против содержимого пробирки 6 и вычисляют плазминовую активность в %:

Описанным способом исследована кровь у 17 здоровых доноров, а затем проведено определение у больных желчно-каменной болезнью.

Результаты приведены в таблицах N 1 и 2.

Из таблиц видно, что показатели плазминовой активности выше показателей суммарного фибринолиза, что указывает на угнетение суммарного фибринолиза у больных желчно-каменной болезнью и высокую плазминовую активность на фоне депрессии суммарной фибринолитической активности крови.

Таким образом, предлагаемый способ имеет преимущество благодаря простоте, доступности и высокой специфичности и может быть применим в клинической практике для оценки функции плазминовой системы.

Изобретение относится к медицине, в частности к гемокоагулологии, и может быть использовано для диагностики степени активности плазминового фибринолиза. Исследуемую пробу крови помещают в раствор протамин-сульфата на вероналовом буфере, после инкубации образовавшийся сгусток удаляют и измеряют оптические плотности полученного гемолизата и контрольной пробы крови. Плазминовую фибринолитическую активность определяют отношением оптической плотности гемолизата к оптической плотности контрольной пробы, причем в качестве контрольной пробы используют пробу крови с тем же количеством раствора протамин-сульфата без инкубации. Предлагаемый способ более прост в исполнении, более доступен и обладает высокой специфичностью. 2 табл.

Способ определения плазминовой фибринолитической активности крови путем взятия крови, использования исследуемой и контрольной проб, инкубации пробы и образования сгустка, отличающийся тем, что в используемые пробы вводят равное количество раствора Михаэлиса, смешанного с 1%-ный раствором протамин-сульфата в соотношении 1 : 0,015, после чего проводят инкубацию исследуемой пробы и удаление из нее образовавшегося сгустка, затем определяют оптическую плотность полученного гемолизата исследуемой пробы и контрольной пробы крови и по отношению оптической плотности гемолизата к оптической плотности контрольной пробы определяют плазминовую фибринолитическую активность.