СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЛОЖНОГО НИТРОФЕНОЛЬНОГО ПРЕПАРАТА "НИТРАФЕН" В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения нитрафена, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсилогических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ кислого характера (к которым относятся и нитрофенольные компоненты нитрафена) в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, обработке водным раствором гидроксида натрия, центрифугирования, обработке центрифугата вольфраматом натрия в кислой среде при кипячении на водяной бане, отделении осадка центрифугированием в течение получаса, экстракционном выделении анализируемых соединений из центрифугата эфиром с последующим подщелачиванием центрифугата и повторной экстракцией эфиром (Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ.- Киев: Вища школа, 1982. -С. 123-124).

Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения суммы нитрофенольных компонентов нитрафена.

Известен способ определения суммы алкилдинитрофенольных соединений (каратана) в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, неоднократной ее обработки порциями гексана каждый раз в течение 30 минут, отделения гексановых извлечений, их объединения и упаривания до сухого остатка с последующим растворением остатка в легколетучем органическом растворителе, хроматографирования в тонком слое силикагеля в системе растворителей гексан - ацетон (4:1) (Лабораторные исследования в ветеринарии. Химико-токсикологические методы /Под ред. Б. И. Антонова. -М.: Агропромиздат, 1989. -С. 167-168).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью и селективностью.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения нитрафена (комплекса моно- и динитроалкилфенолов) в биологическом материале путем измельчения биологической пробы, однократной обработки ее порцией ацетона в течение 30 минут, центрифугирования, отделения центрифугата и упаривания его в струе теплого воздуха до сухого остатка, растворения остатка в хлороформе, экстракции хлороформного раствора аммиачным раствором с pH 9,0 - 10,0, отделения водно-щелочного извлечения, подкисления его хлороводородной кислотой до pH 2,0, экстракции диэтиловым эфиром с последующим упариванием эфирного экстракта до незначительного объема и хроматографированием в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ - гексан - этилацетат (2:7:1) (Никитин П.В., Ивкин А.А., Баринов Е.Х. Случай острого перорального отравления препаратом "Нитрафен"// Судебно-медицинская экспертиза. -1996. -Т.39, N 1. -С.33-35 (прототип)).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью и селективностью.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и селективности определения.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, двукратно обрабатывают ацетоном (каждый раз в течение 45 минут), ацетоновые извлечения объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в смеси растворителей хлороформ-гексан (7: 4), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы хлороформ - гексан (7:4), фракции элюата, содержащие сумму нитрофенолов нитрафена, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1).

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую нитрафен, измельчают, дважды настаивают с ацетоном (каждый раз в течение 45 минут), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в смеси растворителей хлороформ - гексан (7:4), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы хлороформ - гексан (7:4), фракции элюата, содержащие сумму нитрофенолов нитрафена, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1) и хроматографируют методом ВЭЖК в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
Качественное определение нитрафена в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 2 по 75 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 2 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 260 нм. Качественное определение отдельных нитрофенольных компонентов нитрафена осуществляют по величинам характерных объемов или времени удерживания.

Общий вид хроматограммы суммы нитрофенолов препарата "Нитрафен" при определении методом ВЭЖХ представлен на чертеже. Первый пик (с наименьшим временем удерживания) на хроматограмме соответствует выходу растворителя, остальные пики соответствуют нитрофенольным компонентам нитрафена.

Значения объемов и времени удерживания нитрофенольных компонентов препарата "Нитрафен" указаны в таблице 1.

Пример 2
Количественное определение 2-нитро-4-метилфенола (компонента нитрафена) в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 2 по 5 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 26 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 4,76 мин (объемом удерживания 238 мкл) соответствует 2-нитро-4-метилфенолу.

Количественное содержание 2-нитро-4-метилфенола определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску нитрафена, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 0,625, 1,25, 2,50, 3,75 и 5,00 мл 0,02% раствора 2-нитро-4-метилфенола в смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и доводят объем раствора в каждой колбе до метки смесью растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64x2 мм с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5: 1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,02 - 0,16 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S = 36,7622•C - 0,1602,
где S - площадь хроматографического пика, см²;
C - концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 2-нитро-4-метилфенола в ткани печени представлены в таблице 2.

Пример 3
Количественное определение 2-метил-4,6-динитрофенола (компонента нитрафена) в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 8 по 18 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 25 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 4 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 264 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 7,40 мин (объемом удерживания 370 мкл) соответствует 2-метил-4,6-динитрофенолу.

Количественное содержание 2-метил-4,6-динитрофенола определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску нитрафена, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 0,625, 1,25, 2,50, 3,75, 5,00 и 7,50 мл 0,02% раствора 2-метил-4,6-динитрофенола в смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и доводят объем раствора в каждой колбе до метки смесью растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64x2 мм с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 264 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,02 - 0,24 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S = 56,6001•C - 0,1096,
где S - площадь хроматографического пика, см²;
C - концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 2-метил-4,6-динитрофенола в ткани печени представлены в таблице 3.

Пример 4
Количественное определение 4-метил-2,6-динитрофенола (компонента нитрафена) в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 40 мг нитрафена, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 16-18^oC. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл ацетона и выдерживают 45 минут, периодически перемешивая. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Вытяжки объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC, остаток растворяют в 10 мл смеси растворителей хлороформ - гексан (7: 4). 2 мл полученного раствора вносят в колонку размером 490x11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100μ. Хроматографирование осуществляют, используя в качестве элюента систему растворителей хлороформ - гексан (7:4). Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 18 по 38 включительно объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 16-22^oC. Остаток растворяют в 25 мл смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5: 1). 8 мкл полученного раствора вводят в жидкостный хроматограф типа "Милихром". Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 64x2 мм, заполненной сорбентом с гидроксилированной поверхностью "Силасорб-600", используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 9,92 мин (объемом удерживания 496 мкл) соответствует 4-метил-2,6-динитрофенолу.

Количественное содержание 4-метил-2,6-динитрофенола определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску нитрафена, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 50 мл вносят 0,625, 1,25, 2,50, 3,75 и 5,00 мл 0,02% раствора 4-метил-2,6-динитрофенола в смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1) и доводят объем раствора в каждой колбе до метки смесью растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40:5:1). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64x2 мм с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан - диоксан - пропанол-2 (40: 5:1). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/ч. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,02 - 0,16 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
S = 49,0294•C - 0,0804,
где S - площадь хроматографического пика, см²;
C - концентрация определяемого вещества в анализируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 4-метил-2,6-динитрофенола в ткани печени представлены в таблице 4.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 5 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2 - 10 раз - в ткани печени, в два раза увеличивает степень извлечения отдельных нитрофенольных компонентов нитрафена из ткани печени (для 2-метил-4,6-динитрофенола степень извлечения возрастает с 3,75 до 7,65%), характеризуется более высокой селективностью (позволяет выделить 18 компонентов нитрафена, прототип - только 9).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 5.

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения "Нитрафена", и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Анализируемую пробу измельчают, двукратно обрабатывают ацетоном (каждый раз в течение 45 мин). Ацетоновые извлечения объединяют, экстрагент испаряют в токе воздуха при 16-22°С, остаток растворяют в смеси растворителей хлороформгексан (7: 4), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием подвижной фазы хлороформ - гексан (7:4). Фракции элюата, содержащие сумму нитрофенолов нитрафена, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40: 5:1) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40: 5: 1). Способ обеспечивает повышение чувствительности и селективности определения. 5 табл. , 1 ил.

Способ определения сложного нитрофенольного препарата "Нитрафен" в биологическом материале путем измельчения пробы, обработки ацетоном, отделения извлечения, испарения экстрагента, получения остатка, его растворения в органическом растворителе и хроматографирования в сорбенте на основе силикагеля с гидроксилированной поверхностью, отличающийся тем, что обработку биологической ткани ацетоном проводят двукратно (каждый раз в течение 45 мин), испарение ацетона осуществляют при 16 - 22^oС, остаток растворяют в смеси растворителей хлороформгексан (7 : 4), хроматографируют в колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента системы растворителей хлороформ-гексан (7 : 4), фракции элюата, содержащие сумму нитрофенолов "Нитрафена", объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в системе растворителей гексан-диоксанпропанол-2 (40 : 5 : 1) и хроматографируют методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом "Силасорб-600", используя в качестве элюента систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (40 : 5 : 1).