СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЛЬТАМЕТРИНА И ЛЯМБДА-ЦИГАЛОТРИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораториях. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение суток), объединения вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления водой с последующей экстракцией анализируемых соединений сначала из кислого, а затем из щелочного растворов (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.119-123).

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина.

Известен способ определения лямбда-цигалотрина ((R,S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(±;цис)-3-[(2)-2-хлоро-3,3,3,-тритрифторпропенил]-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата) в биологическом материале (ткани трупной печени человека), заключающийся в том, что биологическую пробу измельчают, настаивают по 1 часу с порциями диоксана, каждая из которых в 2 раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение упаривают в токе воздуха, доводят до определенного объема диоксаном, часть извлечения наносят на хроматографическую пластину с гидроксилированным сорбентом («Силуфол» UV-254), хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-хлороформ, взятых в соотношении 1:1 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента ацетонитрилом, часть элюата наносят на хроматографическую пластину с обращеннофазовым сорбентом (пластина «Силуфол» UV-254, обработанная вазелиновым маслом), хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей диоксан-вода, взятых в соотношении 8:2 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемые вещества элюируют из сорбента этанолом, а элюат фотометрируют (Шорманов В.К., Чигарёва Е.Н. Особенности изолирования лямбда-цигалотрина из биологического материала // Судебно-медицинская экспертиза. - 2006. - Т.49, №4. - С.35-37).

Наиболее близким является способ определения дельтаметрина ((S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(1R,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2диметил-циклопропанкарбоксилата) в биологическом материале (ткани трупной печени человека), состоящий в том, что биологическую пробу измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение упаривают в токе воздуха до получения сухого остатка, остаток растворяют в определенном количестве системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1, вводят полученный раствор в колонку, заполненную силикагелем L 40/100 µ, и осуществляют хроматографирование, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюат испаряют, остаток растворяют в хлороформе, полученный раствор наносят на хроматографическую пластину с гидроксилированным сорбентом (пластина «Силуфол» UV-254), хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-хлороформ, взятых в объемном отношении 5:5, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом с последующим фотометрированием элюата (Шорманов В.К., Чигарёва Е.Н. Сипливая Л.Е., Павлова О.Н. Сравнительное изучение особенностей изолирования дельтаметрина из биологического материала // Всероссийский съезд фармацевтических работников: сборник материалов съезда (6-7 июля 2005 г., г.Сочи). - Сочи, 2005. - С.165-166).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью (открываемый минимум составляет 40 мкг в хроматографируемой пробе и 2 мг в 100 г биологического материала) и малой селективностью определения (данный способ не позволяет определять дельтаметрин в присутствии лямбда-цигалотрина, и наоборот).

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и селективности определения.

Поставленная цель достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, фильтрат упаривают в токе воздуха до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом дважды, экстракты объединяют, растворитель испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемые вещества, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Nova Pack С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы.

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую дельтаметрин и лямбда-цигалотрин, измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, фильтрат упаривают до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом дважды, этилацетатные экстракты объединяют, растворитель испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему) хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемые вещества, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Nova Pack С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы.

Пример 1

Определение дельтаметрина в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг дельтаметрина ((S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(1R,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата), тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (около 120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку прибавляют элюент - систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки водой. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18» с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,115 мин (объемом удерживания 6115 мкл) соответствует дельтаметрину.

Количественное содержание дельтаметрина определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в ткань печени.

Построение калибровочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 100 мл вносят 1,25; 2,5; 5,0; 12,5; 25,0; 37,5; 50,0 мл 0,002% раствора дельтаметрина в ацетонитриле, добавляют соответственно 78,75; 77,5; 75; 67,5; 55,0; 42,5; 30,0 мл ацетонитрила и доводят до метки водой. 20 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектор на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,005-0,2 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=5,01025·10⁶·C-727,

где S - площадь хроматографического пика,

С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения дельтаметрина представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение лямбда-цигалотрина в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг лямбда-цигалотрина ((R,S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(±;цис)-3-[(Z)-2-хлоро-3,3,3,-тритрифторпропенил]-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата), тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (около 120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку вносят систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки водой. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18» с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны равной 276 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 5,737 мин (объемом удерживания 5737 мкл) соответствует лямбда-цигалотрину.

Количественное содержание лямбда-цигалотрина определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в ткань печени.

Построение калибровочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 100 мл вносят 1,25; 2,5; 5,0; 12,5; 25,0; 37,5; 50,0 мл 0,002% раствора лямбда-цигалотрина в ацетонитриле, добавляют соответственно 78,75; 77,5; 75; 67,5; 55,0; 42,5; 30,0 мл ацетонитрила и доводят до метки водой. 20 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют на колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектор на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм.

По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,005-0,2 мкг.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=8,72105·10⁷·C+948,

где S - площадь хроматографического пика,

С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения лямбда-цигалотрина представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в ткани печени при совместном присутствии

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг дельтаметрина ((S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(1R,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2диметилциклопропанкарбоксилата) и 10 мг лямбда-цигалотрина ((R,S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(±;цис)-3-[(Z)-2-хлоро-3,3,3,-тритрифтор-пропенил]-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата), тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемые вещества, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (около 120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку вносят систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки водой. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18» с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,115 мин (объемом удерживания 6115 мкл) соответствует дельтаметрину. Пик на хроматограмме с временем удерживания 5,737 мин (объемом удерживания 5737 мкл) соответствует лямбда-цигалотрину.

Количественное содержание дельтаметрина и лямбда-цигалотрина определяют, исходя из площадей хроматографических пиков, по уравнениям калибровочных графиков и пересчитывают на навески веществ, внесенных в ткань печени.

Схемы построения калибровочных графиков для определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина и уравнения этих графиков представлены выше в примерах 1 и 2.

Результаты количественного определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина при их совместном присутствии представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 200 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 10 раз - в ткани печени, характеризуется более высокой селективностью (позволяет, в отличие от прототипа, определять индивидуально дельтаметрин и лямбда-цигалотрин при их одновременном присутствии в биоматериале).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.

Таблица 1 Результаты определения дельтаметрина в ткани печени (n=5, Р=0,95) № Внесено дельтаметрина, мг в 10 г печени Найдено Метрологические характеристики мг % 1 10,00 7,228 72,28 2 10,00 7,088 70,88 S=1,94 3 10,00 7,015 70,15 4 10,00 6,910 69,10 5 10,00 6,713 67,13

Таблица 2 Результаты определения лямбда-цигалотрина в ткани печени (n=5, Р=0,95 № Внесено лямбда-цигалотрина, мгв 10 г печени Найдено Метрологические характеристики мг % 1 10,00 5,589 55,89 2 10,00 5,317 53,17 S=1,87 3 10,00 5,455 54,55 4 10,00 5,756 57,56 5 10,00 5,321 53,21

Таблица 3 Результаты определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина при совместном присутствии в ткани печени (n=5, Р=0,95) № Внесено в 10 г печени Найдено дельтаметрина лямбда-цигалотрина мг % метрологические характеристики мг % метрологические характеристики   дельтаметрина, мг лямбда-цигалотрина, мг 1 10,00 10,00 7,312 73,12 5,712 57,12 2 10,00 10,00 7,109 71,09 S=1,83 5,425 54,25 S=1,84 3 10,00 10,00 6,809 68,09 5,396 53,96 4 10,00 10,00 7,115 71,15 5,229 52,29 5 10,00 10,00 7,009 70,09 5,578 55,78

Таблица 4 Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов Показатели Предлагаемый способ Известный способ 1. Чувствительность (открываемый минимум) на примере дельтаметрина     а) в 100 г биоматериала 0,2 мг 2 мг б) в хроматографируемой пробе 0,005 мкг 1,0 мкг 2. Селективность Позволяет определять индивидуально дельтаметрин и лямбда-цигалотрин при их совместном присутствии в биологическом материале Не позволяет определять индивидуально дельтаметрин и лямбда-цигалотрин при их совместном присутствии в биологическом материале

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в биологическом материале и может быть использовано в практике различных лабораторий. Биологическую ткань измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, фильтрат упаривают до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом дважды, экстракты объединяют, растворитель испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1 по объему), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемые вещества, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением колонки размером 150×3,9 мм, заполненной сорбентом «Nova-Pack С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность определения. 4 табл.

Способ определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в биологическом материале, заключающийся в том, что биологическую пробу измельчают, дважды по 1 ч настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение упаривают в токе воздуха, подвергают хроматографической очистке в колонке, заполненной силикагелем L 40/100 µ, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемые вещества, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют и проводят определение с применением хроматографического метода, отличающийся тем, что объединенное извлечение из биологического материала перед проведением очистки в колонке фильтруют, упаривают в токе воздуха до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом дважды, экстракты объединяют, перед проведением определения растворение осадка осуществляют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему), а определение проводят методом ВЭЖХ, используя обращеннофазовый сорбент «Nova-Pack С-18», подвижную фазу ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектор на основе фотодиодной матрицы.