СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2-ДИМЕТИЛАМИНО-1,3-БИС-(ФЕНИЛСУЛЬФОНИЛТИО)ПРОПАНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2011 года по МПК C07C381/04 G01N33/48 G01N30/02 

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, клинических, ветеринарных и экологических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ основного характера, к которым относится и 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, неоднократно настаивают с подкисленным этанолом (каждый раз в течение суток), отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение концентрируют, осаждают в нем белки и некоторые другие эндогенные вещества биоматериала абсолютным этанолом, выпавший осадок отфильтровывают, процесс концентрирования объединенного извлечения, осаждения в нем эндогенных веществ биоматериала и отделения осадка фильтрованием неоднократно повторяют до прекращения появления осадка, фильтрат сгущают до густоты сиропа, разбавляют водой и экстрагируют анализируемые соединения вначале из кислого, а затем из щелочного раствора (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.119-123).

Способ характеризуется малой селективностью, недостаточно высокими чувствительностью и точностью определения.

Известен способ определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в биологическом материале (клубнях картофеля) путем измельчения биологического объекта, трехкратной обработки в режиме встряхивания порциями гексана, масса каждой из которых в два раза превышает массу биоматериала, отделения извлечений, их объединения, обезвоживания безводным сульфатом натрия, упаривания до незначительного объема, определения методом ТСХ в тонком слое широкопористого силикагеля на пластинах «Силуфол» с использованием подвижной фазы гексан-ацетон (3:2) (Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Т.1 / М.А.Клисенко, А.А.Калинина, К.Ф.Новикова, Г.А.Хохолькова. - М.: Колос, 1992. - С.190-192).

Способ отличается относительно низкой чувствительностью и недостаточно высокой точностью определения.

Наиболее близким является способ определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемое вещество изолируют из биологической пробы хлороформом, получаемое извлечение подвергают очистке в колонке силикагеля L 40/100 µ, используя элюент гексан-ацетон (9:1) и проводят определение методом ТСХ в тонком слое широкопористого силикагеля, применяя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (80:30:6) (Шорманов В.К., Баранов Ю.Н. Применение метода ТСХ для определения банкола в извлечениях из биологического материала // Научно-практическая конференция с международным участием «Состояние, перспективы судебно-токсикологической службы и научных исследований» (Харьков. 9-10 ноября 2005 г). - Харьков, 2005. - С.43).

Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и точностью определения.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и точности определения.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань измельчают, двукратно по 45 минут обрабатывают порциями толуола, масса каждой из которых в 2 раза превышает массу биологического объекта, полученные извлечения объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в органическом растворителе, очищают в колонке с силикагелем L 40/100 µ, вначале пропуская через нее гексан, а затем элюируя смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и проводят определение методом ВЭЖХ в колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб 600», с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропан, измельчают, двукратно по 45 минут обрабатывают порциями толуола, масса каждой из которых в два раза превышает массу биологического объекта, полученные извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, растворитель из объединенного извлечения испаряют, остаток растворяют в хлороформе, вводят в сорбент и, после испарения хлороформа, хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100µ, вначале пропуская через нее гексан, а затем элюируя смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и проводят определение методом ВЭЖХ в колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб 600», с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.

Пример 1

Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в ткани печени

К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 5 мг 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на полтора часа при температуре 18-20°C. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г толуола и выдерживают 45 минут при периодическом перемешивании. Извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия высотой 1-1,5 см. Фильтр дополнительно промывают 10 г толуола. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, растворитель испаряют в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 4 мл хлороформа, 2 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100 µ и испаряют остатки хлороформа из сорбента в токе воздуха.

В колонку размером 490×10 мм вносят вначале 9 г силикагеля типа L 40/100 µ, а затем, поверх образующегося слоя, - 1 г силикагеля L 40/100 µ, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде хлороформного раствора. Через колонку вначале пропускают гексан, после истечения из колонки 20 мл элюата растворитель, находящийся над поверхностью столба сорбента, удаляют и начинают элюировать системой растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 - по объему). С момента начала подачи системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 - по объему) выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 11 по 14 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в смеси 5 мл диоксана и 1 мл пропанола-2, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же вносят 15 мл гексана и доводят содержимое колбы смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) до метки. 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Милихром».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 64×2 мм, заполненной нормально-фазовым сорбентом «Силасорб 600» с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.

Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин. Масштаб регистрации 0,8 ед.о.п., время измерения 0,6 сек. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 256 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,35 мин (объемом удерживания 635 мкл) соответствует 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропану.

Количественное содержание 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в ткань печени.

Построение калибровочного графика.

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,25; 0,5; 1,0, 2,0; 5,0, 10,0 мл 0,05% раствора 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в смеси растворителей гексан-диокан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и доводят до метки смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему). 8 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 64×2 мл, заполненной сорбентом «Силасорб 600», используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектор. Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин.

Масштаб регистрации 0,8 ед.о.п., время измерения 0,6 сек. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 256 нм.

По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,04-1,6 мкг.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=2,58489·C+0,02872,

где S - площадь хроматографического пика, C - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.

Результаты количественного определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в ткани желудка

К 10 г мелкоизмельченной ткани желудка прибавляют 5 мг 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на полтора часа при температуре 18-20°C. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г толуола и выдерживают 45 минут при периодическом перемешивании. Извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия высотой 1-1,5 см. Фильтр дополнительно промывают 10 г толуола. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, растворитель испаряют в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 4 мл хлороформа, 2 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100 µ и испаряют остатки хлороформа из сорбента в токе воздуха.

В колонку размером 490×10 мм вносят вначале 9 г силикагеля типа L 40/100 µ, а затем, поверх образующегося слоя, 1 г силикагеля L 40/100 µ, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде хлороформного раствора. Через колонку вначале пропускают гексан, после истечения из колонки 20 мл элюата растворитель, находящийся над поверхностью столба сорбента, удаляют и начинают элюировать системой растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 - по объему). С момента начала подачи системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 по объему) выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 11 по 14 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в смеси 5 мл диоксана и 1 мл пропанола-2, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же вносят 15 мл гексана и доводят содержимое колбы смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) до метки. 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Милихром».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 64×2 мм, заполненной нормально-фазовым сорбентом «Силасорб 600» с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.

Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин. Масштаб регистрации 0,8 ед.о.п., время измерения 0,6 сек. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 256 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,35 мин (объемом удерживания 635 мкл) соответствует 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропану.

Количественное содержание 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в ткань желудка.

Построение калибровочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в ткани желудка представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в ткани почек

К 10 г мелкоизмельченной ткани почек прибавляют 5 мг 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на полтора часа при температуре 18-20°C. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г толуола и выдерживают 45 минут при периодическом перемешивании. Извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия высотой 1-1,5 см. Фильтр дополнительно промывают 10 г толуола. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, растворитель испаряют в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 4 мл хлороформа, 2 мл полученного раствора смешивают с 1 г силикагеля L 40/100 µ, и испаряют остатки хлороформа из сорбента в токе воздуха.

В колонку размером 490×10 мм вносят вначале 9 г силикагеля типа L 40/100 µ, а затем, поверх образующегося слоя, 1 г силикагеля L 40/100 µ, содержащего анализируемое вещество, предварительно введенное в виде хлороформного раствора. Через колонку вначале пропускают гексан, после истечения из колонки 20 мл элюата растворитель, находящийся над поверхностью столба сорбента, удаляют и начинают элюировать системой растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 по объему). С момента начала подачи системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 по объему) выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 11 по 14 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в смеси 5 мл диоксана и 1 мл пропанола-2, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, туда же вносят 15 мл гексана и доводят содержимое колбы смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1) до метки. 8 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Милихром».

Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размерами 64×2 мм, заполненной нормальнофазовым сорбентом «Силасорб 600» с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.

Скорость подачи элюента составляет 100 мкл/мин. Масштаб регистрации 0,8 ед.о.п., время измерения 0,6 сек. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 256 нм.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,35 мин (объемом удерживания 635 мкл) соответствует 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропану.

Количественное содержание 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества внесенную ткань почек.

Построение калибровочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в ткани почек представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 6 раз повышает чувствительность определения в биологическом материале и в 30-40 раз в хроматографируемой пробе, а также характеризуется более высокой точностью определения (полуширина доверительного интервала уменьшается в 2,5 раза). Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.

Таблица 4 Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере исследования ткани печени) Показатель Предлагаемый способ Известный способ 1. Чувствительность (открываемый минимум):     а) в хроматографируемой пробе 0,01 мкг 0,3-0,4 мкг б) в 100 г биоматериала 0,3 мг 2 мг 2. Степень извлечения (при условии содержания 50 мг определяемого вещества в 100 г биоматериала) 75,63% (изолирование толуолом) 55,74% (изолирование хлороформом) 3. Полуширина доверительного интервала (показатель точности) (n=5; P=0,95) 2,90% 8,68%

Изобретение относится к биологии, экологии, а также - к токсикологической и санитарной химии. Способ заключается в том, что анализируемую пробу настаивают с органическим изолирующим агентом, полученное извлечение очищают путем хроматографирования в колонке силикагеля L 40/100 µ, осуществляя элюирование смесью органических растворителей, и проводят определение анализируемого вещества хроматографическим методом, используя подвижную фазу, включающую гексан, диоксан и пропанол-2, причем органическим изолирующим агентом является толуол, толуольное извлечение обезвоживают безводным сульфатом натрия, в процессе очистки через колонку вначале пропускают гексан, а затем элюируют смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и проводят определение методом ВЖЭХ в колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб-600», с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детек-тора. Достигается повышение точности и чувствительности анализа. 4 табл.

Способ определения 2-диметиламино-1,3-бис-(фенилсульфонилтио)пропана в биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемую пробу настаивают с органическим изолирующим агентом, полученное извлечение очищают путем хроматографирования в колонке силикагеля L 40/100 µ, осуществляя элюирование смесью органических растворителей, и проводят определение анализируемого вещества хроматографическим методом, используя подвижную фазу, включающую гексан, диоксан и пропанол-2, отличающийся тем, что органическим изолирующим агентом является толуол, толуольное извлечение обезвоживают безводным сульфатом натрия, в процессе очистки через колонку вначале пропускают гексан, а затем элюируют смесью растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (8:3:0,6 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и проводят определение методом ВЖЭХ в колонке размерами 64×2 мм, заполненной сорбентом «Силасорб-600» с применением подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему) и УФ-детектора.