СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 4-НИТРОФЕНОЛОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 4-нитрофенолов в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий.

Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение суток), объединения вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления его водой с последующей экстракцией анализируемых соединений сначала из кислого, а затем из щелочного раствора [1].

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения 4-нитрофенолов и малой селективностью.

Известен способ определения органических веществ кислого характера (к которым относятся и 4-нитрофенолы) из биологического материала, заключающийся в измельчении биологического объекта, обработке водным раствором гидроксида натрия, центрифугировании, обработке центрифугата вольфраматом натрия в кислой среде при кипячении на водяной бане, отделении осадка центрифугированием в течение получаса, экстракционном выделении анализируемых соединений из центрифугата эфиром с последующим подщелачиванием центрифугата и повторной экстракцией эфиром [2].

Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения 4-нитрофенолов.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения 4-нитрофенола в биологическом материале путем измельчения биологического образца, подкисления, обработки бензолом в течение 4 часов, концентрирования извлечения, хроматографирования в колонке, заполненной оксидом алюминия, с использованием в качестве подвижной фазы метанола, концентрирования и разбавления метанольного элюата водой, подщелачивания, экстракции диэтиловым эфиром, отделения водного слоя, его подключения с последующей экстракцией диэтиловым эфиром, обезвоживанием экстракта, испарением до сухого остатка, растворением остатка в метаноле и хроматографированием на бумаге с использованием в качестве подвижной фазы н-бутанола, насыщенного раствором аммиака [3].

Способ характеризуется низкой чувствительностью и недостаточно высокой точностью.

Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и точности определения.

Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа, заключающегося в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, неоднократно обрабатывают уксусным ангидридом, полученные извлечения объединяют, испаряют до половины объема, разбавляют водой в объемном соотношении 1:3 соответственно, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, экстрагент испаряют, полученный остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют водно-щелочным раствором при pH 9,0-9,5, экстракт отделяют, подкисляют до pH 2-4, повторно экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, полученный экстракт отделяют, экстрагент испаряют до сухого остатка, который затем растворяют в хлороформе и подвергают хроматографической очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм, с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей, состоящей из гексана и пропанола-2, взятых при их объемном соотношении 20:1 соответственно.

Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую 4-нитрофенолы, измельчают, трижды настаивают с уксусным ангидридом (каждый раз в течение получаса), извлечения отделяют от твердых частиц биоматериала, объединяют, испаряют до половины объема, разбавляют водой в объемном соотношении 1: 3 соответственно, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, экстрагент испаряют, полученный остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют водно-щелочным раствором при pH 9,0-9,5, экстракт отделяют, подкисляют до pH 2-3, повторно экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, полученный экстракт отделяют, экстрагент испаряют до сухого остатка, который затем растворяют в хлороформе и подвергают хроматографической очистке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм, с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей, состоящей из гексана и пропанола-2, взятых при их объемном соотношении 20:1 соответственно.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение 4-нитрофенола в ткани печени.

К 25 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 12,5 мг 4-нитрофенола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20^oC. По истечении этого времени смесь заливают 50 мл уксусного ангидрида и выдерживают полчаса, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды. Вытяжки объединяют, испаряют до половины объекта в токе воздуха при комнатной температуре, разбавляют водой до 300 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в 25 мл хлороформа. Полученный раствор трижды экстрагируют щелочным буферным раствором с pH 9,0-9,5 (порциями по 25 мл каждая). Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 2-3 и экстрагируют порциями диэтилового эфира, насыщенного водой, трижды по 50 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в хлороформе, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки хлороформом. 2,5 мл этого раствора вносят в колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки хлороформом. 4 микролитра (мкл) полученного раствора вводят в хроматограф "Милихром". Хроматографирование осуществляют на колонке КАХ-1 размерами 64х2 мм, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм. Элюент - система растворителей гексан-пропанол-2 (20:1) (по объему), скорость подачи элюента 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Регистрацию оптической плотности проводят при длине волны 312 нм. В данных условиях хроматографирования время удерживания 4-нитрофенола составляет 10,12 минут, объем удерживания - 506 мкл.

Построение калибровочного графика. Готовится серия стандартных растворов, содержащих 0,0005%, 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004% и 0,005% 4-нитрофенола. В хроматограф вводят по 4 мкл каждого раствора. Хроматографирование осуществляют на приборе "Милихром" в колонке КАХ-1 размерами 64х2 мм, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм, используя в качестве элюента систему растворителей гексан-пропанол-2 (20:1) (по объему). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 312 нм. По результатам измерений строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид
S = 27,849 • C + 0,0011,
где
S - площадь пика, см², C - концентрация вещества во вводимой пробе, мкг.

Результаты определения 4-нитрофенола в ткани печени приведены в таблице 1.

Пример 2. Определение 2-хлор-4-нитрофенола в ткани печени.

К 25 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 12,5 мг 2-хлор-4-нитрофенола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20^oC. По истечении этого времени смесь заливают 50 мл уксусного ангидрида и выдерживают полчаса, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды. Вытяжки объединяют, испаряют до половины объема в токе воздуха при комнатной температуре, разбавляют водой до 300 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в 25 мл хлороформа. Полученный раствор трижды экстрагируют щелочным буферным раствором с pH 9,0-9,5 (порциями по 25 мл каждая). Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют до pH 2-3 24% раствором хлороводородной кислоты и экстрагируют порциями диэтилового эфира, насыщенного водой, трижды по 50 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в хлороформе, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки хлороформом. 2,5 мл этого раствора вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки хлороформом. 4 мкл полученного раствора вводят в хроматограф "Милихром". Хроматографирование осуществляют на колонке КАХ-1 размерами 64х2 мм, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм. Элюент - система растворителей гексан-пропанол-2 (20:1) (по объему), скорость подачи элюента 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/час. Регистрацию оптической плотности проводят при длине волны 310 нм. В данных условиях хроматографирования время удерживания 2-хлор-4-нитрофенола составляет 8,15 минут, объем удерживания - 475 мкл.

Построение калибровочного графика. Готовится серия стандартных растворов, содержащих 0,0005%, 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004% 2-хлор-4-нитрофенола. В хроматограф вводят по 4 мкл каждого раствора. Хроматографирование осуществляют на приборе "Милихром" в колонке КАХ-1 размерами 64х2 мм, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм, используя в качестве элюента систему растворителей гексан-пропанол-2 (20:1) (по объему). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/час. Оптическому плотность регистрируют при длине волны 310 нм. Но результатам измерений строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид
S = 26,396 • C - 0,113,
где
S - площадь пика, см², C - концентрация вещества во вводимой пробе, мкг.

Результаты определения 2-хлор-4-нитрофенола в ткани печени представлены в таблице 2.

Пример 3. Определение 2,4-динитрофенола в ткани печени.

К 25 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 12,5 мг 2,4-динитрофенола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20^oC. По истечении этого времени смесь заливают 50 мл уксусного ангидрида и выдерживают полчаса, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды. Вытяжки объединяют, испаряют до половины объема в токе воздуха при комнатной температуре, разбавляют водой до 300 мл и экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, испаряют до сухого остатка, остаток растворяют в 25 мл хлороформа. Полученный раствор трижды экстрагируют щелочным буферным раствором с pH 9,0-9,5 (порциями по 25 мл каждая). Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24% раствором хлороводородной кислоты до pH 2-3 и экстрагируют порциями диэтилового эфира, насыщенного водой, трижды по 50 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в хлороформе, переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки хлороформом. 2,5 мл этого раствора вносят в колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки хлороформом. 4 мкл полученного раствора вводят в хроматограф "Милихром". Хроматографирование осуществляют на колонке КАХ-1 размерами 64х2 мм, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм. Элюент - система растворителей гексан-пропанол-2 (20:1) (по объему), скорость подачи элюента - 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/час. Регистрацию оптической плотности проводят при длине волны 266 нм. В данных условиях хроматографирования время удерживания 2,4-динитрофенола составляет 7 минут, объем удерживания - 350 мкл.

Построение калибровочного графика. Готовится серия стандартных растворов, содержащих 0,001%, 0,002%, 0,004%, 0,006%, 0,008% 2,4-динитрофенола. В хроматограф вводят по 4 мкл каждого раствора. Хроматографирование осуществляют на приборе "Милихром" в колонке КАХ-1 размерами 64х2 мм, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм, используя в качестве элюента систему растворителей гексан-пропанол-2 (20:1) (по объему). Скорость подачи элюента составляет 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты - 720 мм/час. Оптическую плотность регистрируют при длине волны 266 нм. По результатам измерений строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид
S = 24,385 • C + 0,699,
где
S - площадь пика, см²;
C - концентрация вещества во вводимой пробе, мкг.

Результаты определения 2,4-динитрофенола в ткани печени приведены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 10 раз повышает чувствительность определения, в 4 раза увеличивает степень извлечения, характерезуется более высокой точностью (относительная ошибка уменьшается с ± 8% до ± 4%), позволяет в 2,5-3 раза сократить продолжительность анализа (с 8-9 часов до 3-3,5 часов). Результаты сравнения приведены в табл. 4
Литература
1. Швайкова М. Д. Токсикологическая химия. -М.: Медицина, 1975. - С. 119-123.

2. Крамаренко В.Ф. Химико-токсикологический анализ. - Киев: Вища школа, 1982. - С. 123-124.

3. Гадаскина И.Д., Филов В.А Превращения и определение промышленных органических ядов в организме. -Л.: Медицина, 1971. - С. 235-239. (Прототип).

Пробу исследуемого биологического материала измельчают и экстрагируют органическими растворителями. В качестве указанного органического растворителя используют уксусный ангидрид. Полученные извлечения концентрируют в два раза. Концентрат разбавляют водой в объемном соотношении 1:3 соответственно и экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой. Экстрагент испаряют. Полученный сухой остаток растворяют в хлороформе. Экстрагируют водно-щелочным раствором при pH 9,0-9,5. Щелочной экстракт отделяют и подкисляют до pH 2-3. Затем осуществляют экстракцию диэтиловым эфиром, насыщенным водой. Эфирные извлечения отделяют. Экстрагент испаряют до сухого остатка, который растворяют в хлороформе. Затем осуществляют хромотографию методом высокоэффективной жидкостной хромотографии на колонке, заполненной сорбентом "Силасорб-600" с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей, состоящей из гексана и пропанола-2, взятых при соотношении 20:1. Способ характеризуется высокой чувствительностью и точностью. 4 табл.

Способ определения 4-нитрофенолов в биологическом материале, включающий измельчение пробы биологического материала, обработку органическим растворителем, отделение извлечения с последующим его концентрированием, экстракционной очисткой и хроматографированием, отличающийся тем, что пробу биологического материала обрабатывают уксусным ангидридом, извлечение концентрируют в два раза, разбавляют водой в объемном соотношении 1 : 3 соответственно и экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, экстрагент испаряют, полученный сухой остаток растворяют в хлроформе и экстрагируют водно-щелочным раствором при рН 9,0 - 9,5, щелочной экстракт отделяют, подкисляют до рН 2 - 3 и экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, эфирные извлечения отделяют, экстрагент испаряют до сухого остатка, который растворяют в хлороформе и хроматографируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке, заполненной сорбентом "Силасорб-600" с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей, состоящей из гексана и пропанола-2, взятых при соотношении 20 : 1.