СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 

Область применения
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения основы питательных сред, и может быть использовано в клинической и санитарной микробиологии, ветеринарии и других областях, в которых имеет место культивирование микроорганизмов.

Предшествующий уровень техники
Для культивирования микроорганизмов широко используются микробиологические питательные среды, приготовленные на белковых основах животного происхождения, поскольку именно они содержат в своем составе все необходимые микроорганизмам химические элементы в достаточно легко усвояемой форме (белки, пептоны, аминокислоты и т.п.).

Так известны, например, способы приготовления основ бактериологических питательных сред для культивирования микроорганизмов путем ферментативного гидролиза органов и тканей специально выращенных сельскохозяйственных животных с помощью различных щелочных протеаз, таких как пепсин, трипсин, папаин [1] . Однако известные способы обладают сравнительно высокой стоимостью за счет высоких затрат на используемое сырье.

Наиболее близким по технической сути и достигаемому результату является способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов путем ферментативного гидролиза органов или тканей ластоногих, преимущественно тюленей, с помощью ферментсодержащих органов животного того же вида [2].

По известному способу измельченную вместе с костями мышечную ткань молодых беломорских тюленей заливают водой, подогретой до 50^oC, устанавливают pH 8,0, добавляют фарш поджелудочной железы того же животного и проводят гидролиз в течение 24 ч. Гидролизат отделяют от осадка фильтрованием, подкисляют уксусной кислотой до pH 5,4, кипятят, фильтруют и высушивают на распылительной сушильной установке.

В результате получают продукт с содержанием аминного азота 7,7%, общий азот 9-10%, степень расщепления около 80%.

Недостатком данного способа является большая продолжительность процесса, а также получение основы бактериологических питательных сред с достаточно высокой и при том нестабильной степенью расщепления белка (до 70-80%), которая может колебаться в значительных пределах от серии к серии препарата, что приводит к снижению функциональных возможностей полученных сред.

Известно, что для нормального роста и развития микроорганизмов, особенно гетеротрофов (это преимущественно патогенные для человека и животных микроорганизмы), адаптировавшихся к существованию в живых тканях и удовлетворяющих свои потребности за счет нативного белка высших организмов, в биологических средах должны быть представлены не только низкомолекулярные продукты расщепления белка, но и нативные белки и полипептиды, чем объясняется необходимость в мясных гидролизатах с невысокой степенью расщепления белка.

Следует также отметить, что известный способ является неэкономичным, так как не позволяет полностью использовать для получения сред сырье, которое может быть использовано для этих целей. Этот недостаток обусловлен тем, что в известном способе гидролиз ведут в присутствии ферментсодержащих органов и тканей тех же животных. Однако поджелудочной железы, взятой от одного животного, не достаточно для полного использования всей тушки, поскольку масса поджелудочной железы составляет около 200 г, а масса молодого животного - около 30 кг, а по известному способу на 1 кг сырья при гидролизе вводят 100 г ферментсодержащих органов. Другие ферментсодержащие органы, например, тонкий кишечник, допускается использовать в ограниченных случаях - а именно, когда животные питаются только материнским молоком. Позднее, когда животные начинают питаться самостоятельно, очистить тонкий кишечник от содержимого и использовать по назначению не представляется возможным, и производительность известного способа по существу определяется количеством ферментсодержащих органов.

Раскрытие изобретения
Техническим результатом, полученным от использования данного изобретения, является повышение производительности способа как за счет увеличения глубины переработки сырья, так и за счет сокращения длительности процесса, а кроме того расширение функциональных возможностей способа за счет обеспечения возможности получения основ для бактериологических сред с заданной степенью расщепления белка.

Указанный результат достигается за счет того, что в способе получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов путем гидролиза животного сырья, преимущественно органов и тканей ластоногих, с введением протеолитического фермента при повышенной температуре и повышенных значениях pH, сырье используют в виде фарша с размером частиц 5 - 15 мм, в качестве протеолитического фермента используют сухой препарат панкреатина, процесс ведут в течение 4 - 5 часов, причем фермент вводят в количестве 800 - 1000 ЕД/кг сырья.

Кроме того, процесс ведут при температуре 45 - 50^oС и при поддержании значения pH 7,5-8,5.

Использование в качестве протеолитического фермента сухого препарата панкреатина позволяет не только полностью использовать животное сырье, но и обеспечить получение сред с различной степенью расщепления белка.

Высокая степень расщепления белка (определяемая как соотношение содержания суммы низших ди-, трипептидов и свободных аминокислот к содержанию общего азота в препарате) в пептонах, получаемых по способу-прототипу, обуславливается высоким сродством субстрата и ферментов (используются органы и ткани животных одного вида), а также и высокой протеолитической активностью ферментов. Однако известно, что ферментсодержащие органы и ткани весьма нестабильны вследствие протекающих в них процессов автолиза, приводящих к неконтролируемому изменению протеолитической активности.

Известно применение в качестве протеолитического фермента при гидролизе животного сырья промысловых видов ластоногих коллагеназы, получаемой из гепатопанкреаса камчатского краба [3]. В результате получают сравнительно высококачественные пептоны, однако следует отметить, что при этом значительно увеличивается стоимость процесса приготовления основ сред, так как выделение коллагеназы с необходимой протеолитической активностью трудоемкий и дорогостоящий процесс, а кроме того при этом получается продукт, содержащий повышенное количество углеводов, что ограничивает область использования этого продукта.

Существенным является количество вводимого фермента. Так при введении фермента в количестве менее 800 ЕД/кг сырья невозможно достичь необходимой степени расщепления, а увеличение количества фермента более 1000 ЕД/кг сырья приводит к получению гидролизатов с высокой степенью расщепления.

На степень гидролиза также влияет и биологическая доступность субстрата, определяемая в данном случае степенью его измельчения.

В зависимости от степени измельчения сырья при заявленном соотношении субстрат/фермент возможно получение целевого продукта, отвечающий требованиям, предъявляемым к качеству аналогичных препаратов как по физико-химическим, так и биологическим характеристикам с одновременным сокращением длительности процесса.

При измельчении сырья до размеров частиц фарша менее 5 мм значительно увеличивается степень расщепления сырья, а при увеличении размеров частиц фарша более 15 мм не достигается необходимая степень расщепления. Кроме того измельчение сырья до размеров частиц менее 5 мм нецелесообразно, поскольку требует дополнительных энергетических затрат.

Предложенная совокупность признаков позволяет сократить длительность процесса гидролиза до 4-5 часов вместо 24 часов по способу-прототипу, оптимизировать процесс гидролиза с целью получения максимального выхода конечного продукта с заданными характеристиками. Кроме того процесс можно проводить при более мягких условиях - более низкой температуре, что снижает энергоемкость процесса.

Варианты конкретной реализации изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими примерами получения основных питательных сред, которые не исчерпывают всех возможных вариантов осуществления изобретения.

Пример 1.

В качестве сырья готовят 1 кг мясо-костного фарша промысловых видов тюленей с размером частиц до 5 мм (фарш был приготовлен с использованием решетки с размером перфорации 5 мм), заливают водой, нагревают до температуры 50^oC, устанавливают pH 8,0, добавляют сухой препарат панкреатина из расчета 1000 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 5 часов. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Сухой препарат, полученный по предлагаемому способу, содержит 8% аминного азота, 9-11% общего азота, степень расщепления 80%, выход целевого продукта 20% от загрузки. Сырье гидролизуется полностью.

Пример 2.

Сырье - 1 кг мясо-костного фарша промысловых видов тюленей, размер частиц 5-10 мм (размер перфорации решетки 10 мм), заливают водой, нагревают до температуры 450^oC, устанавливают pH 7,5, добавляют сухой препарат панкреатина из расчета 800 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 5 часов. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Сухой препарат, полученный по предлагаемому способу, содержит 5,0% аминного азота, 13-14% общего азота, степень расщепления 37%, выход целевого продукта 17% от загрузки. Сырье гидролизуется полностью.

Пример 3.

1 кг мясо-костного фарша промысловых видов тюленей, размер частиц 10-15 мм (размер перфорации решетки - 15 мм), заливают водой, нагревают до температуры 45^oC, устанавливают pH 7,5-8,0, добавляют сухой препарат панкреатина из расчета 900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 5 часов. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Сухой препарат, полученный по предлагаемому способу, содержит 4,0% аминного азота, 12-13% общего азота, степень расщепления 32%, выход целевого продукта 16% от загрузки. Сырье гидролизуется полностью.

Пример 4.

1 кг мясо-костного фарша промысловых видов тюленей, размер частиц 15-20 мм (решетка - 20 мм), заливают водой, нагревают до температуры 50^oC, устанавливают pH 8,0, добавляют сухой препарат панкреатина из расчета 1000 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 5 часов. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Сухой препарат, полученный по предлагаемому способу, содержит 3,0% аминного азота, 9-11% общего азота, степень расщепления 30%, выход целевого продукта 9% от загрузки. В гидролизате присутствуют непрогидролизовавшиеся частицы.

Пример 5.

1 кг мясо-костного фарша промысловых видов тюленей, размер частиц 5-15 мм (решетка - 15 мм), заливают водой, нагревают до температуры 50^oC, устанавливают pH 8,0, добавляют сухой препарат панкреатина из расчета 600 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 5 часов. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Сухой препарат, полученный по предлагаемому способу, содержит 4,0% аминного азота, 11-12% общего азота, степень расщепления 35%, выход целевого продукта 13% от загрузки. В гидролизате присутствуют непрогидролизовавшиеся частицы.

Пример 6.

1 кг мясо-костного фарша промысловых видов тюленей, размер частиц 15-20 мм (решетка 20 мм), заливают водой, нагревают до температуры 45^oC, устанавливают pH 7,5, добавляют сухой препарат панкреатина из расчета 600 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 5 часов. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Сухой препарат, полученный по предлагаемому способу, содержит 3,0% аминного азота, 10-11% общего азота, степень расщепления 33%, выход целевого продукта 10% от загрузки. В гидролизате присутствуют непрогидролизовавшиеся частицы.

Пример 7.

1 кг мясо-костного фарша промысловых видов тюленей, размер частиц до 5 мм (решетка 5 мм), заливают водой, нагревают до температуры 45^oC, устанавливают pH 7,5, добавляют сухой препарат панкреатина из расчета 600 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 5 часов. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Сухой препарат, полученный по предлагаемому способу, содержит 6% аминного азота, 9-10% общего азота, степень расщепления 70%, выход целевого продукта 15% от загрузки. Сырье гидролизуется полностью.

Из приведенных примеров следует, что размельчение исходного сырья до размеров частиц 5-15 мм и введение панкреатина в количестве, соответствующем 800-1000 ЕД на 1 кг сырья, позволяет получить конечный продукт с оптимальным выходом и заданными характеристиками.

Качественная и количественная оценка по биологическим и физико-химическим показателям основ питательных сред, полученных по предлагаемой технологии, включала следующие тесты:
Физико-химические показатели - содержание общего азота, содержание азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов (аминный азот), степень расщепления.

Биологические показатели - чувствительность роста, эффективность роста микроорганизмов.

В качестве контроля были использованы среды на основе препарата, полученного по способу-прототипу [2], среды по патенту РФ 2031939 [3].

Характеристики основ микробиологических питательных сред приведены в таблицах 1 - 4.

Промышленная применимость
Как видно из приведенных данных, способ по изобретению имеет по сравнению со способом-прототипом меньшую продолжительность, кроме того, расширены функциональные возможности способа, так как жидкие и плотные среды с использованием основ, полученных в соответствии с изобретением, оказались в отношении большинства испытанных тест-штаммов микроорганизмов более чувствительными в сравнении со средами на основе, полученной по способу-прототипу. Образцы по изобретению сравнимы по качеству со средами, предлагаемыми лучшими производителями, но значительно дешевле их.

Источники информации
1. "The Oxoid Manual of Culture Media Ingredients and Other Laboratory Services", Hampshire, 1982. Liver Digest Neutralised, code L27, p. 239; Tryptose, code L47, p. 244; Peptone Bacteriological, code L37 p. 240.

2. Авторское свидетельство СССР N 1402616, кл. C 12 N 1/20, опубл. 15.06.1988 г. Бюл. N 22 (прототип).

3. Патент РФ N 2031939, кл. C 12 N 1/20, опубл. 27.03.1995 г. Бюл. N 9.

Изобретение относится к биотехнологии, клинической и санитарной микробиологии, ветеринарии. Способ включает гидролиз в течение 4 - 5 ч животного сырья. В качестве сырья используют органы и ткани ластоногих. Протеолитический фермент вводят в виде сухого препарата панкреатина в количестве 800 - 1000 Ед/кг сырья. Сырье используют в виде фарша с размером частиц 5 - 15 мм. Процесс ведут при температуре 45 - 50^oС и при значении рН 7,5 - 8. Способ позволяет сократить время гидролиза, увеличить глубину переработки сырья, обеспечить получение основ для бактериологических сред с заданной степенью расщепления белка. 2 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, включающий гидролиз животного сырья, преимущественно органов и тканей ластоногих, с введением протеолитического фермента при повышенной температуре и повышенных значениях рН, отличающийся тем, что сырье используют в виде фарша с размером частиц 5 - 15 мм, в качестве протеолитического фермента используют сухой препарат панкреатина, процесс ведут в течение 4 - 5 ч, причем фермент вводят в количестве 800 - 1000 Ед/кг сырья. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс ведут при температуре 45 - 50^oC. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что процесс ведут при поддержании значения рН 7,5 - 8.