СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения основы питательных сред, и может быть использовано при получении основных питательных сред для биотехнологии.

Известен способ получения основы питательных сред путем ферментативного расщепления животного сырья (говяжьей вырезки) с последующей очисткой целевого продукта (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М. 1950, с. 290-292). Говяжье или конское мясо очищают от жира и сухожилий, нарезают кусочками или полосками, кладут в кипящую воду из расчета 1 кг мяса на 2 л воды, кипятят в течение 5 мин. Мясо отделяют от жидкости и пропускают через мясорубку. Смешивают фарш и жидкость и дают остыть до 45^оС, после чего смесь помещают в бутыль с плотной резиновой пробкой, куда добавляют 5-10 г панкреатина или 40-80 г поджелудочной железы. Смесь доводят до pH 7,7-8,0, нагревают до 37^оС и гидролизуют в течение 7-10 сут. Перевар фильтруют, добавляют 10 мл хлороформа на 1 л смеси.

Однако для приготовления основы питательной среды используется нестандартное дорогостоящее пищевое сырье и процесс гидролиза длится 7-10 сут, что увеличивает себестоимость продукта.

Известен способ получения белковой основы микробиологических питательных сред, основанный на ферментативном расщеплении внутренних органов домашних птиц при pH 8,6-9,0 (авт.св. СССР N 878789, кл. С 12 N 1/20). После 7-8 сут выстаивания при 37^оС надосадочную жидкость декантируют, кипятят, добавляют раствор сернокислого аммония, суспензию кальция гидроокиси до появления в смеси избытка ионов кальция и фильтруют. После фильтрации смесь подогревают до 80^оС и избыток ионов кальция нейтрализуют раствором двузамещенного фосфата натрия, фильтруют и устанавливают pH 6,8-7,2.

Однако процесс приготовления питательной основы довольно трудоемкий и длится 7-8 сут, что увеличивает ее себестоимость.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов из органов или мышечных тканей ластоногих, преимущественно тюленей, имеющих утробный и вторичный волосяной покров (авт. св. СССР N 14026, кл. С 12 N 1/20). Гидролиз проводят при pH 8,0 в течение 24 ч при 50^оС. В качестве гидролизующего агента используют фарш поджелудочной железы, кишечника или желудка белька.

Однако в качестве белкового сырья используют органы или мышечные ткани ластоногих, промышленный забой которых в настоящее время значительно сокращен.

Задачей изобретения является расширение сырьевой базы и снижение себестоимости основ питательных сред для культивирования микроорганизмов.

Задача решеается тем, что в способе получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, включающем ферментативное расщепление белкового сырья, в качестве исходного сырья используют мясокостный фарш пушных зверей при соотношении фарш/вода, равном 1:2, а гидролиз проводят поджелудочной железой в концентрации 15-25% от объема субстрата в течение 16-32 ч, pH 7,6 ± 0,4, при температуре 42 ± 2^оС.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

В реактор вместимостью 0,16 м³ заливают 90-100 л питьевой воды, нагревают до кипения и кипятят 5-10 мин. Затем загружают 50 кг мясокостного фарша пушных зверей (норка, лисица, песец).

Смесь нагревают до кипения и кипятят 15-20 мин. С поверхности смеси удаляют жир. Холодной водой через рубашку реактора при перемешивании устанавливают температуру 40 ± 2^оС и 40%-ным раствором NaOH устанавливают pH 7,6 ± 0,4. Загружают 7,5-12,5 кг фарша поджелудочной железы. Смесь выдерживают 10-15 мин и с поверхности смеси удаляют жир. Через час после введения фермента в гидролизуемой смеси определяют pH и корректируют ее в диапазоне 7,6 ± 0,4. Гидролиз проводят в течение 16-32 ч при 40 ± 2^оС с периодическим перемешиванием через 3-4 ч.

По окончании гидролиза смесь нагревают до кипения, после чего ее охлаждают холодной водой через рубашку реактора до 35-40^оС. Полученный гидролизат фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе.

Физико-химические показатели питательной основы приведены ниже: Общий азот, мг% 922 ± 72 Аминный азот, мг% 577 ± 90 Глубина расщепления белка, 60,1 ± 7,6 Содержание хлоридов натрия, 0,19 ± 0,06 Редуцирующие вещества, мг/л 0,32 ± 0,09 Водородный показатель, ед. pH 74 ± 0,2
Аминокислотный состав питательной основы, мг/л: Аспарагиновая кислота 3216 ± 329 Треонин 3179 ± 394 Серин 1964 ± 301 Глутаминовая кислота 5684 ± 709 Пролин 729 ± 156 Глицин 2094 ± 364 Аланин 4571 ± 392 Валин 3418 ± 265 Метионин 1727 ± 92 Изолейцин 2336 ± 189 Лейцин 5734 ± 415 Тирозин 2134 ± 299 Фенилаланин 3090 ± 178 Гистидин 2612 ± 183 Лизин 4071 ± 327 Аргинин 2553 ± 406 Итого 49787 ± 5950
Изобретение позволяет значительно расширить сырьевую базу для приготовления питательных основ, так как в России существует около 120 зверохозяйств, в каждом из которых ежегодно получают от 15 до 150 т мяса или мясокостного фарша пушных зверей в качестве побочного продукта. Стоимость питательной основы, полученной по предлагаемому способу, в 10-12 раз ниже по сравнению с известной основой по Хоттингеру и в 2-3 раза по сравнению с питательной основой из органов или мышечных тканей ластоногих.

Мясной или мясокостный фарш пушных зверей является стандартным белковым субстратом. Стандартность его обусловлена тем, что животных кормят по научно обоснованному рациону; для забоя используют животных одного возраста в одно и то же время (осень, весна). Питательная основа, приготовленная из этого белкового сырья, обладает выраженным ростстимулирующим эффектом, поскольку содержит продукты гидролиза крови (тушки после забоя не обескровливают), а также большое количество витаминов группы А и В, неорганические соединения фосфора, калия, магния, железа, которые животное получает при кормлении.

Быстрое расщепление белка обусловлено также наличием в мясокостном фарше собственных ферментов печени, поджелудочной железы, селезенки и других внутренних органов животного.

Использование мясокостного фарша способствует повышению питательной ценности целевого продукта, так как кости являются источником необходимых для роста микроорганизмов ионов кальция, фосфора калия, а также продуктов гидролиза коллагена.

П р и м е р 1. В реактор вместимостью 0,16 м³ заливают 100 л питьевой воды, нагревают до кипения и кипятят 5-10 мин. Затем загружают 50 кг мясокостного фарша лисицы. Смесь нагревают до кипения и кипятят 15-20 мин. С поверхности смеси удаляют жир. Холодной водой через рубашку реактора при перемешивании устанавливают температуру 40^оС и 40%-ным раствором NaOH устанавливают pH 7,5. Загружают 7,5 кг поджелудочной железы, смесь выдерживают 10-15 мин и удаляют жир. Через час после введения фермента в гидролизуемой смеси определяют pH и при необходимости корректируют ее до 7,6 ± 0,4. Гидролиз проводят в течение 16 ч при периодическом перемешивании через 3-4 ч.

По окончании гидролиза смесь нагревают до кипения, после чего ее охлаждают до 35-40^оС. Полученный гидролизат фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе. Питательная основа характеризуется следующими физико-химическими показателями: Общий азот, мг% 926 Аминный азот, мг% 537 Глубина расщепления белка, 58,0 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,31 Водородный показатель, ед. pH 7,4 Общее количество аминокислот, мг/л 44536
П р и м е р 2. Исходные данные: мясокостный фарш лисицы 50 кг; поджелудочная железа 12,5 кг; pH реакционной смеси 7,6; продолжительность гидролиза 16 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 880 Аминный азот, мг% 565 Глубина расщепления белка, 64,7 Содержание хлорида натрия, 0,19 Редуцирующие вещества, мг/л 0,25 Водородный показатель, ед. pH 7,5 Общее количество аминокислот, мг/л 46926
П р и м е р 3. Исходные данные: мясокостный фарш лисицы 50 кг; поджелудочная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,2; продолжительность гидролиза 32 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 982 Аминный азот, мг% 640 Глубина расщепления белка, 65,2 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,34 Водородный показатель, ед. pH 7,2 Общее количество аминокислот, мг/л 52951
П р и м е р 4. Исходные данные: мясокостный фарш 50 кг; поджелудочная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,5; продолжительность гидролиза 16 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 920 Аминный азот, мг% 552 Глубина расщепления белка, 60,0 Содержание хлорида натрия, 0,21 Редуцирующие вещества, мг/л 0,32 Водородный показатель, ед. pH 7,4 Общее содержание аминокислот, мг/л 45343
П р и м е р 5. Исходные данные: мясокостный фарш песца 50 кг; поджелудочная железа 12,5 кг; pH реакционной смеси 7,8; продолжительность гидролиза 32 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 960 Аминный азот, мг% 593 Глубина расщепления белка, 61,8 Содержание хлрида натрия, 0,23 Редуцирующие вещества, мг/л 0,32 Водородный показатель, ед. pH 7,6 Общее содержание аминокислот, мг/л 51840
П р и м е р 6. Исходные данные: мясокостный фарш норки 50 кг; поджелудочная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,5; продолжительность гидролиза 16 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 890 Аминный азот, мг 521 Глубина расщепления белка, 58,5 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,30 Водородный показатель, ед. pH 7,4 Общее содержание аминокислот, мг/л 46541.

П р и м е р 7. Исходные данные: мясокостный фарш норки 50 кг; поджелудчная железа 7,5 кг; pH реакционной смеси 7,4; продолжительность гидролиза 32 ч.

Физико-химическая характеристика питательной основы: Общий азот, мг% 921 Аминный азот, мг% 544 Глубина расщепления белка, 59,1 Содержание хлорида натрия, 0,20 Редуцирующие вещества, мг/л 0,29 Водородный показатель, ед. pH 7,2 Общее содержание аминокислот, мг/л 48233.

Использование питательной основы для приготовления питательных сред, применяемых для выращивания микроорганизмов бактериальной природы, иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 8. Берут питательную основу, приготовленную по примерам 1-7, разбавляют дистиллированной водой до концентрации 120 мг% по аминному азоту. К 1 л смеси добавляют 3,0 г хлористого натрия и 1,0 г Na₂HPO₄, кипятят 20 мин, устанавливают pH 7,2, разливают в стерильные флаконы по 100,0 мл, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. В питательную среду во флаконах вносят 24-часовую суспензию вакцинного штамма ЕВ чумного микроба в концентрации 1,0·10⁹ м.кл (1 мл 1·10⁷ м.кл), выращивают в течение 48 ч при 28^оС.

После инкубирования количество биомассы чумного мкроба достигает 1,7·10⁹ м·кл/мл, на среде из прототипа 0,9·10⁹ м·кл/мл, на среде из перевара мяса по Хоттингеру 0,6·10⁹ м.кл/мл.

П р и м е р 9. Берут питательную основу по примерам 1-7, разводят физиологическим раствором хлористого натрия в соотношении 1:6, разливают по 50 мл во флаконы, стерилизуют при 110^оС в течение 20 мин. В охлажденный до 38^оС бульон вводят посевной материал из расчета 0,2 млрд.кл/мл, выращивают при 38^оС в течение 24 ч. Полученные результаты приведены в таблице.

Из данных таблицы следует, что питательные основы, приготовленные по предлагаемому способу, обладают хорошими ростовыми свойствами и могут быть использованы при культивировании различных микроорганизмов бактериальной природы.

Использование: микробиология, способы получения основы питательных сред. Сущность изобретения: способ получения питательной основы включает ферментативное расщепление мясокостного фарша пушных зверей (норка, песец, лисица) при соотношении фарш/вода, равном 1:2, поджелудочной железой крупного рогатого скота в концентрации 15-25% от объема субстрата в течение 16-32 ч. при pH 7,6±0,4 и температуре 40±2^oС. Питательная основа служит источником питательных веществ для широкого спектра микроорганизмов. 1 табл.

Способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов, включающий ферментативный гидролиз белкового сырья, отличающийся тем, что в качестве белкового сырья используют мясокостный фарш пушных зверей при соотношении фарша и воды 1 2, гидролиз проводят поджелудочной железой крупного рогатого скота в конечной концентрации 15 25% от объема субстрата в течение 16 32 ч при рН 7,6 ± 0,4 и (40 ± 2)^oС.