СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО ГИДРОЛИЗАТА Российский патент 1996 года по МПК C12N1/20 C12P21/06 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам получения белковых гидролизатов, и может быть использовано при получении основных питательных сред для накопления и культивирования микроорганизмов бактериальной природы.

Известен способ получения белкового гидролизата (Пригода А.С. и др. Биотехнология. 1990, N 2, с.35-39), состоящий в том, что гидролиз казеина проводят при температуре 40^оС, при pH 8,0 в течение 2-20 ч. При этом соотношение субстрат (казеин) фермент (панкреатин) составляет 10:1. По завершении процесса фермент инактивируют при 75^оС в течение 10 мин и гидролизат осветляют центрифугированием. Для отделения гидролизата от непрореагировавшего белка и остатков фермента супернатант смешивают с активным углем из расчета 30 г сорбента на 1 л гидролизата с экспозицией 30 мин. По окончании сорбции гидролизат последовательно фильтруют через картон марки "КФО", фильтровальную бумагу и стерилизующие мембраны "Millipore" с диаметром пор 0,22 мкм. Полученный таким образом белковый гидролизат представляет собой главным образом смесь аминокислот и пептидов с молекулярной массой от 200 до 5000 Д и используется в качестве заменителя сыворотки в питательных средах для культивирования клеток эукариот.

Однако полученный гидролизат используется только при конструировании бессывороточных питательных сред для суспензионного культивирования клеток млекопитающих, а не как основа микробиологических сред (Пригода А.С. и др. Биотехнология, 1990, N 2, с.35-39).

Использование гидролизата для приготовления бактериологических питательных сред не повышает их ростовых свойств, так как содержит мало низкомолекулярных пептидов. Повышение ростовых свойств питательных сред данным способом путем изменения только температуры гидролизата, или модуля загрузки, или pH реакционной смеси не происходит.

Известен способ получения гидролизата путем кислотного гидролиза казеина с последующей деминерализацией его (авт. св. СССР N 738583).

Гидролиз проводят в две стадии, на первой из них процесс ведут соляной или серной кислотой в течение 25-35 мин при 100-102^оС, а также протеолитическим ферментом-пепсидном при pH 1,0-2,0 до перевода в растворимое состояние гликопептидов с последующим удалением надосадочной жидкости, а на второй стадии гидролиз проводят с соляной или серной кислотой до глубины расщепления белка 45-50% Затем осуществляют деминерализацию смеси электродиализом.

К недостаткам этого способа следует отнести продолжительность и двухстадийность процесса гидролиза, обязательную деминерализацию смеси белкового гидролизата, что увеличивает себестоимость питательной основы.

Невозможность получения требуемого технического результата обусловлена тем, что в известном способе используются три гидролизующих агента, замена или исключение одного из них приводит к снижению себестоимости, но не повышает ростовых свойств питательных сред.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения белкового гидролизата по Хоттингеру (Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии, М. 1950, с.290-292; Заплатина С.И. и др. Труды Ростовского противочумного института. Ростов-на-Дону, 1959), состоящий в том, что 18 г казеина замачивают в водопроводной воде. Через сутки его отжимают и растворяют в 1 л горячей воды. Раствор подщелачивают 20%-ным раствором NaOH до pH 7,0-7,2 и кипятят в течение 15-20 мин до полного растворения казеина. К охлажденному до 40^оС раствору казеина добавляют молотую поджелудочную железу из расчета 50 г на 1 л раствора и 10 мл хлороформа. Готовый раствор помещают в термостат, где поддерживают температуру 37^оС. Первые сутки перевар взбалтывают через каждые 15-20 мин, а в последующие дни 2-3 раза в сутки. Гидролиз проводят в течение 4-5 сут до полного прекращения нарастания аминного азота.

Белковый гидролизат используют для приготовления питательных сред при культивировании микроорганизмов бактериальной природы.

К недостаткам этого способа следует отнести длительность процесса гидролиза (4-5 сут), значительную себестоимость питательной основы и невысокие ростовые свойства питательных сред, приготовленных из нее. Сокращение времени гидролиза приводит к снижению себестоимости питательной основы, но при этом снижаются ее ростовые свойства. Изменение только pH реакционной смеси или модуля загрузки по ферменту не приводит к достижению требуемого технического результата.

Задачей изобретения является сокращение процесса получения гидролизата, снижение его себестоимости и повышение ростовых свойств полученных на его основе питательных сред, используемых для выращивания микроорганизмов бактериальной природы.

Задача решается тем, что в способе получения белкового гидролизата, включающем ферментативное расщепление белкового субстрата, гидролиз проводят в течение 4-5 ч при температуре 50 ± 2^оС и pH 7,5-7,8 панкреатином в соотношении субстрат-фермент, равном 1,0:0,075.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. В реактор загружают 120 л водопроводной воды и 12 кг казеина. Смесь нагревают "глухим" паром до температуры 50± 2^оС, включают мешалку и добавляют к смеси 40%-ный раствор NaOH, устанавливая pH 7,5-7,8. В смесь вводят 900 г панкреатина (активностью 25 ед/г, если активность иная, то делают перерасчет навески, вводимой в реактор) и ведут процесс в течение 4-5 ч при 50± 2^оС. В течение первого часа процесса гидролиза смесь постоянно перемешивают. В последующие часы перемешивание проводят по 5-10 мин через каждые 30 мин гидролиза. Через каждый час гидролиза отбирают пробу, в которой определяют концентрацию аминного азота и pH. Критерием окончания процесса является отсутствие прироста аминного азота в смеси.

По окончании гидролиза смесь нагревают до кипения, после чего ее охлаждают холодной водой через рубашку реактора до 35-40^оС. Полученный гидролизат фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе.

Сравнительная характеристика гидролизатов по физико-химическим показателям и аминокислотному составу приведена в табл.1 и 2.

Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков предлагаемого изобретения и достигаемым техническим результатом показана в табл.3.

Изобретение позволяет сократить длительность гидролиза в 20-25 раз, снизить себестоимость питательной основы за счет сокращения продолжительности гидролиза и снижения модуля загрузки (фермент-субстрат, по ферменту) в 2 раза. Совокупность оптимальных значений температуры, pH, использование панкреатина в соотношении 1,0:0,075 (субстрат-фермент) интенсифицирует процесс и повышает качество гидролизата, так как увеличивает концентрацию пептидов в смеси в 12 раз.

Изобретение позволяет получать белковый гидролизат, содержащий смесь аминокислот и пептидов с молекулярной массой от 200 до 2000 Д, используемый для конструирования бактериологических питательных сред, вместо перевара говяжьей вырезки крупного рогатого скота и казеина по Хоттингеру.

П р и м е р 1. В реактор вместимостью 0,15 м³ загружают 120 л водопроводной воды и 12 кг казеина. Смесь нагревают "глухим" паром до температуры 50^оС, включают мешалку и добавляют 40%-ный раствор NaOH до pH 7,5. В реактор вводят 900 г панкреатина с активностью 25 ед/г. Гидролиз проводят при температуре 50^оС. В течение первого часа процесса смесь постоянно перемешивают. В последующие часы перемешивают по 10 мин через каждые 30 мин. Через 5 ч гидролиза смесь нагревают до кипения, охлаждают холодной водой через рубашку реактора до температуры 40^оС, фильтруют через картон марки "Т" на фильтр-прессе.

Физико-химическая характеристика гидролизата и его аминокислотный состав представлены в табл.4 и 5.

П р и м е р 2. Исходные данные: температура гидролиза 48^оС, pH смеси 7,8, время гидролиза 4 ч. Физико-химическая характеристика гидролизата и его аминокислотный состав представлены в табл.4 и 5.

П р и м е р 3. Исходные данные: температура гидролиза 52^оС, pH смеси 7,8, время гидролиза 5 ч. Физико-химическая характеристика гидролизата и его аминокислотный состав представлены в табл.4 и 5.

Использование белкового гидролизата в качестве питательной основы бактериологических сред для культивирования различных микроорганизмов иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 4. Берут гидролизат, приготовленный по примеру 1, 2 или 3, разбавляют дистиллированной водой до концентрации 120 мг% по аминному азоту. К 1 л смеси добавляют 3,0 г хлористого натрия и 1,0 г Na₂HPO₄, кипятят 20 мин, устанавливают pH 7,2, разливают в стерильные флаконы по 100,0 мл, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. Питательную среду во флаконах засевают 24-часовой суспензией вакцинного штамма ЕВ чумного микроба в концентрации 1,0·10⁹ м·кл (1 мл 1·10⁷ м·кл), выращивают в течение 48 ч при 28^оС.

Данные ростовых и морфологических свойств Y.pestis штамма ЕВ приведены в табл.6 в сравнении с результатами, полученными на средах из перевара казеина и мяса по Хоттингеру.

Из табл.6 видно, что выход биомассы на среде из заявляемого объекта превышает выход биомассы на средах из перевара казеина и мяса по Хоттингеру.

П р и м е р 5. В жидкую среду, имеющую состав по примеру 4, дополнительно вводят агар-агар из расчета 20 г/л. Устанавливают pH 7,1, разливают в матрацы по 0,5 л, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин, добавляют стерильный раствор сульфита натрия из расчета 0,25 мг/л. Среду разливают в чашки Петри, засевают 24-часовой суспензией вакцинного штамма ЕВ Y.pestis в концентрации 1·10² м·кл на чашку для определения показателя прорастания и морфологии колоний. Культуру выращивают в течение 48 ч при 27^оС. Данные приведены в табл.7.

Из табл.7 видно, что на плотной среде из белкового гидролизата выростало 68± 2 типичных колоний чумного микроба, а на средах из перевара казеина и мяса по Хоттингеру 59± 3 и 57± 2 колоний соответственно.

П р и м е р 6. Готовят среду по примеру 4, но хлористый натрий добавляют из расчета 0,5 г/л. Устанавливают pH 7,4, разливают в стерильные флаконы по 100 мл, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. Питательную среду засевают 24-часовой суспензией кишечной палочки штамм М17 в концентрации 1·10⁹ м·кл (в 1 мл 1·10⁷ м·кл). Выращивают в течение 24 ч при 37^оС. Данные ростовых и морфологических свойств Е.сoli приведены в табл.8.

Из данных табл.8 видно, что выход биомассы на среде из заявляемого объекта превышает выход биомассы на среде из перевара казеина и мяса по Хоттингеру.

П р и м е р 7. Готовят среду по примеру 4, дополнительно вводят агар-агар из расчета 20 г/л, устанавливают pH 7,0± 0,1, разливают в матрацы по 0,5 л, стерилизуют автоклавированием при 110^оС 30 мин. Разливают в чашки Петри, засевают 24-часовой суспензией Staphylococcus aureus в концентрации 1·10² м·кл на чашку для определения показателя прорастания и морфологии колоний. Данные приведены в табл.9.

Из данных табл.9 видно, что на всех средах вырастает одинаковое количество типичных колоний.

Использование: в микробиологии при получении основных питательных сред для накопления и культивирования микроорганизмов бактериальной природы. Сущность изобретения: белковый субстрат подвергают гидролизу панкреатином при pH 7,5-7,8, температуре 48-52^oС в течение 4-5 ч в соотношении субстрат: фермент, равном 1,0:0,075. 9 табл.

Способ получения белкового гидролизата, включающий ферментативный гидролиз белкового субстрата, отличающийся тем, что гидролиз проводят панкреатином в течение 4 5 ч в соотношении субстрат панкреатин 1,0 0,075.