1. Изобретение относится к фактору, усиливающему пестицидную активность родственного штамму Bacillus пестицида, к химическому пестициду и/или вирусу с пестицидными свойствами, а также к способам получения фактора. Кроме того, изобретение относится к пестицидным препаратам, содержащим фактор и пестицидный носитель или фактор и родственный с Bacillus пестицид, химический пестицид и/или вирус с пестицидными свойствами, а также к способам применения подобных препаратов. Изобретение относится также к мутантному или вариантному штамму Bacillus, в котором указанный фактор образуется в больших количествах или который обладает большей усиливающей активностью по сравнению с родоначальным штаммом, и к способам получения таких мутантных или вариантных штаммов.
2. Ежегодно во всем мире значительная часть имеющих промышленное значение сельскохозяйственных продуктов, в том числе пищевых продуктов, текстильных изделий и разнообразных домашних растений гибнет из-за поражения насекомыми-вредителями, что приводит к потерям в миллионы долларов. Для борьбы с такими вредителями испробованы различные подходы.
Один из подходов состоит в применение широкого спектра пестицидов, химических пестицидов с широким спектром активности. Однако, применение химических пестицидов связано с рядом недостатков. Из-за своего широкого спектра активности такие пестициды способны уничтожать и не являющиеся объектом уничтожения организмы, например, полезных насекомых или паразитирующих на вредителях насекомых. Кроме того, химические пестициды часто токсичны для животных и человека, а у вредителей, с которыми ведется борьба, при многократном воздействии таких веществ часто создается устойчивость к ним.
Другой подход включает использование биспестицидов, применение которых для борьбы с насекомыми, грибками и сорняками, поражающими культурные растения, основано на патогенах природного происхождения. Биопестициды представляют собой бактерии, продуцирующие токсин, т.е. токсичное для вредителя вещество. Биопестициды, как правило, в целом менее вредны для не являющихся объектом уничтожения организмов и для окружающей среды по сравнению с химическими пестицидами. К наиболее широко применяемым биопестицидам относится Bacillus thuringiensis (B.t.). B.t. является широкораспространенным аэробным и спорыобразующим микроорганизмом в форме стержня. В ходе цикла споруляции B. t. продуцирует белок-(и), известный-(ые) в кристаллическом виде, как кристаллический-(ие) дельта-эндотоксин-(ы), уничтожающий-(ие) личинки насекомых. Таким образом, B.t. очень полезен в качестве сельскохозяйственного пестицида.
Некоторые штаммы, например Bacillus thuringiensis подвида kurstaki и Bacillus thuringiensis подвида aizawai, как найдено, обладают специфичностью к чешуекрылым. Bacillus thuringiensis подвида israelensis, как найдено, обладает специфичностью к двукрылым (Goloberg, патент США N 4,165,112). Другие штаммы, например Bacillus thuringiensis подвида tenebrionis (krieg и др., патент США N 4,766,203), как найдено, обладает специфичностью к жестокрылым. В 1966 г. появилось сообщение о выделении другого токсичного для жестокрылых штамма Bacillus thuringiensis (Hernnstadt и др., Bio/Technology т. 4, 305-308, 1986; патент США N 4,764,372, 1988). Этот штамм, обозначенный как "Bacillus thuringiensis подвид san diego", M-7, был депонирован в Северной региональной исследовательской лаборатории (NRRL) под регистрационным номером NRRL B-15939. Однако фирма Микоген, Корп., являющаяся правоприемником патента 372, публично сообщила о том, что Bacillus thuringiensis подвида san diego является Bacillus thuringiensis подвида tenebrionis. Впоследствии патент '372 был передан фирме Ново Нордиск А/С. Кроме того, раскрыт штамм B.t. с токсичностью для чешуекрылых и жестокрылых (PCT N WO 90/13651). Раскрытый в PCT заявке WO 90/13651 токсин имеет молекулярную массу в 81 кД.
В ходе своего цикла споруляции B.t. продуцирует белок-(и) в кристаллической форме, известной как кристаллический-(ие) дельта-эндотоксин-(ы) с молекулярной массой в интервале 27-140 кД, который-(ые) при усвоении личинками насекомого убивает их. В данном штамме B.t. токсичность может быть связана с одним или несколькими такими кристаллическими токсинами. Большинство дельта-эндотоксинов являются прототоксинами, которые в средней кишке целевого насекомого протеолитически превращаются в более мелкие (усеченные) токсичные полипептиды (Hofte и Whitely, 1989, microbiol. Res. 53, 242-255). Дельта-Эндотоксины кодируются cry (кристаллического белка) генами. Cry гены делят на шесть классов и несколько подклассов, основанных на сходстве в строении и пестицидной специфичности. Основные классы включают: специфичный к чешуекрылым (cryI); специфичный к чешуекрылым и двукрылым (cryII); специфичный к жестокрылым (cryIII); специфичный к двукрылым (cryIV) (Hofte и Whitely 1989, microbiol, Rev, 53, 242-255); специфичный к жестокрылым и чешуекрылым (назван cryV в работе Tailor и др., 1992, Mol, Microbil, 6, 1211-1217) и специфичный к нематодам (назван cryV и cryVI в работе Feitelson и др., 1992, 10, 271-275).
Дельта-эндотоксины получены и методами биотехнологии. Полученные методами биотехнологии дельта-эндотоксины могут быть, а могут и не быть кристаллическими.
B.t. дельта-эндотоксин нерастворим в воде за исключением щелочных значений pH, и почти всегда кодируется плазмидой. Показано, что некоторые штаммы Bacillus thurtingiensis продуцируют устойчивый к нагреванию пестицидный аденин-нуклеотидный аналог, известный как β- окзотоксин или тюрингиенсин, который сам по себе обладает пестицидной активностью (Sebesta и др. в издании "Борьба с насекомыми-вредителями и заболеваниями растений с помощью микробов", H. Burges (ред.), Академик Прес, Нью-Йорк, стр. 249-281, 1981). β- Экзотоксин обнаружен в надосадочных жидкостях некоторых культур Bacillus thuringiensis. Молекулярная масса токсина 789, и он состоит из аденозина, глюкозы и аларовой кислоты (Ziithy и др. в издании "Микробные и вирусные пестициды", Kurstak (ред.), Марсель Деккер, Нью-Йорк, 1982, стр. 35 - 72). Спектр хозяев для токсина включает (но без ограничения только ими): Musca domestica, Mamestra configurata Уолкера, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster и Tetranychus cinnabarinus. Токсичность β- экзотоксина, как полагают, связана с ингибированием направляемой ДНК РНК-полимеразы в конкурировании с АТФ. Показано, что β- экзотоксин кодируется Crу плазмидой в пяти штаммах Bacillus thuringiensis (B. t.) и что β- экзотоксин может быть классифицирован как β- экзотоксин типа I или типа II (Leviuson и др., 1990, J. Bacteriol. 1972, 3172-3179). Найдено, что β- экзотоксин типа I продуцируется B.t. подвида thuringiensis серотипа I, B.t. подвида tolworthi серотипа 9 и B.t. подвида darmstadiensis серотипа 10, а β- экзотоксин типа II, как обнаружено, продуцируется B. t. подвида morrisoni серотипа 8ab и проявляет активность против Leptinotarsa texana. Другие водорастворимые факторы, выделенные из B. t. , включают: альфа-экзотоксин (Luthu 1980, FEMS Microbiol. Lett., 8,1-7); гамма-экзотоксины, являющиеся разнообразными протеолитическими ферментами, в том числе лецитиназами, хитиназами и протеазами (Torsberg и др., 1976 Bacillus thuringicnsis: ее действие на характер окружающей среды. Национальный исследовательский совет Канады (НИСК), ассоциированный комитет НИСК по научной оценке состояния окружающей среды, подкомитеты по пестицидам и родственным соединениям и по биологическим явлениям); сигма-экзотоксин (Argauer и др., 1991, J. Entomol. Sci 26, 206-213) и ангидротюрингиенсин (CoII. Chechoslovak Chem. Comm, 40: 1775, 1975). Для повышения эффективности препаратов с Bacillus thuringiensis известны следующие средства: поиск новых, более эффективных штаммов, мутирование имеющихся штаммов для получения активных мутантов и создание смесей B.t. с другими пестицидными компонентами или усилителями пестицидной активности. Например, из патента США известен активатор пестицидной активности, полученный микробиологическим синтезом из культуры Bacillus thuringiensis. (См. Патент США 3911110, кл. A 01 N 15/00, 1975).
Известный активатор является белком, и потому ему присущи все недостатки нативных белков - нестабильность и высокая чувствительность.
Задача настоящего изобретения состоит в создании активатора пестицидной активности препаратов с B.t., не имеющего белковой природы. Для краткости активатор пестицидной активности по изобретению упоминается далее как "фактор".
3. Более конкретно, фактор настоящего изобретения является усиливающим фактором. В применяемом здесь значении "усиливающий фактор" - это вещество, не обладающее заметной пестицидной активностью, характеризующееся, например, значением ЛК50 (ЛК50 - концентрация вещества, необходимая для уничтожения 50% вредителей) выше 3000 мкг/г при определении биоанализом (см. раздел 6), но действие которого увеличивает пестицидную активность родственного штамму Bacillus пестицида по меньшей мере на 50% и которое не вызывает остановку роста личинок. Как отмечалось в разделе 2, другие известные специалистам вещества, способные усиливать пестицидную активность, например дельта-эндотоксины, ингибиторы трипсина и окзотоксины, обладают пестицидной активностью.
В характерном воплощении изобретения фактор растворим в воде. В применяемом здесь значении вещество или соединение "растворимо в воде", если по меньшей мере 1 мг вещества может быть растворено в 1 мл воды. Фактор также способен усиливать пестицидную активность химического пестицида и/или вируса с пестицидными свойствами.
В применяемом здесь значении родственный штамму Bacillus пестицид - это Bacillus (например, Bacillus thuringiensis или Bacillus Subtilis) штамм, споры или вещество, например белок или его фрагмент с активностью против или уничтожающее вредителей; вещество, обеспечивающее защиту растений, например отбивающее аппетит вещество или микроорганизм, способный экспрессировать ген Bacillus, кодирующий Bacillus белок или его фрагмент, обладающие активностью против или уничтожающие вредителей (например, дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis) и приемлемый носитель (примеры таких носителей см. раздел 5.2 ниже). Вредитель может быть представлен, например, насекомым, нематодой, клещом или улиткой. Микроорганизм, способный экспрессировать Bacillus ген, кодирующий Bacillus белок или его фрагмент, которые обладают активностью против или уничтожают вредителей, местом обитания имеет филлоплоскость (поверхность листьев растений) и/или ризосферу (почва, окружающая корни растения), и/или водную среду. При этом микроорганизм способен успешно конкурировать в конкретной среде (собранный урожай и другие места обитания насекомых) с микроорганизмами дикого типа и обеспечивать устойчивый уровень экспрессии Bacillus гена, кодирующего Bacillus белок или его фрагмент, проявляющие активность против или уничтожающие вредителей. Примеры таких микроорганизмов включают (но без ограничения только ими) бактерии, например, рода Bacillus, Pseudomonas Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillius, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes и Clostridium; водоросли, например, семейств Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhodophyceae, Dinophyceae, Chrysophyceae, Prymnesiophyceae, Xanthophyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptophyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae и Chlorophyceae; грибки, в частности дрожжи, например, рода Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium.
В применяемом здесь значении "пестицидная активность" является мерой активности вредителей путем их уничтожения или остановки их роста или мерой защиты растений от поражения вредителем.
Изобретение кроме того относится к мутантному или вариантному штамму Bacillus, в котором фактор образуется в больших количествах по сравнению с родоначальным штаммом, а также к способам получения таких мутантов или вариантов.
Изобретение относится также к пестицидным препаратам, содержащим фактор и пестицидный носитель, а также фактор и родственный с Bacillus пестицид, химический пестицид и/или вирус с пестицидными свойствами.
Кроме того изобретение относится к способам применения пестицидных препаратов настоящего изобретения. В одном из своих воплощений изобретение относится к способу борьбы с вредителями, заключающемуся в действии на вредителей эффективного для борьбы с вредителями количества препарата. В другом своем воплощении изобретение относится к способу снижения устойчивости вредителя к родственному Bacillus пестициду, заключающемуся в действие на вредитель препарата, содержащего фактор и пестицидный носитель. Кроме того изобретение относится к способу усиления пестицидной активности родственного штамму Bacillus пестицида. Способ состоит во введении вредителю, обработанному родственным с Bacillus пестицидом, препарата, содержащего фактор и носитель, в количестве, эффективном для усиления пестицидной активности родственного со штаммом Bacillus пестицида.
Изобретение направлено также на способ получения "по существу чистого" фактора, включающего стадии:
(a) ферментации штамма Bacillus
(b) отделения надосадочной жидкости стадии (a) и
(c) выделения фактора из надосадочной жидкости.
Кроме того изобретение направлено на способ идентификации фактора настоящего изобретения. Способ состоит в
(a) ферментации штамма Bacillus
(b) отделении от продукта ферментации стадии (a) надосадочной жидкости и
(c) испытание надосадочной жидкости стадии (b) на способность усиливать связанный с Bacillus пестицид.
4. Краткие пояснения к диаграммам
На фиг. 1 схематически представлена общая методика, применяемая для очистки соединения Ia.
На фиг. 2 приведен 13С ЯМР-спектр соединения Ia.
На фиг. 3 приведен протонный ЯМР-спектр соединения Ia.
На фиг. 4 показана установленная структура соединения Ia. Протонные 1H и 13C сдвиги даны в ч/млн, регистрируемых в D2O.
На фиг. 5 приведена схема синтеза для получения соединения формулы Ia.
Настоящее изобретение относится к фактору, усиливающему пестицидную активность связанного с Bacillus пестицида. Молекулярная масса фактора 350-1200 или в специфичном варианте 350-700.
Фактор настоящего изобретения усиливает пестицидную активность родственного с Bacillus пестицида по меньшей мере в 1,5 раза, но и возможно и в 1000 раз, предпочтительно от 100 раз до 400 раз. В характерном варианте фактор настоящего изобретения усиливает пестицидную активность Bacillus thuringiensis дельта-эндотоксина, в том числе (но без ограничения только ими) CryI (включая, но без ограничения только ими, CryIA, CryIB и CryIC), CryII, CryIII, CryIV, CryV или CryVI белок полной длины или в протеолитически измененной усеченной форме от 1,5 раза до 1000 раз. В наиболее характерном варианте фактор настоящего изобретения усиливает B.t. дельта-эндотоксин от 100 раз до 400 раз. Фактор также способен усиливать пестицидную активность химического пестицида и/или вируса с пестицидными свойствами.
Фактор также может быть растворим в воде, быть устойчивым в воде вплоть до 100oC в течение по меньшей мере 5 минут, быть устойчивым к действию прямого солнечного света в течение по меньшей мере 10 часов и/или быть устойчивым при pH около 2 в течение примерно 10 дней.
В характерном варианте фактор содержит 13 - 24 атомов углерода. В более характерном варианте фактор содержит 13 - 19 атомов углерода. В наиболее характерном варианте фактор содержит около 13 атомов углерода.
В характерном варианте фактору соответствует формула (I):
в которой R1 представляет аминогруппу, гидроксигруппу, C1-C10-алкил, бензамидогруппу, 3,5-динитробензамидогруппу, п-нитробензамидогруппу, галогенбензамидогруппу, алкилбензамидогруппу, тиофенамидогруппу, фуранамидогруппу, C1-C10-алкиламиногруппу, C1-C10-диалкиламиногруппу, C1-C10-алкиловый или бензиловый эфир, галоген или C1-C10-алкоксигруппу;
R2 представляет (CH2)n, где n=0-10;
R3 и R4 независимо представляют (NH)p, где p=0 или 1;
R5 представляет
или (CHOH)qCH2OH,
где X1, X2, X3, X4, X5, X6 и X7 независимо представляют NH2, OH, ацетил, галоген или C1-C10-алкоксигруппу и q=1-10;
R6 представляет гидроксил, аминогруппу, C1-C10-алкокси- или бензоксигруппу, бензиловый эфир, 3,5-динитробензиловый эфир, п-нитробензиловый эфир, алкилбензиловый эфир, тиофеновый эфир, фурановый эфир, пирроловый эфир, имидазоловый эфир, или пестицидно приемлемая соль фактора, в том числе (но без ограничения только ими) фосфат, сульфат, ацетат, карбонат и нитрат.
В наиболее характерном варианте указанному фактору соответствует формула (Ia):
5.1. ПОЛУЧЕНИЕ ФАКТОРА
Фактор настоящего изобретения может быть получен из продукта ферментации Bacillus (например, Bacillus subtilis, Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis). В характерном варианте фактор настоящего изобретения может быть получен из надосадочной жидкости продукта ферментации Bacillus thuringiensis в том числе (но без ограничения только ими) Bacillus thuringiensis подвида kurstaki, Bacillus thuringiensis подвида aizawai, Bacillus thuringiensis подвида galeriae, Bacillus thuringiensis подвида entomocidus, Bacillus thuringiensis подвида tenebrionis, Bacillus thuringiensis подвида thuringiensis, Bacillus thuringiensis подвида alesti, Bacillus thuringiensis подвида canadiensis, Bacillus thuringiensis подвида darmstadiensis, Bacillus thuringiensis подвида dendrolimus, Bacillus thuringiensis подвида finitimus, Bacillus thuringiensis подвида kenyal, Bacillus thuringiensis подвида morrizoni, Bacillus thuringiensis подвида subtoxicus, Bacillus thuringiensis подвида toumanoffi и Bacillus thuringiensis подвида israelensis.
В рекомендуемом варианте фактор может быть получен из надосадочной жидкости культуры Bacillus thuringiensis подвида kurstaki, Bacillus thuringiensis подвида aizawai или Bacillus thuringiensis подвида galleriae или их мутантов, обладающих по существу той же усиливающей активностью. В характерном варианте фактор выделяют из cry- spo- мутанта Bacillus thuringiensis подвида к lak
В одном из вариантов фактор может быть получен из мутной Bacillus, в частности, мутанта Bacillus thuringiensis, в котором усиливающая активность фактора, получаемого из мутанта, выше по сравнению с родоначальным штаммом, или мутанта Bacillus thuringiensis, в котором фактор продуцируется в больших количествах. Термин "родоначальный штамм" в применяемом здесь значении означает исходный штамм Bacillus до мутагенеза. Для создания таких мутантов родоначальный штамм может быть, например, обработан мутагеном химическими средствами, такими как N-метил-N'-нитрозо-N-нитрозогуанидином или этилметансульфонатом или подвергнут гамма-облучению, рентгеновскому или УФ-облучению. Если конкретно, то в одном из способов мутирования штаммов Bacillus и отбора мутагенов родоначальный штамм подвергают:
I) обработке мутагеном;
II) полученные в результате обработки мутанты выращивают в среде, приемлемой для отбора мутантного штамма;
III) отбирают мутантный штамм.
Согласно рекомендуемому варианту такого способа отобранные колонии выращивают в нормальной продуцирующей среде и затем проводят окончательный отбор штаммов, способных продуцировать фактор в увеличенных количествах.
Bacillus может быть культивирована применением среды и технологии ферментации, известных специалистам (см. например: Rogoff и др., 1969, J.Invertebrate Path. 14, 122-129; Dulmage и др., 1971, J.Invertebrate Path. 18, 353-358; Dulmage и др. , в издании "Борьба с вредителями и заболеваниями растений с помощью микробов", H. D.Burges (ред.), Академик Пресс, К.-Й., 1980). По окончании цикла ферментации надосадочная жидкость может быть обработана с выделением из ферментационного бульона B.I. спор и кристаллов способами, хорошо известными специалистам, например: центрифугированием и/или ультрафильтрованием. Фактор настоящего изобретения содержится в надосадочной жидкости, из которой может быть выделен известными специалистам способами, например: ультрафильтрованием, испарением и сушкой распылением. Данная методика описана более обстоятельно в последующих разделах.
Или же фактор настоящего изобретения может быть получен химическим синтезом применением известных специалистам методик. Как отмечалось выше, в характерном варианте фактору соответствует формула (Ia):
Схема синтеза приведена на фиг. 5. Использованием Boc (трет-бутилкарбамата) в 2,3-диаминопропионовую кислоту (ДАПК) вводят защитные группы. Полностью N-защищенная ДАПК может быть превращена в имидазоил обработкой диимидазоевым карбонатом с образованием соединения A (см. фиг. 5). Соединение B (см. фиг. 5) может быть получено из 3-амино-3-дезоксиальдоновой кислоты селективным замещением концевого первичного спирта применением бензолсульфонильной отходящей группы. Конденсация соединения A и B может быть осуществлена в условиях реакции Хулиа (NaH, ТГФ), после чего следует обессеривание в присутствии Никеля Ренея. Кетогруппа в соединении C (см. фиг. 5) может быть стереоселективно восстановлена с помощью хелатного регулирования применением трис(ацетоксиборгидрида) натрия. Деблокированное соединение C может быть обработано иесцианатом D, полученным из ДАПК, с образованием соответствующего уреидопроизводного, деблокированием которого гидрогенолизом получают соединение (Ia).
В одном из воплощений изобретения аминогруппы соединения (Ia), полученного синтетически или из надосадочной жидкости культуры Bacillus, могут быть ацилированы хлорангидридом кислоты или ангидридом кислоты в присутствии водного гидроксида натрия с получением триацетамидов, трибензамидов и триоктамидов соединения (Ia). Или же амино- и гидроксигруппы могут быть перацилированы первоначальным образованием метиловых эфиров обработкой избытком диазометана с последующим перацилированием амино- и гидроксигрупп обработкой ацилангидридом (например, уксусным ангидридом, ангидридом бензойной кислоты, ангидридом н-октановой кислоты) в пиридине. В другом варианте на основе ацилированного производного может быть приготовлен смешанный амидоэфир путем селективного метилирования карбоксила и последующей обработки ацилангидридом в пиридине. В еще одном варианте карбоновая кислота может быть дериватизирована с образованием алкиловых или ариловых эфиров или амида. И в еще одном варианте может быть проведено селективное окисление гидроксизаместителей в кетон и аналоги карбоновой кислоты с укороченной цепью.
В другом воплощении изобретения аминогруппы соединения (1а) могут быть защищены в виде трет-бутилкарбаматов обработкой Boc-ангидридом в присутствии водного карбоната натрия, после чего селективной защитой гидроксильных групп применением бензилбромида и гидрида натрия получают нижеследующее соединение (X):
Применением водного гидроксида натрия такое полностью защенное производное может быть гидролизовано по уреидосвязи. За гидролизом может последовать селективное ацилирование, например, аминокислотами, гидроксикарбоновыми кислотами или дикарбоновыми кислотами, в том числе (но без ограничения только ими) аспартиновой кислотой, глютаминовой кислотой, 2-аминоадипиновой кислотой, яблочной кислотой, адипиновой кислотой в присутствии N,N-дициклогексилкарбодиимида (ДЦК). Удалением N-Boc и O-бензильной групп мягким кислотным расщеплением и гидрогенолизом над палладием на активированном угле может быть получено соединение следующей формулы (II)
В еще одном варианте полностью защищенное соединение (X) может быть обработано разнообразными изоцианатами, происходящими из аминокислот, в том числе (но без ограничения только ими): глицина, аланина, валина, фенилаланина, фенилглицина, метионина, норметионина, с получением 9-уреидопроизводных. Удалением защитных групп вышеописанными способами может быть получено соединение нижеследующей формулы (III):
в которой R представляет природную аминокислоту.
И в еще одном варианте 2,3-диаминопропионовую кислоту защищают в 2-положении применением Boc в присутствии водного карбоната натрия и получают N-2-Boc-2,3-диаминопропионовую кислоту. Это производное может быть ацилировано перацетилальдоновыми кислотами, в том числе (но без ограничения только ими): пента-O-ацетил-D-глюконовой кислотой, пента-O-ацетил-D-маиновой кислотой, пента-O-ацетил-D-галактоновой кислотой, гепта-O-ацетил-D-эритро-1-маннолактаановой кислотой в присутствии ДЦК с последующим сольволизом ацетильных групп и Boc-групп в присутствии метанольного аммиака (Chem. Pharm. Bull. 1955, 33, 509-514). Обработкой кислотой в мягких условиях может быть получено полигидроксиамидоаналоги формулы (IV):
где n = 1-10.
Та же последовательность может быть применена использованием перацетилированных альдариновых кислот, например D-глюкаро-6,3-лактона с образованием полигидроксипроизводных с первичными концевыми карбоксамидогруппами.
В еще одном варианте защищенное производное 2,3-диаминопропионовой кислоты соединяют с изоцианатом, происходящего из производного аминосахара, в присутствии эквивалента фосгена. Аминосахар в одном из вариантов может быть представлен 1- или 2-аминогексозой (например, 1-амино-1-дезоксисорбитом, глюкозамином, маннозамином), соответствующим формуле (V):
в которой n = 1-10.
Очистка фактора настоящего изобретения может быть осуществлена различными известными специалистам методами, в том числе (но без ограничения только ими) хроматографией (например, ионообменной, аффинной и колоночной гель-хроматографией), электрофоретическими методами, основанными на различной растворимости методами, экстрагированием или любыми другими известными специалистам стандартными методами.
Усиливающее действие фактора настоящего изобретения на пестицидную активность связанного с Bacillus пестицида, вируса с пестицидной активностью или химического пестицида против различных насекомых-вредителей может быть выявлено с помощью известных специалистам методик, например скармливание насекомым искусственной пищи, покрытие искусственной пищей, смазывание листьев, погружение листьев и опрыскивание листвы. Характерные примеры подобных анализов приведены в разделе 6 (см. ниже).
5.2. Содержащие фактор препараты
Вышеохарактеризованный фактор настоящего изобретения может быть введен вместе со связанным с Bacillus пестицидом и приемлемым носителем в состав пестицидного препарата-(ов), которые могут иметь вид, например, суспензии, раствора, эмульсии, порошка дуста, диспергируемых гранул, смачиваемого порошка, эмульгируемого концентрата, аэрозоля или пропитанных гранул. Примеры подобных связанных с Bacillus пестицидов включают (но без ограничения только ими) пестициды, продуцируемые Bacillus thuringiensis подвида kurstaki (B.t. k.) (поставляется под фирменным названием ДИПЕЛЬТМ фирмой Эббот Лабореториз, Инк. , ДЖАВЕЛИНТМ фирмой Сэндоз, ВИОБИТТМ фирмой Ново Нордиск А/С, ФОРЕЙТМ фирмой Ново Нордиск А/С, МВПТМ фирмой Микоген, БАКТОСПЕЙНТМ фирмой Ново Нордиск А/С и ТЮРИЦИЙДТМ фирмой Сэндоза и Bacillus thuringiensis подвида aizawai (B.I.a) (поставляется под фирменным названием ФЛОРБАКТМ фирмой Ново Нордиск А/С и КСЕНТАРИТМ фирмой Эббот Лабореториз, Инк). Дополнительные примеры включают (но без ограничения только ими) Bacillus thuringiensis подвида (B. t. i. ) (поставляется под фирменным названием БАКТИМОСТМ фирмой Ново Нордиск А/С и ВЕКТОБАКТМ фирмой Эббот Лабореториз, Инк.); Bacillus thuringiensis (B. sphr. ) (поставляется под фирменным названием СФЕРИМОСТМ фирмой Ново Нордиск А/С); Bacillus thuringiensis kurstaki/tenebrionis (поставляется под фирменным названием ФОЙЛЬТМ фирмой Экоген); Bacillus thuringiensis aizawai/kurstaki (B.t.a./B.t.k.) (поставляется под фирменным названием КОНДОРТМ фирмой Экоген и ЭГРИТМ фирмой Сиба-Гейги) и Bacillus thuringiensis kurstaki/kurstaki (B.t.k./B.t.k.) (поставляется под фирменным названием КАТЛАССТМ фирмой Экоген). Вирус с активностью против вредителей может быть представлен бакуловирусом, например Autographa Californica ядерного полиадроза вирус (ЯПВ), Syngrapha falcifera ЯПВ, Cydia pomonella ГВ (гранулоза вирус), Heliothis zla ЯПВ, Zymantria dispar ЯПВ, Orgyia pseudotsugota ЯПВ, Spodoptera exigua ЯПВ, neodiprion lecoutei ЯПВ, Neodiprion sertifer ЯПВ, Harrisina brilliaus ЯПВ и buolopiza viteana Clemens ЯПВ.
В препаратах, содержащих фактор и связанный с Bacillus пестицид, фактор может присутствовать в количестве по меньшей мере 0,002 г/БME. В одном из вариантов фактор может соответствовать формуле Ia и/или может присутствовать в количестве по меньшей мере 0,1 г/БМЕ или 0,05 г фактора на г Bacillus дельта-эндотоксина и спор, возможно 300 г/БМЕ или 150 г фактора на г Bacillus дельта-эндотоксина и спор, предпочтительно 2 г/БМЕ или 1 г фактора на г Bacillus дельта-эндотоксина и спор. В применяемом здесь значении "БМЕ" - это биллион международных единиц при определении биоанализом. В биоанализе образец сравнивается со стандартным ссылочным продуктом Bacillus при использовании в качестве стандартного испытуемого насекомого Trichoplusiani или другого насекомого-вредителя. Эффективность определяют делением ссылочного стандартного значения ЛК50 с последующим умножением на эффективность ссылочного стандарта.
В другом варианте препарат может содержать фактор настоящего изобретения по существу в чистом виде или надосадочную жидкость из культуры Bacillus в сухой, концентрированной или жидкой форме и приемлемый пестицидный носитель, примеры которых приводятся ниже. Такой препарат может быть нанесен отдельно на растение, например трансгенные растения. В особых случаях препарат может быть нанесен на растение, ранее содержащее Bacillus, например, содержавшее B.t. ген. В другом варианте препарат может быть нанесен на растение, подвергавшееся ранее действию Bacillus, например, действие препарата B.t., присутствующего в количестве по меньшей мере 0,01% и вплоть до 60%.
Препарат, содержащий фактор и пестицидный приемлемый носитель, помимо борьбы с вредителями может быть также использован для уменьшения устойчивости вредителя к пестициду. Или же препарат может применяться для усиления связанного с Bacillus пестицида. В одном варианте препарат может быть нанесен одновременно с пестицидом в количестве по меньшей мере 2 г фактора/БМЕ и возможно вплоть до 300 г фактора БМЕ. В другом варианте препарат может быть нанесен вплоть до 24 часов спустя после пестицида в качестве вспомогательного средства, продлевающего срок действия оставшегося пестицида.
Вышеохарактеризованные препараты могут быть приготовлены добавлением поверхностно-активного вещества, инертного носителя, консерванта, стимулятора питания, аттрактанта, капсулирующего средства, эмульгатора, красителя, защищающего от действия УФ вещества, буфера, добавки для повышения текучести или иного компонента, облегчающего работу с продуктом и его применение для борьбы с конкретным вредителем.
Приемлемые поверхностно-активные вещества включают (но без ограничения только ими): анионные соединения, такие как карбоксилат, например металлический карбоксилат длиноцепной жирной кислоты; N-ацилсариозинат; моно- или диэфиры фосфорной кислоты с жирными спиртами, этоксилаты или соли таких эфиров; сульфаты жирных спиртов, например натрийдодецилсульфат, натрийоктадецилсульфат или натрийцетилсульфат; этоксилированные сульфаты жирных спиртов; этоксилированные сульфаты алкилфинолов; лигнинсульфонаты; нефтяные сульфонаты; алкиларилсульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты или (низший алкил) нафталинсульфонаты, например бутилнафталинсульфонат; соли сульфонированных продуктов конденсации нафталина с формальдегидом; соли сульфонированных продуктов конденсации фенола с формальдегидом; а также более сложные сульфонаты, такие как амидосульфонаты, например сульфонированные продукты конденсации олеиновой кислоты с N-метилтаурином или диалкилсульфосукцинаты, например натрийсульфонат или диоктилсукцинат. Неионные поверхностно-активные вещества включают продукты конденсации эфиров жирных кислот, жирных спиртов или фенолов, замещенных жирным алкилом или алкенилом, с этиленоксидом, жирные эфиры простых эфиров многоатомных спиртов, например эфиры сорбита с жирными кислотами, продукты конденсации указанных эфиров с этиленоксидом, например эфиры полиоксиэтиленсорбита с жирными кислотами, блок-сополимеры этиленоксида с пропиленоксидом, ацетиленовые гликоли, например 2,4,7,9-тетраэтил-5-децин-4,7-диол или этоксилированные ацетиленовые спирты. Примеры катионных поверхностноакитвных веществ включают, например, алифатический моно-, ди- или полиамин в виде ацетата, нафтената или олеата, кислородсодержащий амин, например аминооксид полиоксиэтиленалкиламина; амин с амидосвязью, полученный конденсацией карбоновой кислоты с ди- или полиамином, или четвертичную аммониевую соль.
Примеры инертных веществ включают (но без ограничения только ими) минералы, например каолин, филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты или ботанические продукты, например пробку, порошок из кукурузных початков, шелуху арахиса, шелуху риса и скорлупу ореха.
Препараты настоящего изобретения могут иметь приемлемую форму для непосредственного употребления или могут представлять собой концентрат или первичный препарат, требующие разбавления соответствующим количеством воды или иного разбавителя перед употреблением. Концентрация пестицида будет меняться в зависимости от природы конкретного препарата, т.е. будет ли это концентрат или препарат для непосредственного применения. Препарат содержит 1-98% твердого или жидкого инертного носителя и 0-50%, предпочтительно 0,1-50% поверхностно-активного вещества. Такие препараты вносятся в указанном на этикетке продажного продукта количестве, предпочтительно в дозировке 0,009-4,6 кг/га в случае сухого препарата и 0,012-11,68 л/га в случае жидкого препарата.
В другом варианте Bacillus, например, B.t. кристаллический дельта-эндотоксин и усиливающий фактор могут быть перед введением в препарат подвергнуты предварительной обработке с целью пролонгировать пестицидную активность препарата при его внесении в среду обитания целевого насекомого-вредителя при условии, что такая предварительная обработка не оказывает неблагоприятного воздействия на кристаллический дельта-эндотоксин или фактор. Подобная обработка может быть осуществлена химическими и/или физическими средствами при условии, что обработка не влияет неблагоприятно на свойства препарата-(ов). Примеры химических реагентов включают (но без ограничения только ими) галогенирующие средства; альдегиды, например формальдегид и глутаральденид; противоинфекционные вещества, например хлорид зефирана; спирты, например изопропанол и этанол, и гистологические фиксаторы, например фиксатор Воуина и фиксатор Хелли (см., например Aumasou "Техника обработки тканей животных", У.Х. Фриман энд. Ко., 1967).
Препараты изобретения могут быть нанесены непосредственно на растение, например, опрыскиванием или опылением в момент начала появления вредителей на растения или до появления на растении вредителей в качестве защитной меры. Растения, подлежащие защите в объеме настоящего изобретения, включают (но без ограничения только ими) зерновые (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, сорго и родственные им культуры), свеклу (сахарная свекла и кормовая свекла), косточковые, семечковые и ягодные культуры (яблони, груша, слива, персик, миндаль, вишня, малина, земляника и ежевика), бобовые растения (альфа-альфа, бобы, горох, соя), масличные растения (рапс, горчица, мак, оливы, подсолнечник, кокосовый орех, дающие касторовое масло растения, бобы какао, земляной орех), огурцовые растения (огурец, кабачок, дыня), волоконные растения (хлопок, лен, конопля, джут), цитрусовые культуры (апельсин, лимон, грейпфрут, мандарин), овощи (шпинат, салат, аспарагус, капуста и другие brassical, морковь, лук, томаты, картофель, паприка), лавровые (авокадо, корица, камфорное дерево), лиственные и хвойные деревья (например, липа, тисс, дуб, ольха, тополь, береза, ель, лиственница, сосна) или такие растения, как кукуруза, трава газонов, табак, орех, кофе, сахарный тростник, чай, виноградная лоза, банан, природный каучуконос, а также декоративные растения. В обоих случаях рекомендуемый способ применения состоит в опрыскивании листвы. Как правило, важно добиться хороших результатов в борьбе с вредителями на ранних стадиях развития растения, поскольку именно на этой стадии растение может быть наиболее тяжко повреждено. При опрыскивании или опылении может быть внесен и другой пестицид, если его применение считается необходимым. В рекомендуемом варианте препарат изобретения наносят непосредственно на растение.
Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут оказаться эффективными против насекомых-вредителей, включающих (но без ограничения только ими) вредители отряда чешуекрылых (см. в конце описания).
Следующие примеры представлены в виде иллюстрации, но не ограничения изобретения.
6. Пример. Характеристика соединения Ia
Ниже следует подробное описание выделения и очистки соединения Ia. Подробная характеристика соединения Ia приводится ниже.
6.1. Выделение и очистка соединения Ia
B. thuringiensis подвида kurstaki штамм ЕМСС0086 (депонирован в NRRL под шифром B-21147) ферментируют 72 часа при 30oC в среде, содержащей источник углерода, например крахмал, гидролизованный крахмал или глюкозу, и источник азота, например белок, гидролизованный белок или раствор от замачивания кукурузы. Продуцирование соединения Ia обнаруживается спустя 13 часов от начала ферментации. При активности наблюдается примерно через 30 часов.
Надосадочную жидкость от продукта ферментации B. thuringiensis подвида kurstaki отделяют центрифугированием и затем осветляют ультрафильтрованием через 30 кДа МВ-СО мембрану применением Рон Псуленк UF системы. Фильтрованием через 30 кДа мембрану удаляются любые оставшиеся клеточные осколки, кристаллический дельта-эндотоксин, споры и растворимый белок с молекулярной массой выше 30 кДа. Прошедший через мембрану продукт центрифугируют и последующим фильтрованием через фильтр на 0,2 мкм дополнительно удаляют нерастворимые вещества из бульона и получают прозрачный бульон, содержащий соединение Ia.
Очистку соединения Ia до однородного состояния осуществляют применением многостадийной методики очистки, показанной схематически на фиг. 1. В сочетании с вышеприведенной методикой выделения очистку проводят на стадии ультрафильтрования с мембраной на 5 кДа. Продукт со стадии ультрафильтровании адсорбируют на катионообменной смоле Сульфопропил (СП) и элюируют раствором ацетата аммония. Смесь затем концентрируют примерно в 30 раз лиофилизацией, соль и другие примеси удаляют на колонке БиоРад Р2 для гельхроматографии. Объединенный продукт из Р2 колонки пропускают через СП ВЭЖХ катионообменную колонку высокого разрешения с получением однородного соединения. Примесную соль удаляют неоднократной лиофилизацией.
Активность соединения выявляют микробиоанализом на Spоdoptera exigua чистоту соединения определяют капиллярным электрофорезом. В отдельные лунки желейного планшета, содержащие 500 мкл отвержденного искусственного питания насекомых, вносят образцы, состоящие из 50 мкл соединения Ia и 50 мкл CryIA(c) белка (15 мкг/мл), выделенного из БИОБИТТМ ТК (100 мкл). Планшеты, содержащие различные образцы, сушат на воздухе. В лунки с высушенными образцами вносят две-четыре личинки Spodоptera exigua на 2-ой или ранней 3-ей возрастной стадии. Лунки закрывают миларом с отверстиями и инкубируют 2-3 дня при 30oC. Затем регистрируют степень задержки роста и процент смертности. Обычно для каждого образца опыт проводят в 5 дублирующих лунках.
6.2. Определение строения
Найдено, что активное соединение растворимо в воде и нерастворимо в органических растворителях. Соединение положительно заряжено и реагирует с нингидрином, с чем свидетельствует тонкослойная хроматография на силикагеле. 13C и протонного ЯМР-спектры соединения приведены на фиг. 2 и 3 соответственно. 13C ЯМР-анализом выявлено присутствие в соединении 13 атомов углерода. ЕРТ анализом установлено наличие в соединении трех четвертичных углеродов (C), семь метиновых групп (CH), трех метиленовых групп (CH2) и отсутствие метильных групп (CH3). Применением опытов со спариванием протонов, таких как I-D расспаривание и COSY идентифицирована одна большая спиновая система, содержащая восемь углеродов. Опыты с двухмерной корреляцией углерод-протон (HETCOR) позволил приписать каждый протонный резонанс в молекуле определенному связанному с ним углероду (см. фиг. 4).
Обработка активного соединения (13 мг) уксусным ангидридом в пиридине приводит к образованию ацетилированного производного, отличающегося гораздо меньшей полярностью. Очисткой полученного производного метода ВЭЖХ получают 3 мг чистого ацетилированного производного. Масс-спектроскопическим анализом установлено, что производное имеет
7 ацетатных групп и молекулярную массу 690, что дает молекулярную массу для неацетилированного соединения 396 и указывает на присутствие четного числа атомов азота. Кроме того обнаружены фрагменты 6 ацетатов и 5 ацетатов. Данные высокого разрешения для 6- и 5-ацетатных дочерних иодов соответствует 646,2594 (6 ацетатов) и 607,2519 (5 ацетатов), что указывает на следующую молекулярную формулу, соединения Ia: C13H28N6O8.
Обработка активного соединения (13 мг) 6 н. HCl дает положительное на нингидрин производное. Полученные результаты указывают на присутствие амидных связей. Производное характеризуется при определении тонкослойной хроматографией тем же значением P, что и 2,3-диаминопропионовая кислота. Эти результаты в сочетании с данными ЯМР предполагают присутствие 2,3-диаминопропионовой кислоты.
Соединение может быть классифицировано как уреидсамид. Компоненты структуры включают: 2 карбоксила (1 амидированный), фрагмент мочевины, три аминогруппы и четыре гидроксила. Соединение содержит семь хиральных центров.
6.3. Свойства соединения Ia
Выделенное соединение Ia, как обнаружено, усиливает активность Bacillus thuringiensis подвида kurstaki и Bacillus thuringiensis подвида aizawai кристаллических дельта-эндотоксиновых пестицидных белков по отношению к Spodoptera exigua вне зависимости от формы пестицидных белков. Пестицидная активность введенного в состав препарата B.t.k., выделенных кристаллов, белка полной длины (молекулярная масса 130 кДа) или усеченного CryIA белка (молекулярная масса ≈ 65 кДа) во всех случаях усиливается. Активность CryII и CryIC включений также усиливается. Кроме того обнаружено, что соединение усиливает активность отдельных усеченных CryIA (a), (b) и (с) белков. Время инкубирования соединения Ia с Cry белком, как найдено, не имеет особого значения для биоактивности. Однако, само по себе соединение Ia неактивно. Уровень усиления, как обнаружено, составляет 100-200 раз для усеченных CryIA белков, CryII и CryIC включений и примерно 320 раз для белка CryIA (c) полной длины (см. таблицы 1 и 2 соответственно). Если конкретно, то белок CryIA (c) полный длины в количестве 0,75 мкг/мл при включении соединения Ia оказывает на смертность/степень задержки роста тот же эффект, что и один CryIA (c) в количестве 240 мкг/мл. В случае усеченного CryIA (c) образец с ОП280 0,0006 в присутствии соединения Ia дает такую же степень задержки роста, что и такой же образец CryIA (c), испытанный без соединения Ia и имеющий ОП280 0,075, CryII включения в концентрации 0,6 мкг/мл дает в комбинации с соединением такую же степень задержки роста и ту же смертность, что и один CryII белок в концентрации 75 мкг/мл, т.е. происходит 125-кратное усиление. CryIC включения при 0,3 мкг/мл при добавлении соединения Ia дают такие же показатели смертности и степени задержки роста, что и один CryIC белок в концентрации 75 мкг/мл (250-кратный уровень усиления). Белок CryIA в концентрации, дающей только задержку роста, при добавлении соединения Ia приводит к смерти насекомых.
Найдено, что соединение Ia сохраняет стабильность при кипячении в течение 5 минут, но теряет всякую активность при выдерживании в автоклаве (> 190oC). Кроме того, соединение устойчиво на прямом солнечном свету по меньшей мере 10 часов. Соединение Ia устойчиво при pH 3 в течение 3 дней, но неустойчиво при pH 12. Найдено, что соединение теряет всякую активность под действием перйодной кислоты и концентрированной HCl.
6.4. Выявление других подвидов Bacillus thuringiensis и других видов Bacillus
Несколько видов Bacillus проверено на продуцирование соединения Ia. Штаммы ферментируют 72 часа при 30oC в среде, содержащей источник углерода, например крахмал, гидролизованный крахмал или глюкозу, и источник азота, например белок, гидролизованный белок или раствор от вымачивания кукурузы. Надосадочные жидкости испытывают на продуцирование соединения Ia применением вышеописанного микроанализа со Spodoptera exigua. Найдено, что B.thuringiensis подвида aizawai штамм EMCC0087 (депонирован в NRRL под шифром NRRL B-21148) и B. thuringiensis подвида galleriae (депонирован в NRRL) продуцируют соединение Ia примерно в тех же концентрациях, что и B. thuringiensis подвида kurstaki.
Соединение Ia кроме того продуцируется в B.subtilis, B.cereus, B.t. подвида alesti, B.t. подвида canadiensis B.t. подвида darmstadiensis, B.t. подвида dendrolimus, B. t. подвида entomocidus, B.t. подвида finitinus, B.t. подвида israelensis, B.t. подвида kenyae, B.t. подвида morrisoni, B.t. подвида subfoxicus, B.t. подвида tenebrionis, B.t. подвида thuringiensis и B.t. подвода toumanoffi, B. cereus, B.suftilis и B. thuringiensis подвида kurstakiery-spo- мутанте согласно определению капиллярным электрофорезом.
Для электрофореза применяют капиллярную электрофоретическую систему Бекман P/ACE, снабженную капиллярным без покрытия размером 50 мкм х 57 см, в 0,2 М фосфатном (pH 6,8) буфере, напряжении 15 кВ и детектировании при 200 нм для количественного определения соединения Ia. Объем образца 20 нм, время определения 25 минут.
Стандартную кривую строят применением в качестве стандарта очищенного соединения Ia в концентрациях 1,25 мг/мл, 0,625 мг/мл, 0,3125 мг/мл, 0,156 мг/мл и 0,078 мг/мл. Получают линейную калибровочную кривую. Для определения концентрации соединения Ia в каждом образце пользуется итоговым уравнением: y = mx + b.
Перед каждым опытом через капилляр в течение трех минут пропускают рабочий буфер (0,2 М фосфата, pH 6,8). После каждого определения продолжительностью 25 минут через капилляр 1 минуту пропускают 1 н. NaOH, 1 минуту пропускают профильтрованную воду для ВЭЖХ, 3 минуты - 0,5М фосфорную кислоту и 1 минуту - профильтрованную воду для ВЭЖХ. Площадь под каждым пиком интегрируют, определяют площадь пика и по стандартной кривой рассчитывают конечную концентрацию.
6.5. Анализ В.I. продуктов
Количество соединения Ia, присутствующего в различных продажных продуктах, определяют капиллярным электрофорезом, описанным в разделе 6.4. (см. выше). ВАКТОСПЕЙНТМ, ДЖАВЕЛИНТМ, НОВОДОРТМ, СФЕРИМОСТМ, ВАКТИМОСТМ, ФОРЕЙТМ, ФЛОРБАКТМ и БИОБИТТМ производится фирмой Ново Нордиск А/С. КСЕНТАРИТМ и ДИПЕЛЬТМ производятся фирмой Эббот Лабореториз. ЭГРИТМ производится фирмой Сиба-Гейги; МВЦТМ производится фирмой Микоген и КАТЛАССТМ производится фирмой Экоген.
Полученные результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что соединение Ia присутствует в переменных количествах в интервале от менее 0,001 г Ia/БМЕ до 0,71 г Ia/БМЕ.
6.6. Биоанализы с применением питания
Активность B.t.k. определяют биоанализом с введением искусственного питания и применением Spodoptera exigua третьей личиночной стадии, Helicoverpa zea во второй личиночной стадии, Spodoptera fougiperda в третьей личиночной стадии, Heliothis viresceus во второй личиночной стадии, Trichoplusia ni в третьей личиночной стадии, Beudoplusia includens в третьей личиночной стадии, Plutella xylostella в третьей личиночной стадии, Spodoptera littoralis в третьей личиночной стадии и Mamestra brassicae в третьей личиночной стадии.
Для определения уровня усиления при добавлении соединения Ia и B.t. продуктам и для выявления спектра насекомых, на которых оказывается воздействие, осуществляют биоанализы с кормлением насекомых. В опытах с высокими концентрациями соединения Ia (7,4-23,7 г 1a/БМЕ) против Spodoрtera exigua для усиления БИОБИТТМ ТК (ТК - текучий концентрат) применяют очищенное соединение Ia (70% активного компонента, 30% ацетатного противоиона). Остальные представленные в таблице 4 данные относятся к усилению препарата БИОБИТТМ ВЭСП (высокоэффективный смачиваемый порошок) соединением Ia (0,658% активного компонента, ФЛОРБАКТМ ВЭСП и соединение Ia испытаны против S.littoralis и M.brassical.
Отвешивают различные B. t. продукты и к ним добавляют соединение Ia в количестве 0,1 - 237 г/БМЕ. Объем устанавливают добавлением 0,1% ТвинТМ. Образцы обрабатывают 1 минуту ультразвуком и затем разбавляют до конечного объема. Чистые образцы (без соединения Ia) и ссылочные вещества готовят таким же способом. Ссылочные вещества включают B.t.k. HD-I-S-1980 (получен из NRRL), которому приписана эффективность в 16000 международных единиц (МЕ) на миллиграмм, и ДЖАВЕЛИНТМ WG, эффективность которого считается равной 53000 Spodoptera единиц (SU)/мг.
В нагреваемом котле на 20 л готовят стандартное искусственное питание, состоящее из воды, агара, сахара, казеина, ростков пшеницы, метилпарабена, сорбиновой кислоты, льняного масла, целлюлозы, солей и витаминов. В результате получают достаточно корма для испытания 10 - 12 образцов с семью различными концентрациями каждого испытуемого вещества. Последовательным разбавлением B. t. растворов получают аликвоты по 16 мл. Каждую аликвоту добавляют к 184 г плавленного корма. Затем смесь гомогенизируют и переносят в пластиковый планшет с 40 отдельными лунками. Для каждой партии корма готовят три контрольных планшета. После охлаждения и отверждения корма в каждую лунку помещают насекомое известного возраста (2 - 3 возрастная стадия) и планшеты покрывают перфорированным листом прозрачного милара. Планшеты размещают на стеллажах и инкубируют четыре дня при 28oC и относительной влажности 65%.
Через четыре дня оценивают смертность насекомых. Каждый планшет резко ударяют о поверхность стола и неподвижные личинки считают мертвыми. Подсчитывают процент смертности и полученные данные анализируют методом параллельных проб. Определяют значения ЛК50, ЛК90, наклон кривых регрессии, коэффициент вариации и эффективности. Каждый образец проверяют минимум 3 раза или до тех пор, пока три значения эффективности будут находиться в пределах 20% от подсчитанного среднего значения для каждого образца. Для подсчета повышения активности, связанного с каждой концентрацией соединения Ia, значение ЛК50 B.t./Ia образца корректируют с учетом количества в образце соединения Ia. Значения ЛК50 парных чистых образцов делят на скорректированные значения ЛК50 и получают кратность снижения ЛК50, связанное с соединением Ia.
В случае поражения Lobesia bothrana применяют следующую методику анализа. Пораженный Lobesia bothrana виноград винных сортов собирают на не подвергавшихся опрыскиванию плантациях и с винограда собирают личинки вредителя. Готовят последовательные разбавления соединения Ia (250 мкг/мл, 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл) в воде. В середину чашки Петри помещают одну личинку. Если замечают, что личинка начинает тонуть, ее переносят в чашку Петри со свежесобранными ягодами винограда. Личинки выдерживают 3 - 4 дня при 22oC.
Как видно из Таблицы 4, для всех видов наблюдается значительное снижение ЛК50.
Усиление действия различных продуктов на Spodoptera exigua при добавлении соединения Ia определяют применением вышеописанного биоанализа с кормлением насекомых. Количества добавленного соединения Ia/БМЕ продукта приведены в Таблице 5 (см. ниже). Смесь Ia/B.t. продукт вводят в корм на основе агара, включающий проростки пшеницы-казеин. Насекомым скармливают такой корм в течение четырех дней при 28oC. Смертность регистрирует и анализируют применением анализа с единицами вероятности. Значения ЛК50, ЛК90 и эффективности подсчитывают на основе равноценного продукта, не содержащего соединения Ia. Приведенные в Таблице 5 результаты показывают, что соединение Ia усиливает разнообразные B.t.k. и B.t.a. продукты, полученные из различных источников. B. t. штаммы, содержащиеся в этих продуктах, охарактеризованы в разделе 5.2 (см. выше).
6.7. Бионализы на листве
В бионализах на листве применяют Spodoptera exigua во второй личиночной стадии, листья брокколи и БИОБИТТМТК в смеси с соединением Ia. Соединение Ia применяют в отношении к препарату БИОБИТТМТК, равным 2 г Ia/БМЕ БИОБИТТМТК. Брокколи опрыскивают полученным составом с помощью гусеничного опрыскивателя в объеме носителя из расчета 20 галлонов (75,7 л) на акр. После высыхания на листьях опрыскиваемого состава листья срезают и заражают Spodoptera exigua во второй личиночной стадии. Полученные результаты приведены в Таблице 6 (см. ниже). Смертность в 100% наблюдается при дозировке 8,7 БМЕ/гектар БИОБИТТМ ТК + 1a, в то время как применение одного только БИОБИТТМТК уничтожает 92% личинок в дозировке 58,8 БМЕ/гектар и 8% в дозировке 17,6 БМЕ/гектар. Обработанные растения кроме того выдерживают восемь часов на прямом солнечном свету, после чего листья срезают и заражают личинками. После восьмичасового действия солнечного света БИОБИТТМ ТК без добавки в дозировке 58,8 БМЕ/гектар дает 27% смертности, в то время как БИОБИТТМ ТК + 1a дают 100% смертности в дозировке 8,7 БМЕ/гектар.
Анализ на листве, проведенной с личинками в ранней четвертой возрастной стадии, дает 75% смертности в случае применения только БИОБИТТМ ТК (ТК - текучий концентрат) в дозировке 52 БМЕ/гектар, а применение БИОБИТТМ + Ia дает 100% смертности в дозировке 13 БИЕ/гектар.
6.6.2. Полевые испытания
Полевые испытания на бобах нута (Spodoptera exigua) показали, что применение только БИОБИТТМ ТК в дозировке 70 БМЕ дает 51% уничтожения вредителя, в то время как применение 2 г Ia/БМЕ БИОБИТТМ ТК в дозировке 40 БМЕ/гектар дает 89% уничтожения (относительно контроля без обработки).
Полевые испытания на кукурузе сахарной (Spodoptera fougiperda) показали, что в дозировке 39,5 БМЕ/гектар 2 г Ia/БМЕ БИОБИТТМ ТК обеспечивают 84% уничтожения.
6.9. Степень устойчивости
Биоанализу подвергают колонии восприимчивых и устойчивых Plutella xylostella. Устойчивые насекомые представлены полевыми образцами, собранными во Флориде, у которых в результате интенсивного применения препарата ДЖАВЕЛИНТМ WG возникла устойчивость к B.t. Исследуют БИОБИТТМ ВЭСП добавкой соединения Ia применением биоанализа с погружением листа. Устойчивость к препаратам ДЖАВЕЛИНТМ и КСЕНТАРИТМ исследуют без добавления соединения Ia. Диски листа капусты диаметром шесть см погружают на 10 секунд в одну из восьми различных концентраций B.t. продуктов или B.t./Ia препаратов. Интервал концентраций 1 - 1000 ч/млн. Диски листьев оставляют на два часа сушиться на воздухе и затем переносят в пластиковые чашки Петри с личинками во второй возрастной стадии (0,2 - 0,4 мг). Двадцать пять насекомых/дозу/день применяют в дубле, что дает 50 насекомых/дозу. После выдерживания 72 часа при 27oC регистрируют смертность. Регрессию типа доза/смертность анализируют применением единиц вероятности. Степень устойчивости подсчитывают делением значений ЛК50 и ЛК90 для восприимчивых насекомых. Приведенные в Таблице 7 результаты показывают, что БИОБИТТМ ВЭСП усиливается 2 г Ia/БМЕ и 4 г Ia/БМЕ. Так при использовании 4 г Ia/БМЕ наблюдается 2-кратное снижение ЛК50 степени устойчивости и 10-кратное снижение ЛК90 степени устойчивости.
Описанное и заявленное здесь изобретение не следует ограничивать в объеме характерными его воплощениями, приведенными здесь, поскольку эти воплощения предназначены для иллюстрации нескольких аспектов изобретения. Предполагается, что объемом изобретения будут охватываться и любые эквивалентные варианты. В самом деле, разнообразные модификации изобретения помимо тех, которые были показаны и описаны здесь, будут очевидны специалисту из вышеприведенного описания. Предполагается, что такие модификации будут охватываться объемом прилагаемой формулы изобретения.
Разнообразные цитированные источники во всей их полноте вводятся здесь в качестве ссылок.
7. Депонирование микроорганизмов
Следующие штаммы Вacillus thuringiensis депонированы в соответствии с Будапештским соглашением в коллекции патентуемых культур сельскохозяйственной исследовательской службы (NRRL), Северный региональный исследовательский центр, 1815 Университи Стрит, Пеория, Иллинойс, 61604, США.
Штамм: EMCC0086; EMCC0087; регистрационный N: NRRL B-21147; NRRL B-21148; дата депонирования: октябрь 6, 1993; октябрь 6, 1993.
Условия депонирования штаммов гарантируют доступ к культурам в течение рассмотрения данной заявки любому лицу, которое по решению Комиссара по патентам и фирменным знакам будет обладать правом на это согласно 37 C.F.R. 1.14 и 35 U. S.C. 122. Депозит представляет собой по существу чистые культуры каждого штамма. Депозит доступен, как того требует иностранное патентное законодательство, в тех странах, где зарегистрированы копии данной заявки или ее продолжений. Однако, следует подчеркнуть, что доступность депозита не дает прав на лицензирование практики объекта изобретения в нарушение патентных прав, гарантируемых решениями правительства.
Изобретение относится к средствам защиты растений от насекомых-вредителей. Создан активатор пестицидной активности, полученный путем ферментации бактерий Bacillus thuringiensis с последующим выделением его из надосадочной ферментационной жидкости. Активатор имеет брутто-формулу C13H28N6O8, растворим в воде, стабилен при 100°С в течение около 30 мин, при воздействии ультрафиолетовых лучей по меньшей мере в течение около 10 ч и при рН около 2 в течение 3 дней. Активатор имеет 1Н ЯМР-сдвиги при 1,5, 3,22, 3,29, 3,35, 3,43, 3,58, 3,73, 3,98, 4,07, 4,15, 4,25, 4,35; на основе описанного активатора созданы пестицидные композиции. Полученный активатор усиливает активность родственного Bac. thuringiensis пестицида по меньшей мере в полтора раза, а активность дельта-эндотоксина Bac. thuringiensis - в 100-400 раз. 7 с. и 14 з.п.ф-лы, 7 табл., 5 ил.
Приоритет по пунктам:
05.11.92. по пп.1 и 2, 10 и 21;
14.12.92. по п. 9;
20.07.93. по пп.3 - 8, 11 - 20.
| US 3911110, 07.10.1975 | |||
| US 5250515, 02.05.1992. |
