ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПЕСТИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, ПЕСТИЦИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ КОНТРОЛИРОВАНИЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ Российский патент 2002 года по МПК A01N63/00 A01N63/02 C12P1/04 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/07 C12P1/04 C12R1/07 

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к новому веществу, обладающему пестицидной активностью, в особенности против насекомых вредителей отряда Coleoptera. Изобретение также относится к пестицидным композициям, содержащим указанное вещество, а также к способам применения пестицидных композиций для контроля вредителей.

Уровень техники
Bacillus thuringiensis - это подвижные палочкообразные грамположительные бактерии, которые широко распространены в природе, особенно в почве и других объектах, зараженных насекомыми. Во время споруляции Bacillus thuringiensis образует параспоральные кристаллические включения, которые обладают инсектицидной активностью при проглатывании личинками чувствительных насекомых отрядов Lepidoptera, Diptera и Coleoptera. Включения могут варьировать по размеру, количеству и составу. Они содержат один или несколько белков, названных δ -эндотоксинами, которые могут иметь мол. массу от 27 до 140 кДа. Инсектицидные δ -эндотоксины расщепляются под действием протеаз в кишечном тракте личинки с образованием меньших по размерам усеченных токсичных полипептидов, вызывающих повреждение кишечника и в конце концов гибель насекомого.

Кристаллические δ -эндотоксины Bacillus thuringiensis являются наиболее широко используемым биопестицидом. Известны различные штаммы Bacillus thuringiensis, применяемые в качестве продуцентов δ -эндотоксинов в лесоводстве, сельском хозяйстве и здравоохранении. Bacillus thuringiensis подвид kurstaki и Bacillus thuringiensis подвид аizawai продуцируют δ -эндотоксины, специфичные к Lepidoptera. Δ -эндотоксин, специфичный к Coleoptera, продуцируется Bacillus thuringiensis подвид tenebrionis. Кроме того, Bacillus thuringiensis подвид israelensis продуцирует δ -эндотоксины, специфичные к Diptera. Описаны и другие штаммы Bacillus thuringiensis, продуцирующие δ -эндотоксины, обладающие пестицидной активностью по отношению к нематодам, Acari, Hymenoptera, Phtiraptera, Platyhelmintes, Homoptera, Blattodea и Protozoa.

Bacillus thuringiensis продуцирует и другие водорастворимые вещества, обладающие пестицидной активностью. Например, термоустойчивый пестицидный аденин-нуклеотидный аналог, известный как β -экзотоксин или турингиензин, продуцируется некоторыми штаммами Bacillus thuringiensis (Sebesta et al., in H. D. Burges (ed.), Microbial Control of Pests and Plant Disesases, Academic Press, New York, 1980, pp.249-2814). β -экзотоксин имеет молекулярную массу, равную 789, и состоит из аденозина, глюкозы и аллариковой кислоты (Luthy et al. , in Kurstak (ed.), Microbial and Viral Pesticides, Marcel Dekker, New York, 1982, pp.35-72). Круг его хозяев включает, но не ограничивается указанным: Musca domestica, Mamestra configurata Walker, Tetranychus urticae, Drosophila melanogaster и Tetranychus cinnabarinus. β -экзотоксин может относиться к типу I или к типу II (Levinson et al., 1990, Journal Bacteriology 172:3172-3179). Установлено, что β -экзотоксин типа I продуцируется Bacillus thuringiensis, подвид thuringiensis, серотип 1; Bacillus thuringiensis, подвид tolworthi, серотип 9 и Bacillus thuringiensis подвид darmstadiensis серотип 10. Установлено, что β -экзотоксин типа II продуцируется Bacillus thuringiensis, подвид morrisoni, серотип 8ab, и является активным против Leptinotarsa decemlineata. Другие водорастворимые вещества, которые были выделены из Bacillus thuringiensis, включают альфа-экзотоксин, который токсичен по отношению к личинкам Musca domestica (Luthy, 1980, FEMS Microbiological Letters 8: 1-7); гамма-экзотоксины, представляющие собой различные ферменты, включающие лецитиназы, хитиназы и протеазы, токсические эффекты которых проявляются только в сочетании с β -экзотоксином или δ -эндотоксином (Forsberg et at., 41976, Bacillus thuringiensis: Its Effects on Environmental Quality, Национальный Исследовательский Совет Канады, NRC объединенный комитет по научным критериям оценки состояния окружающей среды, Подкомитет по пестицидам, родственным соединениям и биологическим феноменам); сигма-экзотоксин, который имеет структуру, подобную таковой β -экзотоксина, и тоже активен против Leptinotarsa decemlineata (Argauer et al., 1991, Journal of Entomological Science 26:206-213) иангидротурингиензин (Prystas et al., 1975, Coll. Czechosslovak Chem.Comm. 40:1775).

Stonard et al. (1994, в Natural and Engineering Pest Management Agents, Paul A. Mann, Robert M. Hollingworth, eds., American Chemical Society, Washington, D.C., pp.25-36) показали, что Диабротицины имеют следующую структуру:

где 1. R, R₁, R₂=H, R₃=OH Диабротицин А
2. R, R₁, R₂, R₃=H Диабротицин В
Диабротицины были выделены из Bacillus subtilis и обладают активностью против Diabrotica udecimpunctata, Leptinotarsa decemlineata, Anthomus grandis Boheman, личинок москитов, Staphylococcus aureus и Mircococcus lutea, но не активны против Европейского зернового сверлильщика, Escherichia coli, Bacillus subtilis и Pseudomonas aeruginosa. Активность по отношению к другим вредителям Stonard et al. не описывают. Диабротицин А был также выделен из ферментационного бульона Bacillus cereus.

Усилия специалистов направлены на обнаружение новых биопестицидов для замены химических пестицидов, которые оказывают неблагоприятное воздействие на окружающую среду, или неэффективны, поскольку у отдельных вредителей развивается устойчивость к пестицидам.

Изобретение относится к новому веществу, обладающему пестицидной активностью против насекомых вредителей рода Coleoptera.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к новому веществу, полученному из супернатанта культуральной среды штамма Bacillus и обладающему пестицидной активностью против насекомых-вредителей отряда Coleoptera. Вещество имеет ¹Н ЯМР-сдвиги приблизительно в следующих точках δ -5,17 (d, 1Н), 4,48 (d, 1Н), 4,1 (m, 1H), 4,0 (dd, 1Н), 3,92 (d, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H), 2,8 (m, 1H), 1,27 (d, 3Н) и 1,19 (m, 3-4H); 12 атомов углерода и поглощает в дальней области УФ-спектра. Заявленное в настоящем изобретении вещество может также действовать, например, как усилитель или синергист, вместе с различными пестицидами, полученными на основе бактерий рода Bacillus, активными против вредителей.

Настоящее изобретение относится также к мутанту штамма Bacillus, при том, что количество вещества, продуцируемое мутантом, значительно больше, чем количество вещества, продуцируемое соответствующим родительским штаммом. В объем настоящего изобретения также включены способы получения такого мутанта, включающие: а) обработку штамма Bacillus мутагеном; б) выращивание обработанного, как указано на стадии а), штамма Bacillus в среде, подходящей для селекции мутанта; и в) селекцию мутанта, полученного на стадии б), на основе повышенной продукции вещества.

Настоящее изобретение относится также к способу получения "по существу очищенного" вещества, включающему: а) культивирование штамма Bacillus в соответствующих условиях; б) отбор супернатанта культуры штамма Bacillus, полученной на стадии а), и в) выделение вещества из супернатанта, полученного на стадии б), с получением по существу очищенного вещества, состоящего из вещества и пестицидного носителя, так же, как из вещества и пестицида, полученного на основе бактерий рода Bacillus, химического пестицида и/или энтомопатогенного вируса, а также к способам применения пестицидных композиций для контроля вредителей.

Перечень фигур чертежей
На фиг.1 показан ¹Н ЯМР - спектр заявленного вещества.

На фиг.2 показан ¹³С ЯМР - спектр заявленного вещества.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к веществу, обладающему пестицидной активностью, в частности, против насекомых-вредителей отряда Coleoptera. Используемое здесь понятие "пестицидная активность" соответствует степени активности в отношении вредителей, которая достаточна для уничтожения или остановки роста вредителей или защиты растений от заражения вредителями. Согласно одному варианту осуществления изобретения, заявленное вещество имеет молекулярную массу в пределах от 250 до 500; имеет ¹Н ЯМР-сдвиги приблизительно в следующих точках δ -5,17 (d, 1H), 4,48 (d, 1H), 4,1 (m, 1H), 4,0 (dd, 1H), 3,92 (d, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1Н), 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H), 2,8 (m, 1H), 1,27 (d, 3Н) и 1,19 (m, 3-4H); содержит 12 атомов углерода с ¹³С- сдвигами приблизительно в следующих точках δ -97,8, 92,5, 71,1, 68,1, 67,8, 63,6, 57,8, 54,7, 52,9, 52,7, 52,3 и 19,7 и поглощает в дальнем УФ. Согласно другому варианту осуществления изобретения, заявленное вещество является водорастворимым.

Пестицидная активность вещества против насекомых-вредителей может быть определена способами, хорошо известными из уровня техники, такими, как включение в искусственные питательные среды для насекомых, окраска листьев, погружение листьев и опыление листьев.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, заявленное вещество обладает пестицидной активностью против насекомых-вредителей отряда Coleoptera. Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленное вещество обладает пестицидной активностью против насекомых-вредителей рода Diabrotica отряда Coleoptera. Согласно еще более предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленное вещество обладает пестицидной активностью против Diabrotica undecimpunctata отряда Coleoptera.

Заявленное в настоящем изобретении вещество может быть выделено из супернатанта культуральной среды Bacillus. Согласно одному варианту осуществления изобретения, заявленное вещество может быть выделено из супернатанта культуральной среды штамма Bacillus thuringiensis. Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения, заявленное вещество получают из супернатанта культуральной среды Bacillus thuringiensis штамма ЕМСС-0080, имеющего идентификационные признаки NRRLB-21093, или же мутантов этого штамма, имеющих по существу те же самые свойства, что и ЕМСС-0080, и описанных в Заявках N 08/212462 и 08/404016, приведенных здесь в качестве ссылок.

Изобретение относится также к мутантному штамму Bacillus, такому, что количество вещества, продуцируемого мутантным штаммом, больше, чем количество вещества, продуцируемого исходным родительским штаммом. Настоящее изобретение относится также к способам получения такого мутантного штамма. Понятие "родительский штамм" относится к исходному штамму Bacillus, который подвергают мутагенезу с получением заданного мутантного штамма.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, заявленное вещество получают из мутантного штамма Bacillus, в частности штамма Bacillus thuringiensis, при том, что вещество продуцируется в большем количестве по сравнению с соответствующим родительским штаммом. Для получения таких мутантов исходный штамм может быть обработан мутагеном химической природы, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или этилметансульфонат, а также гамма-излучением, рентгеновским излучением и/или УФ-излучением. В частности, один из способов мутагенеза штаммов Bacillus thuringiensis и отбора мутантов, включает следующие стадии:
1) обработку исходного штамма мутагеном,
2) культивирование предполагаемых мутантов в подходящей культуральной среде для отбора мутантного штамма и
3) отбор мутантного штамма на основе повышенной продукции заявленного вещества.

В частности, согласно предпочтительному варианту осуществления данного способа, отобранные колонии подращивают в обычной среде, а затем проводят окончательную селекцию мутантов.

Bacillus thuringiensis можно культивировать с использованием сред и методов ферментации, известных из уровня техники (см., например, Rogoff et аl., 1969, Journal Invertebrate Pathology 14:122-129; Dulmage et al., 1971, Journal Invertebrate Pathology 18:353-358; Dulmage et al., в кн. Microbial Control of Pests and Plant Diseases, H.D.Burges, ed., Academic Press, N.Y., 1980). По завершении ферментационного цикла можно получить супернатант, отделяя споры и кристаллы Bacillus thutingiensis от ферментационного бульона хорошо известными методами, например центрифугированием и/или ультрафильтрацией. Содержащийся в супернатанте фактор может быть выделен хорошо известными из уровня техники методами, например ультрафильтрацией, выпариванием и высушиванием с распылением.

Настоящее изобретение относится также к способу получения "по существу очищенного" вещества, заявленного в настоящем изобретении. "По существу очищенное" вещество определяют как вещество, которое содержит менее 5% примесей, например, белка δ -эндотоксина. Очистка заявленного вещества может быть осуществлена различными методами, известными из уровня техники, включающими (но не ограничивающимися перечисленными) хроматографию (например, ионообменную хроматографию, аффинную и колоночную хроматографию - исключения по размеру), электрофоретические методы, дифференциальное растворение, экстракция и любые другие стандартные методы, известные из уровня техники (см., например, Protein Purification, eds., J.-C.Janson and Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989). В частности, один из способов получения по существу очищенного вещества, заявленного в настоящем изобретении, включает следующие стадии:
а) культивирование штамма Bacillus в соответствующих условиях;
б) отбор супернатанта культуры штамма Bacillus;
в) выделение вещества из супернатанта с получением по существу очищенного вещества.

Настоящее изобретение относится также к пестицидным композициям, включающим заявленное вещество в количестве, эффективном для контроля вредителей, а также пестицидный носитель. Используемое здесь понятие "эффективное количество" соответствует такому количеству вещества, которое достаточно для уничтожения или остановки роста вредителей или защиты растений от заражения вредителями. Пестицидные композиции могут включать заявленное вещество в по существу очищенной форме или в виде супернатанта, полученного при выращивании штамма Bacillus, в сухой, концентрированной или жидкой форме и приемлемый пестицидный носитель, примеры которого приведены в настоящем описании. Вещество содержится в композиции в концентрации от 0,001 до 60% (по весу).

Заявленные в настоящем изобретении пестицидные композиции могут также включать депозиционный агент, который облегчает удерживание композиции на определенном целевом участке во время применения (например, при распылении с самолета) или предотвращает сдувание композиции с растения после ее нанесения на растение. Депозиционным агентом, входящим в состав заявленных композиций, предпочтительно является материал, который имеет дополнительное преимущество, заключающееся в том, что съедобен для насекомых. Любой белок растительного или животного происхождения в сухом или жидком виде подходит для указанной цели. Примеры белков, которые удобны и экономичны при добавлении к композициям, включают (но не ограничиваются перечисленными) соевый белок, картофельный белок, соевую муку, картофельную муку, рыбную муку, костную муку, дрожжевой экстракт и высушенную кровь. К альтернативным депозиционным агентам относятся модифицированная целлюлоза (карбоксиметилцеллюлоза), растительные материалы (зерновые порошки, размолотые части растений), не-филлосилиты (тальк, вермикулит, диатомовая земля), натуральные глины (аттапульгит, бентонит, каолинит, монтмориллонит) и синтетические глины (Лапонит). При использовании депозиционный агент содержится в пестицидных композициях, заявленных в настоящем изобретении, в количестве от 0,4 до 50% (по весу), предпочтительно от 1 до 20% (по весу).

Заявленные в настоящем изобретении пестицидные композиции могут также включать антифриз/увлажнитель, которые понижают точку замерзания продукта и способствуют уменьшению испарения при распылении, а также поддерживают консистенцию продукта, увеличивая его эффективность и съедобность. Примерами атифризов/увлажнителей могут служить (не ограничиваясь перечисленными) этиленгликоль, пропиленгликоль, дипропиленгликоль, глицерин, бутиленовые гликоли, пентиленовые гликоли и гексиленовые гликоли. Антифризы/увлажнители добавляют в заявленные пестицидные композиции в количестве от 0,5 до 25% (по весу), предпочтительно от 2 до 15% (по весу).

Заявленные в настоящем изобретении пестицидные композиции могут также включать поверхностно-активные вещества в таких количествах, в которых они действуют как эмульгаторы, увлажняющие или диспергирующие агенты. Примерами подобных поверхностно-активных веществ являются анионоактивные соединения, такие как карбоксилаты, например, металлокарбоксилаты длинноцепочечной жирной кислоты; N-ацилсаркозинат; моно или диэфиры фосфорной кислоты с этоксилатами спиртов жирного ряда или соли этих эфиров; сульфаты спиртов жирного ряда, такие как додецилсульфат натрия, октадецилсульфат натрия или цетилсульфат натрия; этоксилированные сульфаты спиртов жирного ряда; этоксилированные алкилфенольные сульфаты; сульфаты лигнина; нефтяные сульфонаты; алкиларилсульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, или низшие алкилнафталинсульфонаты, например, бутилнафталинсульфонат; соли сульфонированных нафталинформальдегидовых конденсатов; соли сульфонированных фенолформальдегидовых конденсатов или более сложные сульфонаты, такие как амидные сульфонаты, например, сульфонированный продукт конденсации олеиновой кислоты и N-метилтаурина или диалкилсульфосукцинаты, например, сульфонат натрия или диоктилсукцинат. Неионные реагенты включают продукты конденсации эфиров жирных кислот, спиртов жирного ряда, амидов жирных кислот или алкил- или алкинил-замещенных фенолов с этиленоксидом, эфиры жирных кислот многоатомных спиртов, например, сорбитановые эфиры жирной кислоты; продукты конденсации указанных эфиров с этиленоксидом, например, полиоксиэтиленовый сорбитар эфира жирной кислоты, блоксополимеры этиленоксида и пропиленоксида, гликоли ацетиленового ряда, такие как 2,4,7,9-тетраэтил-5-децин-4, 7-диол, или этоксилированные гликоли ацетиленового ряда. Примеры катионных поверхностно-активных веществ включают, например, алифатические моно-, ди- или полиамины, скажем, ацетаты, нафтенаты или олеаты; кислородсодержащие амины, например, аминоксид полиоксиэтилен-алкиламина; содержащие амидные связи амины, полученные конденсацией карбоновой кислоты с ди- или полиамином, или четвертичную аммониевую соль. Поверхностно-активные вещества добавляют в количестве от 0,5 до 25% (по весу), предпочтительно от 1 до 8% (по весу).

Заявленные в настоящем изобретении пестицидные композиции могут также включать инертные материалы. Примерами инертных материалов являются неорганические, минеральные материалы, такие, как диатомовая земля, каолин, слюда, гипс, удобрение, филлосиликаты, карбонаты, сульфаты или фосфаты; органические вещества, такие как сахара, крахмал, циклодекстрины; или "ботанические материалы", такие как продукты переработки древесины, пробка, кукурузные кочерыжки, истертые в порошок, рисовая шелуха, скорлупа орехов арахиса и грецких орехов.

Описанные выше композиции могут также содержать консервант, стимулятор поедания, аттрактант, инкапсулирующий агент, связывающий агент, эмульгатор, краситель, УФ-протектор, буфер, агент, придающий текучесть, или другой компонент, облегчающий манипуляции с композицией и ее применение по отношению к определенным вредителям.

Заявленные в настоящем изобретении композиции могут содержать пестицид, полученный на основе бактерий рода Bacillus, в частности биопестицид Bacillus thuringiensis. Биопестицид Bacillus thuringiensis может быть получен при использовании (не ограничиваясь перечисленными подвидами) Bacillus thuringiensis подвид aizawai, Bacillus thuringiensis подвид alesti, Bacillus thuringiensis подвид canadiensis, Bacillus thuringiensis подвид colmeri, Bacillus thuringiensis подвид coreanensis, Bacillus thuringiensis подвид dakota, Bacillus thuringiensis подвид darmstadiensis, Bacillus thuringiensis подвид dendrolimus, Bacillus thuringiensis подвид entomocidus, Bacillus thuringiensis подвид finitimus, Bacillus thuringiensis подвид galleriae, Bacillus thuringiensis подвид indiana, Bacillus thuringiensis подвид israelensis, Bacillus thuringiensis подвид kenyae, Bacillus thuringiensis подвид kumamotoensis, Bacillus thuringiensis подвид kurstaki, Bacillus thuringiensis подвид kyushuensis, Bacillus thuringiensis подвид japonensis, Bacillus thuringiensis подвид mexcanensis, Bacillus thuringiensis подвид morrisoni, Bacillus thuringiensis подвид neoleonensis, Bacillus thuringiensis подвид nigeriae, Bacillus thuringiensis подвид ostriniae, Bacillus thuringiensis подвид pakistani, Bacillus thuringiensis подвид pondicheriensis, Bacillus thuringiensis подвид shandongiensis, Bacillus thuringiensis подвид silo, Bacillus thuringiensis подвид sotto, Bacillus thuringiensis подвид subtoxicus, Bacillus thuringiensis подвид tenebrionis, Bacillus thuringiensis подвид thompsoni, Bacillus thuringiensis подвид tochigiensis, Bacillus thuringiensis подвид tohokuensis, Bacillus thuringiensis подвид totworthi, Bacillus thuringiensis подвид toumanoffi, Bacillus thuringiensis подвид wuhanensis, Bacillus thuringiensis подвид yunnanensis. В зависимости от рекомендованной дозы для конечного продукта на основе биопестицида Bacillus thuringiensis, заявленное в настоящем изобретении вещество может быть смешано с биопестицидом Bacillus thuringiensis при подготовке концентрата или при подготовке конечного продукта.

Биопестицид Bacillus thuringiensis, т.е. белковый δ -эндотоксин или его пестицидно-активный фрагмент, может быть выбран из группы, включающей (но не ограничивающейся перечисленными) CryI, CryII, CryIII, CryIV, CryV и CryVI. В частности, белковый δ -эндотоксин Bacillus thuringiensis или его пестицидно-активный фрагмент, может быть выбран из группы, включающей (но не ограничивающейся перечисленными) CryIA(a), CryIA(b), CryIA(c), CryIB, CryIC, CryID, CryIE, CryIF, CryIIA, CryIIB, СrуIIIА4, CryIIIB, CryIIIC, CryIVA4, CryIVB, CryIVC, CryIVD, CryV, CryVI и CytA. Биопестицид Bacillus thuringiensis, представленный спорами штамма Bacillus thuringiensis, также включен в объем настоящего изобретения.

Биопестицид Bacillus thuringiensis, входящий в состав заявленных в настоящем изобретении пестицидных композиций, альтернативно может быть получен из клетки, в которую был введен ген, кодирующий белок β -эндотоксина Bacillus thuringiensis или его пестицидно-активный фрагмент. Далее, согласно настоящему изобретению, биопестицид Bacillus thuringiensis или его пестицидно-активный фрагмент может быть получен трансконъюгацией штамма, когда плазмида, содержащая ген, кодирующий белок β -эндотоксина Bacillus thuringiensis или его пестицидно-активный фрагмент, передается при межклеточной конъюгации.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут содержать заявленное в настоящем изобретении вещество в количестве от 0,001 до 100 грамм на грамм биопестицида Bacillus thuringiensis.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут также содержать одно или более синергично действующих веществ, усилитель или стимулятор поедания, известные из уровня техники. Например, усилитель, описанный в заявке WO 94/09630, или его пестицидно-активная соль могут быть использованы в заявленных композициях.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут также содержать энтомопатогенный вирус. Примерами таких энтомопатогенных вирусов являются (но не ограничиваются перечисленными) вирус ядерного полиэдроза (NPV) Autographacalifornica, Syngrapha falcifera NPV, Cydia pomonella GV (вирус гранулеза), Heliotis zea NPV, Lymantria dispar NPV, Orgyia pseudotsugata NPV, Spodoptera exigua NPV, Neodiprion lecontei NPV, Neodiprion sertifer NPV Harrisina brillians NPV и Endopiza viteana Clemens NPV.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут содержать химический пестицид. Примерами таких химических пестицидов являются (но не ограничиваются перечисленными) регуляторы роста насекомых, карбаматы, органофосфаты, пиретроиды, неорганические фториды, пиразолы, пирролы и авермектины.

В объем настоящего изобретения также включен способ контроля заражения растений вредителями, включающий нанесение на растения заявленных пестицидных композиций.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут использоваться в сухой или жидкой форме, которая, например, может представлять собой суспензию, раствор, эмульсию, порошок, диспергируемые гранулы, смачиваемый порошок, эмульгируемый концентрат, аэрозоль или импрегнированные гранулы, или концентрат или первичную композицию, которую перед применением необходимо развести соответствующим количеством воды или другого растворителя. Концентрации каждого компонента в композиции могут варьировать в зависимости от природы конкретной композиции, в частности, от того, является ли она концентратом, или же может использоваться непосредственным образом. Композиция может содержать от 1 до 98% твердого или жидкого инертного носителя. Композиции должны применяться в определенных дозах, указанных для каждого коммерческого продукта, предпочтительно от 1,510 г до 0,724 кг на га при использовании в сухом виде и от 1,902 мл до 4,755 л на га при использовании в жидком виде.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут быть нанесены непосредственно на растения, например, путем опрыскивания или распыления, когда насекомые вредители только начинают появляться на растениях, или же до появления вредителей в качестве защитной меры. Пестицидные композиции можно нанести на листья, пахотную борозду, рассеять в виде гранул, нанести на почву или пропитать ими почву. Композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут быть непосредственно использованы и для обработки водоемов, озер, рек, ручьев, стоячей воды и других объектов, подвергающихся заражению вредителями, особенно когда это имеет отношение к здоровью человека. Композиции можно применять разбрызгиванием, распылением, путем полива и т.п. Разбрызгиваемая жидкость или распыляемый порошок могут включать и другой пестицид, если это необходимо. Заявленные в настоящем изобретении композиции предпочтительно наносить непосредственно на растения.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут использоваться для защиты многочисленных видов растений, включая (но не ограничиваясь перечисленными): злаковые (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, сорго и другие злаки); свекловичные (сахарная свекла и кормовая свекла); косточковые, плодовые и культуры с мягкими плодами (яблони, груши, сливы, персики, миндаль, вишня, клубника, малина, ежевика); бобовые (люцерна, бобы, чечевица, горох, соя); масличные (рапс, горчица, мак, оливы, подсолнечник, кокосовые пальмы, растения, дающие касторовое масло, деревья какао, земляной орех); огуречные (огурец, кабачки, дыни); волокнистые растения (хлопчатник, лен, конопля, джут); цитрусовые (апельсины, грейпфруты, мандарины); овощные культуры (шпинат, салат, спаржа, капуста и др. крестоцветные, морковь, лук, томаты, картофель); лавровые деревья (авокадо, коричное дерево, камфорное дерево); лиственные и хвойные деревья (липа, тис, дуб, ольха, тополь, береза, ель, лиственница, сосна) и такие растения, как маис, торфяные растения, табак, орех, кофейное дерево, сахарный тростник, чайный куст, виноградная лоза, хмель, банановое дерево, каучуковые деревья, а также декоративные растения.

Настоящее изобретение относится также к способу применения заявленного вещества по отношению к трансгенному растению, которое содержит ген, кодирующий биопестицид Bacillus thuringiensis.

Пестицидные композиции, полученные согласно настоящему изобретению, могут быть эффективны для уничтожения и предотвращения заражения многочисленными видами насекомых. В частности, предпочтительным является применение заявленных в настоящем изобретении композиций для уничтожения вредителей отряда Coleoptera, например, Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chunensis, Epilachna varivensis, Pyrrhalta luteole, Cylasformicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephalaborealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogusmajalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum Tribolium destructor. Однако, пестицидные композиции, заявленные в настоящем изобретении, могут быть также эффективны против насекомых-вредителей отряда Lepidoptera, например, Achroia grisella, Acleris gloverana, Aclerisvariana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bobmyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp. , Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydiapomonella, Datana integgerima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphanianitidalis, Diatraeagrandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erranistiliaria, Estigmeneacrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Heticoverpa zea, Heliothis verescens, Hemuleuca olivae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Kleiferialycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Labdinafiscellarialugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrsisalis, Malacosomasp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacritavernata, Papiliocresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynotasultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia inctudens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp. , Thaurnstopoea pityocarma, Tineola bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curtails, Yponomeuta padella; отряда Diptera, например, Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles barberi, Anopheles quadrimaculatus, Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia mecallaria, Culex sp., Culiseta inornata, Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollae, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina morsitans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpatis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogusequinus, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypodermalineatum, Leucopis ninae, Luciliacuprina, Luciliasericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobelliera sp., Nephrotoma suturalis, Ophyra aenescens, Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxophynchites amboinensis, Tripteroides bambusa; отряда Acari, например, Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Tetranychus urticae; отряда Hymenoptera, например, Iridomyrmex humilis, Solepsis invicta; отряда Isoptera, например, Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosamus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; отряда Siphonaptera, например, Ceratophyllus gallinae, Ceratophyllus niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides fetis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; и отряда Tyienchida, например, Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.

Следующие примеры поясняют, но не ограничивают данное изобретение.

Примеры
Пример 1: Культивирование Bacillus thuringiensis EMCC-0080
Bacillus thuringiensis штамм EMCC-0080 выращивают при 30^oС в течение 24 часов в среде следующего состава:
Гидролизованный крахмал - 40 г/л
Гидролизованный растительный белок - 40 г/л
КН₂РO₄ - 1,8 г/л
К₂НРО₄ - 4,5 г/л
МgSO₄-7Н₂O - 0,3 г/л
Следовые металлы - 0,2 мл
рН среды - До 7,0
Клетки и другие нерастворимые компоненты удаляют из культуральной среды Bacillus thuringiensis штамма ЕМСС-0080 центрифугированием, а затем полученный супернатант фильтруют через Целит и фильтр с размером пор 0,2 мкм. Полученный пермеат концентрируют в 10 раз выпариванием.

Пример 2: Биологическое исследование с использованием Diabrotica undecimpunctata.

Образцы объемом 20 мкл вносят в индивидуальные лунки 96-луночного планшета, содержащие по 200 мкл твердой питательной среды для насекомых, и высушивают на воздухе. По одному новорожденному насекомому Diabrotica undecimpunctata осторожно помещают в каждую лунку при помощи маленькой кисточки. Затем планшет закрывают полиэфирной пленкой Mylar с отверстиями для воздухообмена и инкубируют при 30^oС и 80%-ной влажности. Определение процента смертности проводят на 5 6-й день.

Пример 3: Очистка пестицидного вещества
Очистку пестицидного вещества из концентрированного в 10 раз пермеата, полученного согласно Примеру 1, проводят в три стадии. В ходе очистки активность вещества контролируют с помощью биологического исследования при использовании Diabrotica undecimpunctata, как описано в Примере 2. Все стадии хроматографии контролируют по поглощению при длине волны 278 нм, если не указано иное.

На первой стадии концентрированный в 10 раз пермеат очищают колоночной хроматографией на катионообменной Sepharose Fast Flow (Parmacia SP). Колонку промывают 1350 мл деионизованной воды, а затем 1350 мл 20 мМ ацетат-аммонийного буфера, рН 5,0. Затем колонку промывают 100 мл 1 М ацетат-аммонийного буфера с рН 5,0 и перед нанесением образца переуравновешивают 20 мМ ацетат-аммонийным буфером, рН 5,0. Образец сконцентрированного в 10 раз пермеата объемом 425 мл разводят деионизованной водой до объема 18 л с получением значения проводимости 2,01 мОм и рН 4,8. Разведенный образец наносят со скоростью 17 мл/мин на колонку, уравновешенную 20 мМ ацетат-аммонийным буфером с рН 5,0. После нанесения образца колонку промывают 3 л 20 мМ ацетат-аммонийного буфера, рН 5,0. Элюцию проводят со скоростью 18 мл/мин 5 л непрерывного градиента ацетат-аммонийного буфера от 20 мМ до 1 М, рН 5,0. Фракции собирают каждую минуту и каждую пятую фракцию подвергают биологическому исследованию при использовании Diabrotica undecimpunctata, как описано выше. Активность, обнаруживаемая с помощью биологического исследования, ассоциировалась с фракциями 25-95. Активные фракции объединяют, лиофилизируют и растворяют в 50 мл деионизованной воды.

На второй стадии 50 мл объединенного раствора наносят на колонку BioRad P2 (ультратонкая) (5 х 100 см) для осуществления хроматографии с исключением по размеру, преуравновешенную деионизованной водой. Элюцию проводят деионизованной водой со скоростью 1 мл/мин. Фракции собирают каждые 10 минут и каждую пятую фракцию подвергают биологическому исследованию, как описано выше. Активность обнаруживают во фракциях 94-120, которые объединяют.

На третьей стадии 6-мл образец объединенных активных фракций, полученный на второй стадии, разводят деионизованной водой до объема 10 мл и значения проводимости 223 мОм. Разведенный образец наносят на колонку HPLC TSK SP-5PW (15 см х 21,5 мм ID) и затем элюируют со скоростью 4 мл/мин 120 мл непрерывного градиента ацетат-аммонийного буфера от 225 мМ до 400 мМ, рН 5,0. Контролируют поглощение элюата при 310 нм, каждые 1,5 минуты собирают фракции и каждую пятую фракцию подвергают биологическому исследованию, как описано выше. Приблизительно на 15-й минуте элюируется большой пик, за которым следует малый. Оба пика содержат активное вещество, что определяют биологическим исследованием.

Пример 4: Характеристика пестицидного вещества.

В данном примере приведены свойства активного вещества, полученного, как описано в Примере 3. Спектроскопические данные ¹Н и ¹³С-ЯМР были получены для очищенного вещества с помощью 400 МГц-спектрометра Varian Gemini. ¹Н ЯМР-спектр (D₂O, 400 МГц) очищенного вещества приведен на фиг.1 и ¹Н ЯМР-сдвиги расположены приблизительно в следующих точках: δ 5,17 (d, 1H), 4,48 (d, 1H), 4,1 (m, 1H), 4,0 (dd, 1H), 3,92 (d, 1H), 3,85 (m, 2H), 3,80 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H), 2,8 (m, 1H), 1,27 (d, 3Н) и 1,19 (m, 3-4H). ¹³С- ЯМР-спектр (D₂O, 100 МГц) очищенного вещества приведен на фиг. 2 и ¹³С ЯМР-сдвиги расположены приблизительно в следующих точках: δ 97,8, 92,5, 71,1, 68,1, 67,8, 63,6, 57,8, 54,7, 52,9, 52,7, 52,3 и 19,7.

Очищенное вещество было также охарактеризовано по поглощению в ультрафиолете с помощью спектрометра Hewlett-Packard Diode и показано, что оно обладает поглощением только в дальней области УФ-спектра.

Вещество растворимо в метаноле так же, как и в воде. Кроме того, вещество реагирует положительно как с нингидрином, так и с реактивами Драггендорфа.

На основе данных ЯМР была определена молекулярная масса очищенного вещества, которая находится в пределах от 250 до 500.

Пример 5: Определение LC₅₀ и LC₉₀ пестицидного вещества
Очищенное вещество после стадии очистки HPLC TSK SP-5PW, как описано в Примере 3, лиофилизируют и растворяют в деионизованной воде до концентрации приблизительно 3 мг/мл. Затем проводят биологическое исследование с использованием Diabrotica undecimpunctata для определения LC₅₀ и LC₉₀.

Готовят искусственную питательную среду для насекомых, состоящую из воды, агара, сахара, казеина, проростков пшеницы, метил-парабена, сорбитовой кислоты, льняного масла, целлюлозы, солей, пропионовой кислоты, фосфорной кислоты, стрептомицина, хлортетрациклина и витаминов. Искусственная питательная среда обеспечивает включение до 20% (по объему) тестируемых образцов, представленных регидрированными порошками или жидкостями. Тестируемые образцы готовят в микроцентрифужных пробирках для получения от 8 до 16 последовательных разведений. Жидкие образцы сначала тестируют в концентрации 200 мкл/мл, а затем последовательно разводят 0,1% TWEEN^ТМ 20 до концентрации 100 мкл/мл, 50 мкл/мл, 25 мкл/мл, 12,5 мкл/мл, 6,25 мкл/мл, 3,125 мкл/мл, 1,563 мкл/мл и т. д. Каждый образец смешивают с расплавленной питательной средой до объема 1 мл. Расплавленную смесь перемешивают на встряхивателе Вортекс и разливают по 0,1 мл в 10 ячеек 96-луночного планшета. Контрольные образцы, содержащие 0,1% TWEE^ТМ 20, помещают в 16 лунок. После затвердевания питательной среды в каждую лунку вносят две новорожденные личинки Diabrotica undecimpunctata и планшет закрывают перфорированным листом пленки Mylar. Планшет инкубируют 5 дней при 28±2^oС и относительной влажности 65%. Биологическое исследование проводят трижды.

Смертность учитывают на 5-й день. Пленку Mylar удаляют и каждую лунку обследуют под бинокулярной лупой. Личинку, которая не движется при уколе препаровальной иглой, считают мертвой. Вычисляют процент смертности и проводят вероятностный анализ данных. Определяют LC₅₀, LC₉₀, наклон кривой регрессии и отклонение.

Показано, что вещество имеет LC₅₀ 20 мкл/мл, LC₉₀ 172,2 мкл/мл, наклон кривой регрессии 1,5 и коэффициент отклонения 18,8.

Депонирование микроорганизма
Следующий штамм Bacillus thuringiensis был депонирован, согласно Будапештскому договору в Культуральной Коллекции Сельскохозяйственной Патентной Службы (NRRL), 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA.

Штамм EMCC-0080.

Номер NRRL-21093.

Дата депонирования 10 мая 1993.

Штамм был депонирован на условиях, обеспечивающих доступ к нему в течение периода, предшествующего выдаче патента какому-либо лицу, определенному Комиссаром по патентам и товарным знакам, согласно 37 статье C.F.R., параграф 1,14 и 35 статье U.S.С., параграф 122. Депозит представляет собой по существу очищенную культуру депонированного штамма. Депозит (или его производные) доступны в соответствии с требованиями патентных законов тех стран, в которые подается заявка. Однако, следует понимать, что доступность депонированной культуры не дает права воспроизводить объект изобретения в нарушение прав, обеспечиваемых патентом, выданным от лица государства.

Описанное и заявленное изобретение не должно ограничиваться частными вариантами его осуществления, приведенными здесь, поскольку примеры приводятся только в целях иллюстрации некоторых аспектов данного изобретения. Предполагается, что любые равнозначные варианты воплощения изобретения входят в его объем. Действительно, различные модификации изобретения, дополняющие те, которые раскрыты в настоящем описании, очевидным образом следуют из него и понятны специалисту в данной области исследований. Такие модификации также охватываются заявленными пунктами формулы.

Цитируемые в настоящем описании источники информации приведены исключительно в качестве ссылок.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новому веществу, способу его получения, пестицидной композиции и способу контролирования вредителей. Предложенное вещество получено путем культивирования штамма Bacillus thuringiensis ЕМСС-0080, депонированного в NRRL под регистрационным номером NRRL В-21093. Предложенное вещество обладает пестицидной активностью против насекомых вредителей отряда Coleoptera. Вещество действует как усилитель или синергист вместе с различными пестицидами, полученными на основе бактерий рода Bacillus. Используемая для обработки вредителей пестицидная композиция содержит предложенное вещество в количестве от 0,001 до 60 мас.%. 4 с. и 8 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Вещество, обладающее пестицидной активностью по отношению к вредителям, которое имеет следующие свойства: (а) обладает активностью против насекомых-вредителей отряда Coleoptera; (б) имеет ¹Н ЯМР-сдвиги приблизительно в следующих точках: δ 5,17 (d, 1H), 4,48 (d, 1H), 4,1(m, 1H), 4,0 (dd, 1H), 3,92 (d, 1H), 3,85 (m2H), 3,80 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,50 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,1 (dd, 1H), 2,8 (m, 1H), 1,27 (d, 3H) и 1,19 (m, 3-4H); (в) содержит 12 атомов углерода и (г) обладает поглощением в дальней области УФ-спектра. 2. Вещество по п. 1, отличающееся тем, что оно имеет молекулярную массу в пределах от 250 до 500. 3. Вещество по п. 1, отличающееся тем, что оно водорастворимо. 4. Вещество по п. 1, отличающееся тем, что оно содержит 12 атомов углерода с ¹³С ЯМР-сдвигами приблизительно в следующих точках: δ 97,8, 92,5, 71,1, 68,1, 67,8, 63,6, 57,8, 54,7, 52,9, 52,7, 52,3 и 19,7. 5. Вещество по п. 1, отличающееся тем, что оно получено культивированием в соответствующих условиях штамма Bacillus thuringiensis, идентифицируемого как ЕМСС-0080, депонированного в NRRL под регистрационным номером NRRL B-21093, отбором супернатанта полученной культуры вышеуказанного штамма Bacillus и выделением вещества из супернатанта. 6. Вещество по п. 1, отличающееся тем, что насекомое-вредитель относится к роду Diabrotica. 7. Вещество по п. 1, отличающееся тем, что насекомое-вредитель является Diabrotica undecimpunctata. 8. Способ получения по существу очищенного вещества, обладающего пестицидной активностью, по п. 1, заключающийся в том, что культивируют в соответствующих условиях штамм Bacillus thuringiensis, идентифицируемый как ЕМСС - 0080 и депонированный в NRRL под регистрационным номером NRRL B-21093, отбирают супернатант полученной культуры вышеуказанного штамма и выделяют вещество из супернатанта с получением по существу очищенного вещества. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что вещество выделяют из супернатанта хроматографией на колонке. 10. Пестицидная композиция, содержащая вещество по п. 1 в количестве, достаточном для эффективного контролирования вредителя, и пестицидный носитель. 11. Пестицидная композиция по п. 10, отличающаяся тем, что она содержит вещество в количестве от 0,001 до 60 мас. %. 12. Способ контролирования вредителей, включающий обработку вредителей пестицидно-эффективным количеством пестицидной композиции по п. 10.