Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai, проявляющий инсектицидную активность против вредителей - насекомых отряда Lepidoptera Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 A01N63/23 

Изобретение относится к штамму спорообразующих бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai, обладающему инсектицидным действием в отношении чешуекрылых насекомых-вредителей и может быть использовано в биотехнологии для получения микробиологических средств защиты сельскохозяйственных, лекарственных и лесных культур от вредных насекомых.

В связи с глобальным потеплением усугубляются проблемы с вредителями сельского и лесного хозяйства из-за роста популяций насекомых, увеличения частоты нашествий, свободы их перемещения на новые ареалы обитания. Глобальное потепление экспоненциально увеличивает скорость обмена веществ у насекомых, темпы их размножения. В итоге становится больше насекомых с хорошим аппетитом.

Химические инсектициды не обеспечивают полную защиту сельскохозяйственных культур. Вдобавок вредители начинают ускользать от химического контроля, вырабатывая устойчивость к указанным инсектицидам. Кроме того, химические пестициды накапливаясь в продуктах питания, окружающей среде оказывают негативное влияние на здоровье людей и животных.

Альтернатива химическим пестицидам - биологические инсектициды, которые избирательно действуют на вредителя, не фитотоксичны, безопасны для человека и домашних животных, в том числе, для пчел. Ассортимент биологических инсектицидов ограничен несколькими препаратами, которые не всегда справляются с новыми вызовами, возникающими из-за климатических изменений.

Против чешуекрылых насекомых в России зарегистрированы и выпускаются биологические инсектициды на основе бактерий Bacillus thuringiensis двух подвидов spp.thuringiensis и spp.kurstaki.

Известны штаммы Bacillus thuringiensis spp.thuringiensis 202, 98 и 620, применяемые как основа битоксибациллина, (Н.В. Кандыбин, Н.М. Барбашова, А.А. Стусь, Л.Н. Кузнецова. Сравнительная эффективность трех штаммов Bacillus thuringiensis ssp.thuringiensis / Бюл. ВНИИСХМ №53, Л., 1990, с. 44-46).

Известен также штамм Bacillus thuringiensis ssp.thuringiensis №800/15 (BtH₁ 800/15), обладающий энтомоцидной активностью против вредителей - насекомых-фитофагов. Депонирован в ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером №611 (патент РФ №2514211, МПК C12N 1/20, опубл. 27.04.2014 г.)

Известен штамм Bacillus thuringiensis spp.kurstaki Z-52 (авторское свидетельство СССР №769787, МПК A01N 63/00, опубл. 23.01.1984 г.), продуцирующий токсин, состоящий из двух белков, синтез которых кодируется генами cry1 и сгу2 (Мокеева А.В., Калмыкова Г.В., Бурцева Л.И., Орешкова С.Ф., Андреева И.С., Репин В.Е. Сравнительный анализ штаммов энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis молекулярно-генетическими методами / Биотехнология, 2006, №3, с. 47-55).

Известен штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp.kurstaki для получения препарата лепидоцида (Бердский завод биопрепаратов), активного против гусениц шелкопрядов, в том числе против сибирского шелкопряда, депонированный в коллекции ВКПМ №В-5351 (авторское свидетельство СССР №1784156, МПК A01N 63/00, опубл. 30.12.1992 г.).

Указанные выше штаммы бактерий способны образовывать два энтомоцидных токсина: белковый дельта-эндотоксин (δ-эндотоксин), высокоспецифичный против насекомых-вредителей, и водорастворимый бета-экзотоксин (β-экзотоксин). Хотя β-экзотоксин высоко активен против насекомых, он также оказывает вредное воздействие на организмы, не являющиеся мишенями, включая млекопитающих, поскольку он является аналогом нуклеотида, который влияет на синтез РНК. Из-за угрозы для здоровья человека, животных, пчел и окружающей среды Всемирная организация здравоохранения запретила использование штаммов Bacillus thuringiensis, продуцирующих этот токсин, в составах биоинсектицидов, подходящих для органического земледелия.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48 выделенный из смывов семян пшеницы в Новосибирской области в 2015 г. (Андреева И.В., Шаталова Е.И., Калмыкова Г.В., Акулова И.И., Ульянова Е.Г. Восприимчивость разных видов чешуекрылых насекомых к штамму Bacillus thuringiensis ssp. aizawai // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2019. Т. 49. №6. С. 44-52.). Колонии, выросшие на агаризованной среде «А» исследовали световой микроскопией для определения наличия параспоральных кристаллов. Таким образом был выделен штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48 с бипирамидальными кристаллами. В лабораторных условиях штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48 проявлял инсектицидную активность в отношении пяти видов чешуекрылых вредителей (Lepidoptera): боярышнице (Aporia crataegi L.), капустной белянке (Pieris brassicae L.), капустной совке (Mamestra brassicae L.), капустной моли (Plutella xylostella L.), большой вощинной огневке (Galleria melonella L.).

Однако этот штамм не обладает стабильностью синтеза параспоральных кристаллов и при культивировании в жидких питательных средах диссоциирует с образованием колоний с ровным и ворсинчатым краем, причем варианты с ровным краем полностью утратили инсектицидную активность. При культивировании штамма Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48 на питательной среде, содержащей пептон, соевую муку, фосфорнокислый калий, сернокислый магний, получают культуральную жидкость с титром спор 0,25-0,53 млрд/мл, концентрацией инсектицидного белка не более 200 мкг/мл.

Недостатком штамма Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48 является то, что он не отвечает важному для промышленного производства критерию морфологической стабильности, а это снижает инсектицидную активность культуральной жидкости. Длительность культивирования до высыпания спор и кристаллов составляла 67-88 часов, недостаточная концентрация инсектицидного белка, которая составляет не более 200 мкг/мл.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение более технологичного штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai, отличающегося морфологической стабильностью при культивировании в жидких питательных средах, сокращением времени его культивирования до 48-50 часов, с повышенным синтезом инсектицидного белка до 1000 мкг/мл, обладающего активностью против широкого спектра насекомых-вредителей отряда Lepidoptera.

Указанный технический результат достигается созданием штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54, проявляющий инсектицидную активность против вредителей - насекомых отряда Lepidoptera с целью получения инсектицидного препарата, используемого в органическом земледелии и депонированный в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14026. Справка о депонировании прилагается.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 представлен внешний вид штаммов: а) заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ВКПМ -14026; б) штамм-прототип Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48; при рассеве на агаризованной среде. На фиг. 2 приведена световая микроскопия культуральных жидкостей штаммов Bt ssp. aizawai В48 (А) и заявляемого Bt ssp. aizawai ВКПМ В-14026 (Б) после 48 часов культивирования. На фиг. 3 представлен скриншот результатов идентификации заявляемого штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp .aizawai Bta 54 получен путем многоступенчатой селекции штамма Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48. Суспензию штамма Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48 в бульоне Луриа-Бертрани с добавлением 0,25М ацетата натрия инкубировали 4 ч при 30°С, постоянно перемешивая. Затем образцы прогревали при 80°С в течение 15 минут и точечно высевали на агаризованные среды с различным содержанием аминного азота и глюкозы. Выросшие колонии исследовали световой микроскопией для определения наличия и синхронности высыпания параспоральных кристаллов на всех средах. Отобранные варианты культивировали в жидких питательных средах для определения морфологической однородности и стабильности. Полученный штамм Bacillus thuringiensis ssp .aizawai Bta 54 обладал морфологической однородностью и образовывал крупные бипирамидальные кристаллы после культивирования в жидкой питательной среде через 48 часов. Штамм давал положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Н7, был депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных микроорганизмов, что подтверждается справкой о депонировании от 21 мая 2021 г. (Справка прилагается).

Результаты по идентификации заявляемого штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 с помощью секвенирования нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактериальной ДНК.

Исходные условия: четыре образца геномной ДНК

Краткий протокол работы:

• Получена ДНК фрагмента гена 16S размером около 1500 н.п, с помощью ПЦР и специфических для гена 16S рРНК праймеров в препаративном количестве.

• Полученная ДНК очищена от компонентов реакции ПЦР (праймеры, dNTP, полимераза) с помощью сорбции на магнитных частицах.

• Фрагмент гена 16S рРНК для каждого образца секвенирован с двух сторон по методу Сэнгера и проанализирован на автоматическом генном анализаторе ABI3130XL.

• Секвенограммы всех исследуемых образцов ДНК проанализированы на предмет гомологии/идентичности с помощью программы BLAST базы данных ГенБанк и классификатора базы 16S рибосомальных последовательностей - RDB.

Результаты по образцу - Bac_thur_54_16S_1500

Ниже приведена сшитая из секвенограмм последовательность образца:

При сравнении с помощью программы BLAST указанная последовательность совпадает со структурой Bacillus wiedmannii strain NY-19 16S ribosomal RNA gene, partial sequence и Bacillus thuringiensis strain Xmb014 16S ribosomal RNA gene, partial sequence (см. фиг. 3).

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ B-14026 не продуцирует водорастворимый β-экзотоксин, синтезирует инсектицидный δ-эндотоксин, состоящий из белков, кодируемых cry1, cry2 и сгу9-генами.

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ -14026 имеет более широкий спектр энтомопатогенной активности, в том числе способен контролировать таких проблемных вредителей, как хлопковая совка. Кроме того, этот штамм проявляет инсектицидную активность в отношении популяции большой вощинной огневке (Galleria melonella L.) устойчивой к действию штаммов В. thuringiensis ssp.galleriae.

Паспортные характеристики штамма Bacillus thuringiensis ssp.aizawai Bta 54 ВКПМ -14026

1. Культивирование штамма.

В качестве питательных сред использовали LB, А, Б следующего состава, г/л:

среда LB:

триптон «Difco» - 10,0;

дрожжевой экстракт « Difco» - 5,0;

NaCl - 10,0;

вода - 1000 мл.

среда А:

пептон «Difco» - 7,0;

панкреатический гидролизат рыбной муки - 4,0;

NaCl - 5,0;

вода - 1000 мл.

среда Б:

пептон «Difco» - 7,0;

панкреатический гидролизат рыбной муки - 4,0;

NaCl - 5,0;

Д-глюкоза - 5,0;

вода - 1000 мл

Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляли агар-агар (1,2 мас. %).

2. Культурально-морфологические признаки.

Аэробные, грамположительные подвижные палочки размером 0,7-1,2 × 2,5-4,0 мкм, образующие жгутики. Через 96 ч роста в стационарной фазе на агаризованной среде «А» образуют овальные споры размером 0,6-0,8 × 1,2-2,0 мкм. Одновременно со спорой образуются параспоральные тельца бипирамидальной формы разных размеров. На среде «А» образует белые плотные колонии с матовой поверхностью. Оптимальная температура роста +28°С. Штамм хорошо растет в Луриа-Бертани (LB) среде. Через двое суток при температуре +28°С на LB агаре образует матовые белые колонии 5-7 мм в диаметре с ровным краем. Колонии имеют плоский профиль, мелкозернистую структуру. При суспендировании в 0,8% физиологическом растворе образует равномерную муть. Рост умеренный, осадок рыхлый.

3. Физиолого-биохимические признаки.

В качестве органического источника азота штамм использует пептон, мясные, рыбные и растительные экстракты, соевую, кукурузную и рыбо-костную муки, автолизаты дрожжей и казеина, гидролизаты соевой и кукурузной муки, кормовые дрожжи. Штамм усваивает аммонийные и нитратные формы азота, глюкозу и глицерин в виде углеводного питания. Культура клеток штамма продуцирует ацетилметилкарбинол, проявляет уреазную, амилазную, протеазную активности. Не сбраживает маннозу, сахарозу с образованием кислоты; не усваивает цитрат; не дает пленку на мясопептонном бульоне и не образует пигмент на желтковых средах. Выражена способность сбраживать салицин. Штамм не продуцирует β-экзотоксин. Дает положительную реакцию жгутикового антигена с типовой сывороткой Bacillus thuringiensis spp. aizawai H-7.

4. Молекулярно-генетические признаки.

Электрофорез споро-кристаллической смеси штамма в SDS-PAGE показал присутствие высокомолекулярного белка в области 130 кДа. Результаты ПЦР-анализа показали присутствие cry1, сгу2 и сгу9-генов в геномной и плазмидной ДНК штамма.

5. Инсектицидные свойства штамма.

Проявляет инсектицидную активность против гусениц чешуекрылых насекомых (Lepidoptera) разных видов: большой вощинной огневки (Galleria melonella) (ceM.Pyralidae), хлопковой совки (Helicoverpa armigera) (ceM.Noctuidae), гроздевой листовертки (Lobesia botrana) (сем. Microlepidoptera).

Ниже приведены примеры 1-7 исследования характеристик заявляемого штамма.

Пример 1. Культивирование штамма Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ B-14026.

Для культивирования штамма использовали стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см³, которые заполняли 50 мл стерильной среды. Среду «А» готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0, разливали в колбы по 50 мл и стерилизовали в автоклаве при давлении 1,1 атм при температуре 121°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы с содержащейся в них средой охлаждали до +20°С. Стерильность и рН контролировали путем отбора соответствующих проб. Затем в колбы вносили по 2 мл посевного материала, приготовленного следующим образом: в стандартную пробирку с 5 мл стерильного физиологического раствора, помещали бактериальную культуру, собранную петлей с агаризованной среды «А», и инкубировали в течение 16 часов при температуре 28°С со встряхиванием 220 об/мин. Содержимое пробирки после светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры использовали как посевной материал.

Штамм выращивали при температуре +28-30°С при встряхивании (220 об/мин) в течение 72 часов. В процессе культивирования осуществляли контроль на отсутствие посторонней микрофлоры светооптическим методом или путем визуального контроля за морфологией колоний, выросших после высева культуральной жидкости штамма на чашки с агаризованной питательной средой «А». Через 72 часа методом световой микроскопии оценивали наличие и размер кристаллов. А также определяли титр КОЕ (колонии образующих единиц - бактериальных клеток и спор), который на среде «А» составлял (6-8)×10⁸ КОЕ/мл.

Пример 2. Оценка морфологической стабильности.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ-14026 при рассеве на агаризованных средах формировал однородные крупные желтовато-белые колонии с реснитчатым краем.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai B48 отличался морфологической неоднородностью: в рассевах присутствовали крупные колонии с реснитчатым краем - морфовар В и плотные белые колонии среднего размера с ровным краем - морфовар Р (см. фиг. 1). Известно, что такая морфологическая неоднородность способствует нестабильности синтеза целевого инсектицидного белка дельта-эндотоксина.

Пример 3. Оценка способности продуцировать β-экзотоксин.

Оценку способности штамма Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ-14026 продуцировать β-экзотоксин проводили в лабораторных условиях на личинках комнатной мухи.

Штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ -14026 культивировали на средах «А» и «Б» в течение 72 часов при +28-30°С при встряхивании 220 об/мин, полученные культуральные жидкости центрифугировали 15 мин при 8000 об/мин, затем фугат автоклавировали при давлении 0,1 МПа и температуре 105°С в течение 20 мин. Для испытания в стеклянную банку вместимостью 200 мл вносили:

- 2 мл культуральной жидкости;

- 11 мл 2,5%-ной водной суспензии сухого молока;

- 7 г стерилизованных пшеничных отрубей.

В положительном контроле вместо культуральной жидкости использовали препарат Битоксибациллин на основе штамма Bacillus thuringiensis ssp. thuringiensis H1 98, в отрицательном контроле - воду. Корм с соответствующими образцами тщательно перемешивали и помещали в банку, куда добавляли по 25 личинок комнатной мухи. Отсутствие экзотоксина оценивали по количеству нормальных имаго на 14 день опыта (таблица!).

Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что штамм Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ В-14026 не продуцирует β-экзотоксин.

Пример 4. Определение концентрации δ-эндотоксина.

Концентрацию δ-эндотоксина определяли с помощью реагента Брэдфорда. Для этого 1 мл отобранной культуральной жидкости центрифугировали, затем дважды промывали 1 М NaCl, осадок дважды промывал дистиллированной водой. Смесь кристаллов и спор растворяли в 50 мМ буфере гидроксида натрия NaOH при 30°С в течение 3 ч при встряхивании. Затем растворенные белки количественно определяли с помощью реагента Брэдфорда

Из данных, приведенных в таблице 2 видно, что концентрация дельта-эндотоксина, синтезируемого штаммом Bt ssp. aizawai ВКПМ В-14026, в 5 раз выше, чем у штамма Bt ssp. aizawai В48.

Пример 5. Длительность культивирования штамма Bt ssp. aizawai Bta 54 ВКПМ В-14026

Время культивирования штамма-продуцента биологически активного вещества - важный показатель, влияющий на себестоимость конечного продукта. Сравнение длительности процесса культивирования двух штаммов Bacillus thuringiensis spp. aizawai (прототипа и заявляемого) до высыпания спор и кристаллов представлено в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3 и на фиг. 2, подтверждают, что время культивирования заявляемого штамма Bt 54 ssp. aizawai ВКПМ В-14026 до образования спор и кристаллов на 17-40 часа меньше времени культивирования штамма Bt ssp. aizawai В48. По достижении 48 часов культивирования у заявляемого штамма отмечался лизис клеточной стенки и выход свободных спор и кристаллов; в это же время (48 ч культивирования) штамм Bt ssp. aizawai В48 находился на начальной стадии спорообразования.

Пример 6. Оценка инсектицидной активности заявляемого штамма в лабораторных условиях. Оценку инсектицидной активности для гусениц 2-3 возраста большой вощинной огневки (Galleria melonella сем. Pyralidae) и гусениц 2-3 возраста хлопковой совки (Helicoverpa armigera сем. Noctuidae) проводили в лабораторных условиях стандартным методом путем внесения разведений споро-кристаллических суспензий штаммов Bt ssp. kurstaki и заявляемого штамма Bt ssp. aizawai ВКПМ В-14026 в соответствующую диету. Штаммы выращивали на агаризованной среде «А» до полного высыпания спор и кристаллов. Споры и кристаллы смывали физиологическим раствором, полученную суспензию разводили дистиллированной водой. Опыты проводили при комнатной температуре в трех повторностях.

Как следует из результатов, представленных в таблице 4, заявляемый штамм ВКПМ В-14026 обладает высокой инсектицидной активностью против личинок большой вощинной огневки (Galleria melonella), чем отличается от штамма Bt ssp.kurstaki, у которого активность против этого насекомого отсутствует.

Примечание - * - 3-й возраст гусениц

Приведенные в таблице 5 данные подтверждают более высокую энтомоцидную активность заявляемого штамма ВКПМ-14026 по сравнению со штаммом Bt ssp. kurstaki против гусениц хлопковой совки 2-3 возраста.

Результаты, представленные в таблице 6, свидетельствуют о высокой инсектицидной активности заявляемого штамма против популяции насекомых Galleria mellonella.

Оценку инсектицидной активности в отношении гусениц 2-3 возраста капустной моли (Plutella xylostella сем. Pyralidae) и гусениц 2-3 возраста капустной совки (Mamestra brassicae сем. Noctuidae) проводили в лабораторных условиях. Штамм ВКПМ В-14026 выращивали на агаризованной среде "А" до полного высыпания спор и кристаллов. Споры и кристаллы смывали физиологическим раствором, полученную суспензию разводили дистиллированной водой. Стандартные по размеру листья капусты обрабатывали споро-кристаллической суспензией штамма ВКПМ В-14026. В контроле корм обрабатывали водой. В качестве эталона использовали споро-кристаллическую суспензию штамма Bt ssp. kurstaki z-52 (основа препарата Лепидоцид). На поверхность листьев помещали по 10 гусениц. Опыты проводили при комнатной температуре в тех поверхностях. Гибель гусениц капустной моли учитывали на вторые сутки (таблица 7), гусениц капустной совки на 2, 3, 6 сутки (таблица 8).

Результаты, представленные в таблице 7, свидетельствует о высокой инсектицидной активности заявляемого штамма против гусениц капустной моли. Биологическая эффективность заявляемого штамма против гусениц капустной моли превосходила таковую штамма Bt ssp kurstaki z-52 (основа препарата Лепидоцид). Кроме биологической эффективности было определено ЛК50 заявляемого штамма ВКПМ В-14026 для гусениц капустной моли, которая уже на первые сутки составила 2,6×10⁶ спор/мл.

Приведенные в таблице 8 данные подтверждают более высокую энтомоцидную активность заявляемого штамма ВКПМ -14026 по сравнению со штаммом Bt ssp. kurstaki. Гибель всех гусениц капустной совки при заражении споро-кристаллической суспензией заявляемого штамма ВКПМ В-14026 наблюдалась на 6 сутки, тогда как в контроле и опыте со штаммом Bt ssp.kurstaki инсектицидная активность против гусениц капустной совки полностью отсутствовала.

Примечание - *- 3-й возраст гусениц

Пример 7. Оценка инсектицидной активности заявляемого штамма в полевых условиях

Полевые испытания проводили в Юго-Западной зоне виноградорства Крыма на виноградниках АО «Агрофирмы «Черноморец» (с.Угловое, Бахчисарайского района). На популяции II генерации гроздевой листовертки провели три обработки с интервалом 12 и 7 дней из расчета 100 л рабочего раствора на 1 га. Для приготовления рабочего раствора 1 л споро-кристаллической суспензии (титр 1,0×10⁹ спор/мл) разбавляли в 100 л воды, рабочий раствор наносили с помощью ранцевого опрыскивателя. В качестве эталона применяли пиретроид Маврик, контролем служили растения без обработки.

Проведенными учетами установлено существенно меньшие значения показателей поврежденности гроздей винограда гусеницами II генерации гроздевой листовертки на обработанных вариантах относительно контрольного (таблица 9).

В агроклиматических условиях Крыма на опытном винограднике проведение трех обработок споро-кристаллической суспензией заявляемого штамма Bt ssp. zawai ВКПМ В-14026 обеспечило высокий уровень защиты от вредителей: 1,2-2,2% поврежденных гроздьев на опытном варианте в сравнении с 7,2-13,4% поврежденных гроздьев на контроле. Биологическая эффективность заявляемого штамма составила 81,9-85,7% (таблица 10).

Таким образом примеры 1-7 и таблицы 1-10 подтверждают получение заявляемого технического результата, а именно: создан более технологичный штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54, отличающийся морфологической стабильностью при культивировании в жидких питательных средах, сокращением времени его культивирования до 48-50 часов, с повышенным синтезом инсектицидного белка до 1000 мкг/мл, обладающего активностью против широкого спектра насекомых-вредителей отряда Lepidoptera.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Проект №3. Штамм

бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai.xml" softwareName="WIPO

Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-08-18">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023118503/20(039722)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-12</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>1234567</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023118503/20(039722)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-12</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Общество с ограниченной

отвественностью (ООО) «Микопро».</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>OOO &quot;Mikopro&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Штамм бактерий Bacillus

thuringiensis ssp. aizawai, проявляющий инсектицидную активность

против вредителей – насекомых отряда Lepidoptera</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>1425</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..1425</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttaggcggctggctccnaaaaggttaccccaccgacttcgggtgttaca

aactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcg

attactagcgattccagcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaacggttttatgag

attagctccacctcgcggtcttgcagctctttgtaccgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcata

aggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgccc

aacttaatgatggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacg

agctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgctcccgaaggagaagccctatctctagggttttcag

aggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgg

gcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttaac

ttcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtat

ctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagtgtcagttacagaccagaaagtcgccttcgccac

tggtgttcctccatatctctacgcatttcaccgctacacatggaattccactttcctcttctgcactcaa

gtctcccagtttccaatgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccacctg

cgcgcgctttacgcccaataattccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgta

gttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccagcttattcaactagcacttgttcttcccta

acaacagagttttacgacccgaaagccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccatt

gcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcac

cctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgacgcggg

tccatccataagtgacagccgaagccgcctttcaatttcgaaccatgcagttcaaaatgttatccggtat

tagccccggtttcccggagttatcccagtcttatgggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccg

ctaacttcntnagagcaagctctctaatccattcgctcgacttgca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму спорообразующих бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai, обладающему инсектицидным действием в отношении чешуекрылых насекомых-вредителей, и может быть использовано в биотехнологии для получения микробиологических средств защиты сельскохозяйственных, лекарственных и лесных культур от вредных насекомых, технологичного штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta54, отличающегося морфологической стабильностью при культивировании в жидких питательных средах, сокращением времени его культивирования до 48-50 часов с повышенным синтезом инсектицидного белка 1000 мкг/мл, обладающего активностью против широкого спектра насекомых-вредителей отряда Lepidoptera, созданием штамма бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54, проявляющего инсектицидную активность против вредителей - насекомых отряда Lepidoptera, пригодного для органического земледелия и депонированного в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14026. 3 ил., 10 табл.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ssp. aizawai Bta 54, проявляющий инсектицидную активность против вредителей - насекомых отряда Lepidoptera, пригодный для органического земледелия и депонированный в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-14026.