СПОСОБ ОЧИСТКИ И ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, КОНТАМИНИРОВАННОГО МИКРООРГАНИЗМАМИ Российский патент 2000 года по МПК A61K33/18 A61K38/00 

Изобретение относится к бионеорганической химии, фармакологии и экспериментальной микробиологии.

Ферментные препараты лизоцима (Ly), трипсина (Tr), дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы), рибонуклеазы (РНК-азы) широко используются в медицинской практике для обработки поверхностей инфицированных ран, слизистых оболочек с целью очистки от продуктов распада тканей и более быстрого заживления. Также Ly и ДНК-аза используются в офтальмологии для лечения офтальмогерпеса и профилактики гнойных осложнений. Tr применяют при лечении заболеваний легких и туберкулеза, для разжижения гнойного экссудата и продуктов распада клеточной ткани. Определенную роль играют ферменты ДНК-аза и РНК-аза в лечении вирусных заболеваний.

Недостатками данных способов является то, что ферментные препараты катализируют только реакции гидролиза биомакромолекул нежизнеспособных тканей и обладают очень слабой антимикробной активностью. Кроме того, используемые ферменты не позволяют достичь надежного антимикробного действия, эффекта сорбции микроорганизмов, их антигенов, токсинов, отделения бактерий от тканей и последующего удаления их из раны.

В качестве прототипа нами избран способ применения ферментов для лечения обширных гнойных процессов ожоговых травм, обморожений, офтальмологических и вирусных заболеваний согласно:
Инструкции по применению лизоцима, утвержденной начальником Управления по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники МЗ СССР (от 21.04.1876 г.);
Инструкции по применению трипсина кристаллического, утвержденной Фармакологическим комитетом ИЗ СССР от 13.06. 1963 г.;
Инструкции по применению химотрипсина кристаллического, утвержденной Фармакологическим комитетом МЗ СССР от 12.10.1963 г.;
Инструкции по применению дезоксирибонуклеазы, утвержденной начальником Управления по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники МЗ СССР (от 12.06.1986 г.);
Инструкции по применению рибонуклеазы аморфной, утвержденной Начальником Управления по внедрению новых лекарственных средств и медицинской техники МЗ СССР (от 19.12.1973 г.).

Местное и парентеральное применение Ly, Tr, ДНК-азы и РНК-азы обеспечивает соответственно антибактериальный эффект, очищение гнойных очагов от нежизнеспособных тканей и гноя, антивирусное действие на ДНК-овые, герпес- и аденовирусы, РНК-овый вирус клещевого энцефалита.

Однако применение ферментов в виде растворов имеет ряд существенных недостатков:
антибактериальное и антивирусное действия незначительны;
гнойный экссудат и нежизнеспособные ткани только разжижаются, но не всегда легко удаляются и без надежной антимикробной терапии проявляется тенденция к рецидиву инфекционного процесса.

Предлагается способ, который базируется на том, что при введении во взвесь бактерий препарата одного из вышеуказанных ферментов образуются субстрат-ферментные комплексы. Визуальным способом формирование таких комплексов не выявляется. Последующее введение в реакционную смесь водного раствора I₂ в KI (раствора Люголя), содержащего как I₂, так и I₃ ^-, I₅ ^-, приводит к образованию сложных твердофазных комплексов фермент - микробный субстрат - I₂ (I₃ ^-, I₅ ^-).

Такие твердофазные комплексные соединения представляют собой микрочастицы фермента, соединенные вандерваальсовыми и водородными связями с субстратными молекулами различных структур микроорганизмов. Связанный с белком йод является достаточно сильным микробоцидом. Микробные клетки прочно связаны с ферментом, не теряющим в твердофазном состоянии свою каталитическую активность и способность к каталитическому расщеплению пептидогликана бактерий, протеинов и нуклеиновых кислот микроорганизмов и нежизнеспособных тканей организма. Включенные в состав ферментных комплексов микроорганизмы легко удаляются при промывании поверхностей и закрытых полостей стерильным физиологическим раствором или перекисью водорода. Существенно, что сорбционная емкость реакции комплесообразования в отношении микроорганизмов огромна и достигает 10⁹-10¹² клеток бактерий/мг твердофазного фермента, что недостижимо для физических методов сорбции /подана заявка на изобретение N 98122582, дата приоритета 11.12.98 г./.

В отличие от методов использования ионообменных смол, активированного угля, гидроокисей алюминия и железа, способ выгодно отличается тем, что он практически существует в природных условиях и имеет место в клетках иммунной системы - макрофагах.

Предлагаемый способ может быть выполнен в двух вариантах.

Вариант 1. В биологический материал, контаминированный микроорганизмами до 10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл вносили раствор фермента в концентрации 0,1-1,0 мг/мл, соинкубировали 3-5 мин при комнатной температуре. Затем в смесь вводили водный раствор Люголя соответственно 1:30-1:3 (I₂ - 0,1 г; KI - 0,2 г; H₂O_dest - 90 мл). Соинкубацию также проводили в течение 3-5 мин при комнатной температуре. После полной седиментации твердофазных комплексов определяли количество кл/мл в супернатанте и осадке турбидиметрическим и микроскопическим методами. Результаты представлены в табл. 1.

Вариант 2. (См. вариант 1). После введения в смесь раствора Люголя добавляли 1,8% раствор FeCl₃ в соотношении 1:200-1:20 в зависимости от количества бактерий в реакционной смеси (10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл). После седиментации твердофазных комплексов определяли количество клеток микроорганизмов вышеуказанными методами. Результаты представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 1 и 2, сорбционная и микробная активность реакции комплексообразования ферментов в отношении различных видов микроорганизмов практически достигала 100%, а при очень высоких показателях микробной обсемененности (до 10⁹-10¹⁰ КОЕ/мл). Биодеструктивный эффект твердофазных комплексов ферментов был значительно меньшим, не превышал 10³-10² кл/мл для Ly и Tr, практически отсутствовал для ДНК-азы и РНК-азы. Следует, однако, отметить, что официальные препараты этих ферментов практически не обладают литической активностью в отношении большинства микроорганизмов.

Предлагаемый способ может применяться при местной терапии инфекционных процессов различной локализации в клинике ЛОР-болезней, хирургии, дермато-венерологии, гастроэнтерологии, пульмонологии, а также для очистки и обеззараживания небольших количеств чрезвычайно загрязненной микроорганизмами воды в полевых, экстремальных условиях.

Список сокращений:
Tr - трипсин
Ly - лизоцим
ДНК-аза - дезоксирибонуклеаза
РНК-аза - рибонуклеаза
КОЕ - колониеобразующая единица
I₂ - молекулярный йод
I₃ ^-, I₅ ^- - полииодидые

Изобретение относится к бионеорганической химии, фармакологии и экспериментальной микробиологии. Способ очистки и обеззараживания биологического материала включает внесение в него раствора фермента, инкубирование, внесение водного раствора Люголя и повторное инкубирование. В биологический материал может быть внесен дополнительно раствор FeCl₃. Способ дает возможность получить не только микробоцидный эффект, но и сорбировать и удалять из организма внеклеточные микроорганизмы, антигены, токсины микроорганизмов и продукты распада поврежденных в результате инфекций тканей и позволяет расширить эффективность действия ферментов и избежать иммунологических осложнений. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ очистки и обеззараживания биологического материала, контаминированного микроорганизмами, включающий внесение в него раствора фермента, отличающийся тем, что используют раствор фермента в концентрации 0,1 - 1,0 мг/мл, после чего биологический материал инкубируют 3 - 5 мин при комнатной температуре, а затем в него вносят водный раствор Люголя в разведении 1 : 30 - 1 : 3 и инкубируют еще 3 - 5 мин. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в биологический материал дополнительно вносят 1,8%-ный раствор FeCl₃ в соотношении к биологическому материалу 1 : 200 - 1 : 20.