СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К БИОДЕСТРУКТИВНОМУ ДЕЙСТВИЮ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/02 C12N9/99 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной микробиологии, лазерной медицине и технике. Оно может быть использовано для разрушения микроорганизмов с помощью лазерного луча (ЛЛ) на поверхности различных материалов (живые ткани, металл, стекло, полимеры и т.д.).

Известные методы основаны на создании чувствительности у микробных клеток к ЛЛ (фотосенсибилизации) с помощью прижизненного (витального) окрашивания различными красителями [6,7]. Ассортимент таких красителей обширный и продолжает расширяться [6].

Недостатки способа витальной сенсибилизации микроорганизмов многочисленны: 1) живые клетки практически не окрашиваются большинством известных красителей в силу гидрофобности клеточных мембран; 2) наиболее реакционноспособные в отношении клеточных структур микробов красители зачастую токсичны для клеток человека; 3) нетоксичные красители обладают слабой реакционной способностью и могут лишь в незначительной степени окрашивать живые клетки только при условии постоянного поддержания концентрации препаратов в среде; 4) растекание и/или диффузия красителя на горизонтальных поверхностях тканей приводит к снижению его концентрации, это сопровождается значительным уменьшением эффективности окрашивания микроорганизмов, вплоть до полной утраты ими препарата; 5) при прижизненном окрашивании микроорганизмов, располагающихся на наклонных, вертикальных поверхностях объектов почти невозможно получить нужный эффект, т.к. стекание растворов красителя не компенсируется дополнительным расходом препаратов и увеличением времени обработки; 6) капсулы, споры бактерий, споры и мицелий микроскопических грибов, вирусы бактерий и человека вообще не окрашиваются с помощью витальных методов.

Предлагаемый способ "принудительного" витального окрашивания микроорганизмов базируется на способности фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) и молибдата аммония (МА) образовывать комплексные соединения с полярно заряженными молекулами различных соединений [4], включая ряд красителей, полипептиды, полисахариды, липиды клеток [2-6]. Важно, что полианионы или гетерополиоксикислоты Кеггина обладают свойствами полифункциональных химических агентов, т. е. образуют комплексные соединения одновременно с разными классами молекул. При этом на поверхностных структурах микробов прижизненно формируется достаточно прочный слой комплексных соединений типа ФВК (или МА) - краситель - биомолекулы клеточных стенок, биомембран. Это соединение является меткой, фотосенсибилизатором микроорганизмов к ЛЛ.

Для этого микроорганизм обрабатывают 5-10 с 1%-ным (масса/объем) водным раствором ФВК или МА. Затем в течение 5-10 с проводят обработку равным объемом 0,25%-ного (масса/объем) раствора нетоксичного красителя метиленового синего (МС), эмпирическая формула - NNN'N'-тетраметилтионинхлорид.

Наиболее близкими прототипами являются два метода витальной фотосенсибилизации.

Первый из них [8] основан на витальной окраске патогенных стафилококков, устойчивых к антибиотику метициллину, с помощью водного раствора красителя - толуиндинового синего в концентрации 1,6-12,5 мкг/мл. Исследовали действие луча гелий-неонового лазера 35 mW в дозе 0,5-2,1 J на суспензию стафилококков плотностью 1•10¹⁰ клеток/мл в присутствии полуиндинового синего (1,6-12,5 мкг/мл). Установлено, что при действии дозы света 2,1 J, плотности энергии 43 J/см² и концентрации толуидинового синего 0-12,5 мкг/мл жизнеспособность микроорганизмов после облучения восстанавливается только у 10⁴ клеток/мл. Эффект лазерной инактивации зависит от дозы лазерного излучения и концентрации красителя.

Второй метод [7] практически идентичен с первым. Исследовали фотосенсибилизирующую активность красителей: кристаллического фиолетового тионина, метиленового синего, протопорфирина IX, дериватов гематопорфирина, толуидинового синего 0, дисульфонат алюминий фталоцианина. Объект фотосенсибилизации - Helicobacter pylori, являющийся причиной различных желудочно-кишечных заболеваний. Использовали лазер малой мощности. Облучение микроорганизмов проводили в присутствии красителей во взвесях, на плотной питательной среде (кровяной агар), в культуре соматических клеток. Красители не обладали антибактериальной активностью, лазерное излучение без красителей не убивало микроорганизмы. Тионин и кристаллический фиолетовый не обнаружили фотосенсибилизирующей активности.

Метиленовый синий в концентрации 100 мкг/мл; протопорфирин IX в концентрации 150 мкг/мл; дериваты гематопорфирина в концентрации 100 мкг/мл; толуидиновый синий 0 в концентрации 150 мкл/мл; идисульфонат алюминий фталоцианин в концентрации 100 мкг/мл обнаружили киллинговую активность при действии лазерного излучения плотностью соответственно 21 J/см²; 320 J/см²; 160 J/см²; 16 J/см².

Важно, что наибольшая эффективность лазерного излучения имелa место при фотосенсибилизации дисульфонат алюминий фталоцианином, т.е. металлсодержащим красителем.

Максимальная гибель микробов примерно 99%.

Недостатки прототипных методов:
1. Невозможность поддерживать постоянную концентрацию растворов фотосенсибилизаторов.

2. Невозможность обработки объектов, располагающихся на негоризонтальных поверхностях.

3. Невозможность предотвратить диффузию и растекание красителей в горизонтальных плоскостях живых тканей и объектах неживой природы.

4. Отсутствие прочной связи красителей с поверхностными структурами микроорганизмов.

5. Отсутствие эффекта концентрации красителя на поверхности микроорганизмов.

6. Невозможность витальной окраски спор, капсул, мицелия грибов, капсидов вирусов.

7. Малый ассортимент эффективных металлосодержащих красителей.

8. Сравнительно большая длительность окрашивания, связанная с необходимостью использования низких концентраций красителей во избежание повреждения соматических клеток.

9. Жесткие требования к выбору фотосенсибилизаторов, связанные с большой вероятностью повреждения живых тканей из-за достаточно длительной экспозицией красителей.

10. Несмотря на то что эффективность биодеструкции микроорганизмов лазерным излучением более 99%, однако она не достигает 100%. В то же время 1% выживших клеток в суспензии микробов плотностью 10⁹-10¹⁰ клеток/мл составляет 10⁷-10⁸ клеток/мл соответственно. Иными словами, выжившие 10⁷-10⁸ клеток/мл может свести к нулю эффективность лазерной биодеструкции, т.к. необходимая эффективность может быть обеспечена только 100%-ной гибелью микроорганизмов.

Новизна и преимущество разработанного метода.

1. Новизна состоит в "принудительном" прижизненном окрашивании микроорганизмов не с помощью красителей, а с помощью реакции комплексообразования между красителем МС, ФВК или МА и биомолекулами полипептидов, полисахаридов, липидов поверхностных структур микроорганизмов [1,6].

2. Новизна связана с тем, что целью этой реакции является образование малорастворимого окрашенного комплекса, который является фотосенсибилизатором т.к. содержит одновременно краситель и ионы металлов (вольфрам или молибден).

3. Новым является возможность широкого варьирования применения указанной реакции для образования комплексов типа "краплаков" [5] с различными красителями: толуидиновым синим 0, кристаллическим фиолетовым, трифенилметановыми красителями и рядом других основных водорастворимых красителей.

4. Новым является возможность эффективного прижизненного окрашивания спор бактерий, капсул бактерий, спор микроскопических грибов, мицелия грибов и актиномицетов, капсидов вирусов, соматических клеток, поверхность которых колонизированa микроорганизмами.

5. Новым также является устранение всех вышеуказанных недостатков прототипных методов витального окрашивания микроорганизмов (см. п. 1-10 раздела "Недостатки прототипных методов").

6. Новым также можно считать то обстоятельство, что разработанный нами метод устраняет недостатки прототипных методов чрезвычайно простым (два этапа обработки, время обработок 10-20 с) способом:
А) Поверхность объекта, содержащего микроорганизмы, обрабатывают 5-10 с 1%-ным (масса/объем) водным раствором ФВК или МА.

Б) Затем эту же поверхность обрабатывают равным объемом 0,25%-ным (масса/объем) раствором нетоксичного красителя - МС. Растворы лучше смешать. Промывка поверхности объекта допустима, но не обязательна. Это зависит от природы объекта: живые ткани можно промыть, неживые - необязательно.

Примечание:
Концентрации ФВК, МА, МС можно уменьшить, но соотношение гетерополианион: краситель должно соответствовать 1:4. При уменьшении концентрации ФВК, МА, МС время окрашивания необходимо соответственно увеличить. При окрашивании объектов, расположенных на негоризонтальных поверхностях необходимо использовать вышеуказанные концентрации компонентов. Это обеспечивает почти мгновенное прочное окрашивание.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами лабораторных испытаний.

Пример 1. Штаммы микроорганизмов: 1) E.coli K 12; 2) Е.coli С; 3) Staph. aureus 209 P; 4) Str.viridans; 5) B.subtillis N 83 (вегетативные клетки); 6) B. subtillis N 83(вегетативные клетки, споры); 7) Candida albicans; 8) Penicillum notatum (мицелий и споры); 9) Aspergillus niger (мицелий, споры); 10) Kl. pneumoniae; 11) вирус бактерии (бактериофаг) f 52. Взвеси клеток вышеуказанных микроорганизмов в объеме 2 мл (плотность 5•10⁹ и 5•10⁸ клеток/мл) помещали в пробирки с 2 мл водного раствора МС, конечная концентрация - 1% (масса/объем) на 30 мин. Клетки осаждали центрифугированием (5000 об/мин, 1 мин), раствор МС декантировали, клетки трижды отмывали от остатка раствора МС повторным центрифугированием (5000 об/мин, 1 мин). Количество несвязанного клетками красителя определяли в супернатанте фотоколориметрическим методом. Обработанные красителем клетки ресуспензировали добавлением дистиллированной воды до исходного объема. Взвеси клеток плотностью 5•10⁹ клеток/мл в объеме 0,1 мл помещали на предметные стекла (площадь мазка - 2 см²), подсушивали без фиксации. Мазки подвергали действию луча лазера (ЛЛ) в течение 10 мин. Марка лазера ЛТИПЧ-6 (алюмоиттриевый гранат, вторая гармоника), длина волны 0.53 мкм, мощность излучения на частоте 25 Гц - 0,67 Вт. Контрольные посевы для определения наличия и количества жизнеспособных клеток до и после МС, ЛЛ проводили двумя способами: 1) методом отпечатка мазка на поверхность мясопептонного агара (МПА), 2) количественным методом смыва обработанных лазером бактерий и вирусов бактерий с предметного стекла, последующей 10-кратной раститровки от 10^-1 до 10^-7, с последующим посевом образцов разведений в объеме 0,1 мл на поверхность МПА и подсчетом колоний бактерий и негативных колоний вирусов. Результаты представлены в табл.1.

Пример 2. Технология обработки микроорганизмов аналогична изложенной в примере 1. Отличие состоит в том, что перед окрашиванием клеток МС осуществляли обработку микроорганизмов 1%-ным (масса/объем) водным раствором ФВК в течение 10 с. После отмывания образцы клеток микроорганизмов окрашивали МС. Использовали МС в концентрации: 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,062; 0,031; 0,016; 0,008; 0,004; 0,002% (масса/объем). Время обработки красителем - 10 с. Результаты указаны в табл. 1, 2.

Пример 3. Технология обработки микроорганизмов аналогична изложенной в примере 2. Отличие состоит в том, что вместо 1%-ного (масса/объем) водного раствора ФВК использовали 1%-ный (масса/объем) водный раствор МА. Результаты указаны в табл. 1, 2.

Пример 4. Технология обработки микроорганизмов аналогична изложенной в примере 2. Отличие состоит в том, что обработку клеток растворами МС и ФВК проводили не в пробирках, а на поверхности предметных стекол. Плотность взвеси микроорганизмов - 5•10⁹ клеток/мл. Титр бактериофага f 52 - 1•10¹¹ вирионов/мл. Объем наносимых взвесей - 25 мкл. Площадь мазков - 2 см². Мазки подсушивали на воздухе, фиксацию мазков не производили. Водные растворы ФВК и МС удаляли с поверхности препаратов стряхиванием. Отмывку препаратов производили только па последнем этапе обработки путем помещения их в химический стакан с дистиллированной водой. Количество жизнеспособных клеток и вирионов бактериофага f 52 до и после воздействия ЛЛ осуществляли так, как указано в примере 1. Результаты приведены в табл. 2.

Пример 5. Технология обработки микроорганизмов аналогична изложенной в примере 4. Отличие состоит в том, что вместо 1%-ного (масса/объем) водного раствора ФВК использовали 1%-ный (масса/объем) водный раствор МА. Результаты указаны в табл. 2.

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, МС связывается клетками микроорганизмов в реакции комплексообразования при соотношении МС:ФВК- 1:1,1: 2,1: 4,1: 8 соответственно на 97,0-98,5; 98,5-99,2; 100; 97,0%. Если соотношение МС:ФВК превышает 1:2, т.е. составляет 1:16 и выше, эффективность связывания МС микробными структурами за время проведения реакции 10-20 с и во время отмывки центрифугированием клеток ≅ 5 мин) приближается к 0%.

Примерно аналогично происходит реакция комплексообразования с участием МА и МС. Так, при соотношении МС:МА, равном 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, количество связанного с клетками МС составляет соответственно 88,0; 94,0; 100; 88,0-94,0%. При увеличении соотношения МС:МА более 1:8 эффективность МС с клеточными структурами в течение вышеуказанного времени составляет 0%.

Как следует из данных, приведенных в табл. 2, титры жизнеспособных микроорганизмов после их обработки МС; ФВК, МС; МА, МС; ЛЛ практически не изменялись. Некоторое исключение составляют дрожжеподобные грибы рода Candida (снижение в 10-50 раз за счет чувствительности к МС).

После обработки МС, ЛЛ титры жизнеспособных клеток уменьшились примерно на 1-2 порядка, снижение иногда превышало 99%.

После "принудительной" сенсибилизации клеток комплексами, включавшими ФВК-МС, МА-МС, лазерное облучение приводило к 100%-ной биодеструкции всех изученных микроорганизмов (включая капсульные и спорообразующие виды), спор, мицелия, вирусов бактерий.

Предлагаемое использование разработанного "Способа повышения чувствительности микроорганизмов к биодекструктивному действию лазерного излучения".

1. Медицинское применение: обработка инструментария, который нельзя стерилизовать с применением высокой температуры, пара, агрессивных химических дезинфицирующих агентов (эндоскопы, оптика и др.).

2. Медицинское применение: обработка тканей организма человека, инфицированных микроорганизмами (гнойные осложнения, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, эрозии шейки матки и др.).

3. Техническое применение: профилактика биокоррозии, борьба с биокоррозией дорогостоящей аппаратуры, конструкций, оптики, особенно при их эксплуатации в условиях тропического климата, под водой и т.п.

Список литературы
1. "Селективная сенсибилизация микробных клеток к лазерному излучению с помощью галогенирования и полианионов вольфрама", Богатов В.В, Стрелец E.В, Чистов В.Б. Червинец В.М., Волков Ю.А./Материалы IV Международного конгресса "Проблемы лазерной медицины", май, 1997, c. 241-242.

2. "Неорганическая химия", Степин В.Д., Цветков А.А. М.: Высшая школа, 1994, с. 444-460.

3. "Электронная гостохимия". Гайер Г.М. М.: Мир, 1974, с. 46, 79-81, 94-95.

4. "Твердые кислотные катализаторы". Джон Мьюриган Томас. "В мире науки", Scientific american, N 6, 1992, с. 52-59.

5. "Фосфор. Основы химии, биохимии, биотехнологии" Кобридж Д., М.: Мир, 1982, с. 143-144.

6. "Triple conyugates of immunoglobulines (Ig), antibiotics and heteropolianions". Strelets E.V., Maximova N.S. Egorova E.N. International Journal on immunorehabilitatoin. 1996, May, N 3, p. 45.

7. "The Killing of Helicobacter pylori by low-power light in the presens of fhe photo sensitiser". Wilson C.E.; Wilson M.; Macrobert A.J.; Sedwell J. ; Bown S.S./J. Med. Microbiol., 1996, Apr., 44(4), p. 245-252.

8. "Killing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by low-power laser light". Wilson M.; Yianni C./J. Med. Microbiol., 1995, Jan., 42(1), p. 62-66.

Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, лазерной медицине и технике, а именно к технологии стабильного "принудительного" прижизненного мечения микроорганизмов "фотосенсибилизатором". Способ предусматривает создание метки-сенсибилизатора на поверхности клетки живых микроорганизмов проведением реакции комплексообразования между полипептидами, полисахаридами, липидами микроорганизмов и фосфорно-вольфрамовой кислотой или молибдатом аммония и NNN^'N^'-тетраметилхлоридом. Принудительная сенсибилизация клеток вышеоговоренными комплексами приводит к 100%-ной биодеструкции всех изученных микроорганизмов. 2 табл.

Способ повышения чувствительности микроорганизмов к биодеструктивному действию лазерного излучения, предусматривающий создание метки - сенсибилизатора, отличающийся тем, что метку создают на поверхности клетки живых микроорганизмов проведением реакции комплексообразования между полипептидами, полисахаридами, липидами живых микроорганизмов и фосфорновольфрамовой кислотой или молибдатом аммония и NNN'N'-тетраметилхлоридом.