СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРОЛЭСТЕРАЗЫ, ТРИПСИНА, ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ И РИБОНУКЛЕАЗЫ ИЗ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2007 года по МПК C12N9/64 C12N9/16 C12N9/22 C12N9/76 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству лекарственных препаратов из животного сырья, и может найти применение в производстве медицинских препаратов - рибонуклеазы панкреатической аморфной, дезоксирибонуклеазы панкреатической аморфной, трипсина, а также холестеролэстеразы.

Рибонуклеаза аморфная панкреатическая и дезоксирибонуклеаза аморфная панкреатическая являются препаратами нуклеазного действия и используются в медицине для лечения вирусных заболеваний. Так, рибонуклеаза (РНК-аза) используется для лечения клещевого энцефалита, вирусных менингитов. Дезоксирибонуклеаза (ДНК-аза) способна тормозить размножение ДНК-содержащих вирусов: осповакцины, аденовируса, герпеса. Применение же трипсина в медицинской практике основано на его способности расщеплять некротизированные ткани и фибринозные образования, разжижать вязкие секреты, сгустки крови. Трипсин применяют при воспалительных заболеваниях дыхательных путей (трахеиты, бронхиты, пневмонии и др.). Холестеролэстеразу используют в качестве основного реагента в медицинских диагностических тест-системах для определения холестерина в сыворотки крови человека.

В промышленной технологии и прототипе заявляемого способа [Тугунов С.С., Константинов В.Л., Манойлов С.Е., Дмитриева В.А. // Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратов ферментов трипсина, химотрипсина и рибонуклеазы из панкреатической железы. / Труды Ленинградского химико-фармацевтического института. - 1967. - Вып.20, с.9-18] выделяют три фермента - трипсин, химотрипсин и рибонуклеазу панкреатическую.

После отделения химотрипсина сульфат аммонийным осаждением в фильтрате устанавливали рН 2,8, добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, осадок трипсиногена растворяли в тройном объеме дистиллированной воды, обрабатывали кизельгуром и фильтровали. К прозрачному раствору добавляли насыщенный раствор сульфата аммония в количестве 2/3 от количества воды, взятой на растворение трипсиногена. Раствор фильтровали и к фильтрату добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония. Образовавшийся осадок после фильтрации растворяли в дистиллированной воде. К полученному раствору добавляли равный объем 1 М раствора хлористого кальция и доводили до рН 8,0 с помощью насыщенного раствора гидрата окиси кальция. Кислотность раствора снижали 5 н. серной кислотой до рН 3,0 и образовавшийся трипсин высаливали сульфатом аммония, взятым из расчета 240 г/л. Осадок отфильтровывали, а к фильтрату добавляли еще 240 г/л сухого сульфата аммония. Полученный осадок отфильтровывали и промывали 40% раствором сульфата аммония. Осадок трипсина растворяли в трех объемах дистиллированной воды, диализовали и сушили.

Очистку производственного высола рибонуклеазы осуществляли следующим образом: осадок растворяли в дистиллированной воде, обрабатывали кизельгуром и фильтровали. Полученный осадок отделяли, а из фильтрата осаждали балластные белки путем добавления насыщенного раствора сульфата аммония с рН 2,5. Затем добавляли 1 н. NaOH до значения рН 7 и быстро снижали рН добавлением 1 н. Н₂SO₄ до значения рН 4,8. После 20-минутного отстаивания смесь фильтровали, обрабатывали инфузорной землей и снова фильтровали. Осадок балластных белков отделяли, а из полученного фильтрата осаждали рибонуклеазу. Для этого в прозрачном фильтрате устанавливали значение рН 4,2 путем добавления 5 н. H₂SO₄, осаждение вели кристаллическим сульфатом аммония в течение 2 ч, полученную смесь фильтровали. Осадок растворяли в дистиллированной воде, устанавливали значение рН 4, полученный раствор нагревали до 95-97°С, раствор выдерживали в течение 10 мин, охлаждали до 20-25°С и перемешивали в течение 1 ч. Выпавший осадок балластных белков отфильтровывали и отбрасывали, а фильтрат, содержащий рибонуклеазу, подвергали диализу. Очищенный раствор фермента подвергали стерильной фильтрации, а затем лиофильной сушке.

В аналоге изобретения [Пат. РФ 2152995, С12N 9/22, 20.07.2000] производственный высол, полученный по прототипу [Тугунов С.С., Константинов В.Л., Манойлов С.Е., Дмитриева В.А. // Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратов ферментов трипсина, химотрипсина и рибонуклеазы из панкреатической железы. / Труды Ленинградского химико-фармацевтического института. - 1967. - Вып.20, с.9-18], растворяли и фильтровали, фильтрат подвергали сорбции на изопористом макросетчатом сульфокатионите, являющемся сополимером полистирола и монохлордиэтилового эфира, при рН 4,5-6,5 с последующей элюцией фермента водно-спиртовым раствором с рН 2-3. В качестве элюента использовали этанол или изопропанол в 0,1-0,5 н. HCl. Очистку рибонуклеазы осуществляли следующим образом: производственный высол рибонуклеазы растворяли в ацетатном буферном растворе с рН 4,5-6,5 и фильтровали. Фильтрат подавали на ионообменную колонку с сорбентом со скоростью 50-150 мл/см² ч. После окончания сорбции колонку промывали дистиллированной водой в количестве, равном свободному объему колонки. Затем осуществляли десорбцию рибонуклеазы со смолы путем подачи сверху вниз элюента со скоростью 25-50 мл/см² ч. В качестве элюента использовали подкисленный водно-спиртовой раствор с рН 2-3 и концентрацией спирта в элюенте 30-60% по объему. Во фракцию элеата, содержащую более 10 мг/мл белка, добавляли 1 н. NaOH до рН 7-8 и охлажденный спирт до полного осаждения целевого продукта.

Получение фермента холестеролэстеразы по аналогу заявляемого способа [Edvin A. Rudd, Nancy K.Mizuno, Howard L. Brockman. // Biochem. et Biophys. Acta. - 1987. - Vol.918. - P.106-114] включало следующие стадии очистки: измельченную поджелудочную железу крупного рогатого скота или свиньи экстрагировали в течение 7 мин в гомогенизаторе 0,1 М натрий ацетатным буфером рН 4,8, содержащим 0,9% NaCl, 0,2% тритона К-100, 3 мМ тауролхолата, 2 мМ бензиламиногидрохлорида, 0,2 мМ фенилметилсульфонила фторида, 2 мМ гидрокоричновой кислоты и 0,5 мл N-бензоил-D,L-аргинина. Полученную после центрифугирования и фильтрования суспензию насыщали сульфатом аммония в концентрации 56 мг/мл и доводили рН до 4,8 с помощью ледяной уксусной кислоты. После растворения соли смесь нагревали до 54°С и выдерживали при этой же температуре в течение 15 мин, а затем быстро охлаждали до 7°С. Полученную смесь центрифугировали, фильтровали, к фильтрату добавляли сульфат аммония до концентрации 288 мг/мл, перемешивали в течение 20 мин, затем центрифугировали. Осадок растворяли в растворе (NH₄)₂SO₄ (0,4 М; рН 6,0), содержащем смесь 2 мМ бензиламиногидрохлорида, 2 мМ гидрокоричновой кислоты, 0,5 мМ N-бензоил-D,L-аргинина, а рН раствора доводили до 6,0-6,2 с помощью 5 М NaOH. Затем добавляли двойной объем третбутанол/вода при перемешивании в течение 20 мин. Затем центрифугировали. Жидкие фазы аккуратно декантировали, а гель еще раз суспендировали в 30 мл 50 мМ фосфате калия, содержащем 5 мМ тауролхолата натрия, 0,2 мМ фенилметилсульфонил фторида, 2 мМ гидрохлорида бензамида, 2 мМ гидрокоричновой кислоты и 0,5 мМ N-бензоил-D,L-аргинина (рН 5,0). После перемешивания в течение 20 мин и центрифугирования полученный супернатант замораживали при -70°С. Полученный таким образом фермент для получения гомогенного белка очищали хроматографией на колонке с Sephacryl S-200, а затем на колонке с PDE-94 и TSK 3000 SW колонке. Полученный раствор фермента концентрировали на Amicon YM-30 мембране.

Данный метод получения фермента холестеролэстеразы безусловно является перспективным для выделения особо чистого фермента, но данный метод также отличает многостадийность, большой набор дорогостоящих реактивов и малые выходы целевого фермента (13-25 мг с кг поджелудочной железы), что затрудняет его использование в промышленном получении фермента холестеролэстеразы.

В 1965 г. в Новосибирском Институте Органической Химии СО АН СССР была пущена в работу опытная установка для получения фермента дезоксирибонуклеазы панкреатической (ДНК-азы) из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Совместно с Институтом цитологии и генетики СО АН СССР были разработаны ТУ на препарат и инструкция по его применению, утвержденные органами Министерства Здравоохранения СССР.

Основные процедуры данного метода сводились к следующему: замороженную железу (35 кг) измельчали до фарша. Предварительно в 150-литровой емкости приготавливали 76,5 л 0,25 н. раствора серной кислоты. Часть этого количества кислоты отбирали в емкость, куда непосредственно поступала измельченная поджелудочная железа. Измельченную поджелудочную железу переносили в емкость с оставшейся кислотой, массу перемешивали в течение 1,5 ч. За это время происходила экстракция белков из клеточной массы. Затем для осаждения балластных белков к массе добавляли 11 кг кристаллического сульфата аммония (степень насыщения раствора 0,2) и в течение 1 ч перемешивали. Далее для более полного проведения экстракции к массе постепенно при тщательном перемешивании добавляли 20% раствор едкого натра до рН 4,5-4,6.

Массу выдерживали в течение 10 ч и снова проверяли рН. В случае его снижения добавляли раствор щелочи, после чего отстаивали 36 ч. За это время получалось три слоя: сверху - небольшое количество частиц соединительной ткани, посередине - слой жидкости и внизу - в основном балластные белки.

После удаления верхнего слоя жидкость сифонировали во вторую емкость такого же объема, осадок центрифугировали и супернатанты объединяли. Оставшийся после центрифугирования осадок балластных белков (30-35 кг) выбрасывали.

Раствор во второй емкости при хорошем перемешивании подкисляли серной кислотой до рН 1,5-1,8. Выпавший обильный осадок балластных белков после центрифугирования отбрасывали. Смесь (85-95 л) отстаивали 24 ч, затем надосадочную жидкость переводили в третью емкость, а осадок центрифугировали. Время обработки одной загрузки суспензии на этой операции и на всех последующих составляло 20-25 мин. Твердую фазу (6-8 кг), отделившуюся на центрифуге, выбрасывали.

В третьей емкости (150 л) к супернатанту добавляли кристаллический сульфат аммония по 122 г на 1 л раствора (степень насыщения 0,4). Смесь перемешивали до полного растворения соли (не менее часа) и отстаивали в течение 48 ч. Объем суспензии 85-95 л. После центрифугирования супернатант отбрасывали, а осадок суспендировали в 2 л воды. Начиная с этого момента, все операции проводили в 2-5-литровых стеклянных стаканах. Фермент ДНК-аза растворялся, а не растворившиеся балластные белки отделяли на центрифуге и выбрасывали.

К супернатанту добавляли при перемешивании по 205 мл/л насыщенного при 4-7°С раствор сульфата аммония (степень насыщения 0,17). Смесь отстаивали в течение 3-4 ч, выпавшие балластные белки отделяли на центрифуге. Из супернатанта добавлением по 186 мл/л насыщенного раствора сульфата аммония (степень насыщения 0,3), осаждали вторичную ДНК-азу.

После выдержки в течение 18-20 ч центрифугировали, а полученный осадок суспендировали в 300-500 мл воды.

Суспензию обрабатывали на центрифуге Т-13 R в течение 30 мин. Образовавшийся осадок выбрасывали, а раствор ДНК-азы подвергали диализу для очистки от сульфата аммония. Диализ проводили в специально сконструированном аппарате, представляющем собой цилиндрический сосуд из органического стекла, куда помещали кюветы из оргстекла с решетчатым дном, выложенные изнутри целлофановой пленкой, через который и проходил диализ.

В сосуд заливали 15 л 0,0025 н. раствора серной кислоты, в кюветы - раствор ДНК-азы (600-900 мл). Кислоту в сосуде перемешивали лабораторной мешалкой. Процесс продолжался 48-50 ч, в течение которых 4 раза производили замену 0,0025 н. раствора кислоты. Диализ вели до прекращения выделения осадка при добавлении реактива Неслера к пробе 0,0025 н. раствора кислоты. По окончании диализа раствор ДНК-азы освобождали от небольшого осадка центрифугированием и подвергали лиофильной сушке.

Продолжительность цикла получения препарата составляла 10-13 суток.

Средний выход препарата с операции 24 г или 1,46 г с 1 кг поджелудочной железы, средняя удельная активность 6400 единиц активности (ЕА) на 1 г белка (активность фермента определялась по известному методу). Имели место колебания выхода и активности препарата в отдельных операциях, что объясняется рядом факторов, одним из них является качество сырья поджелудочной железы, которое не удавалось контролировать из-за отсутствия подходящего метода анализа.

Производительность опытной установки была в среднем 750000 ЕА (118 г) в месяц.

Недостатком данного метода являются низкие выходы дезоксирибонуклеазы, высокая трудоемкость и длительность процесса.

Предлагаемое изобретение решает задачу разработки способа последовательного получения четырех ферментов: холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота, позволяющего получать целевые продукты высокой чистоты с высокими удельными активностями и с более высокими выходами по сравнению с прототипом и аналогами.

Задача решается следующим образом.

Описание приведенных чертежей.

На Фиг.1 представлена схема, полученная при элюировании белков градиентом концентрации от 0,01 М до 2 М NaCl (V=S-50 мл, R-50 мл) с колонки, заполненной ДЭАЭ-целлюлозой с нанесенным на нее ферментом рибонуклеазы, где ось ординат показывает оптическую плотность, измеренную при длине волны 260 нм, раствора, собранного с колонки, ось абсцисс показывает объем раствора, собранного с колонки (с повышением объема элюата в нем увеличивается концентрация соли). Каждому пику, изображенному на фигуре, соответствует белок, обнаруженный в определенном объеме элюата с определенной удельной активностью и способный гидролизовать РНК.

На Фиг.2 представлена картина электрофореза рибонуклеазы в 12,5% полиакриламидном геле-ПААГ, полученной по предлагаемому способу (4 и 5 дорожки), и аптечного препарата ОАО «Самсон-мед» (2 и 3 дорожки). Дорожка 1 - маркеры. Дорожки 6 и 7 - рибонуклеаза, полученная по заявляемому способу с использованием диализа против NaP-буфера (рН 6,4).

На Фиг.3 приведена принципиальная схема выделения всех ферментов, начиная со стадии первичной обработки ПЖ КРС.

На Фиг.4 представлена зависимость активности ферментов в сернокислом экстракте от концентрации сульфата аммонии в этом экстракте. Из Фиг.4 следует, что при доведении концентрации сульфата аммония в сернокислотном экстракте до 45-50% в осадок переходит основное количество холестеролэстеразы. Дальнейшее насыщение раствора, полученного после отделения осадка холестеролэстеразы сульфатом аммония до 60-65%, приводит к выпадению в осадок трипсина. При повышении содержания соли до 80-85% осаждается основное количество ДНК-азы, тогда как РНК-аза выпадает в осадок только при насыщении экстракта сульфатом аммония до 95-98%.

На Фиг.5 представлен электрофорез дезоксирибонуклеазы в 10% ПААГ, полученной по предлагаемому способу (3 и 5 дорожки), и препарата ОАО «Самсон-мед» (2 и 4 дорожки). 1 и 6 дорожки - маркеры: Human albumin (65 кДа), Ovalbumin (45 кДа) и Carbonic anhydrase (30 кДа).

На Фиг.6 представлена принципиальная схема установки с полыми полимерными волокнами УПВ-6, где центробежный насос 1; предфильтр 2; колонка с размерами пор 50 кДа 3; колонка с размерами пор 5 кДа 4; фильтр РНК-азы 5; концентрированный раствор РНК-азы 6; фильтр, содержащий низкомолекулярные белки и сульфат аммония, 7.

Поджелудочную железу размельчают на лопастном гомогенизаторе и полученный гомогенат экстрагируют холодным этиловым спиртом ((-18)-(+20)°С) в соотношении 1:1,5 в течение 1,5 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют. Осадок, содержащий рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу, трипсин и холестеролэстеразу экстрагируют 2,5±0,1 мМ раствором серной кислоты, содержащим 5±0,01 мМ сульфата магния, в соотношении 1:4-1:8 в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Экстракт, содержащий целевые ферменты, отделяют от осадка центрифугированием. Балластные белки осаждают добавлением к супернатанту сульфата аммония до 30-35% насыщения и удаляют центрифугированием, а из супернатанта №1 (Фиг.3) осаждают холестеролэстеразу добавлением сульфата аммония до 45-50% насыщения и отделяют центрифугированием. Осадок № 1 (Фиг.3) растворяют в 100±0,1 мМ растворе дигидрофосфата калия с рН=7±0,01, содержащем 0,33 мг/мл холата натрия, и центрифугируется для удаления балластных белков. Полученный супернатант фильтруют и хранят при ((-18)-(+20)°С).

Для отделения трипсина супернатант № 2 (Фиг.3), полученный после отделения холестеролэстеразы, насыщают сульфатом аммония до 60-65%. Осадок № 2 (Фиг.3), содержащий трипсин, отделяют центрифугированием, растворяют в минимальном объеме 2,5±0,1 мМ серной кислоты и диализуют против этого же раствора. Выпавшие в процессе диализа балластные белки отделяют центрифугированием, а супернатант, представляющий собой препарат трипсина, очищают от пирогенных примесей с помощью активированного угля, стерилизуют и лиофильно высушивают.

Дезоксирибонуклеазу осаждают добавлением к супернатанту № 3 (Фиг.3) сульфата аммония до 80-85%-ного насыщения (под 100%-ным насыщением имеется в виду количество соли, при добавлении которого раствор становится насыщенным, а при дальнешем добавлении соли раствор становится пересыщенным и соль выпадает в осадок. Для растворов с сульфатом аммония 100% насыщением является добавление и полное растворение 70,7 г сульфата аммония в 100 мл дистиллированной воды) и отделяют центрифугированием. Осадок № (Фиг.3) растворяют в минимальном объеме 2,5±0,1 мМ раствора серной кислоты, содержащей 5±0,01 мМ сульфата магния, и диализуют против этого же раствора. Выпавшие в процессе диализа балластные белки отделяют центрифугированием, а супернатант, представляющий собой препарат ДНК-азы, очищают от пирогенных примесей с помощью активированного угля, стерилизуют и лиофильно высушивают.

Супернатант № 3 (Фиг.3), содержащий рибонуклеазу, далее очищают ультрафильтрацией на полых волокнах с помощью установки УПВ-6 (Фиг.6). Очищенную рибонуклеазу осаждают сульфатом аммония до насыщения 95-98%, растворяют в минимальном объеме 2,5±0,1 мМ серной кислоты и диализуют против 2,5±0,1 мМ серной кислоты с рН 3-4. Затем очищают на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Мы обратили внимание на возможность элюирования 10±0,1 мМ раствором NaCl с ДЭАЭ-целлюлозы гомогенного белка с очень высокой (600000 е.а./мг) удельной активностью (таблица 1). Удалось показать, что выход этого белка с чистотой более 95% (Фиг.1, 2) может быть доведен до 1,15 г/кг ПЖ КРС (таблица 5).

На Фиг.1 представлена схема хроматографии раствора рибонуклеазы на ионообменной смоле ДЭАЭ-целлюлоза. На Фиг.2 представлен электрофорез рибонуклеазы в полиакриламидном геле, где трек-1 - маркерные белки; треки-2 и 3 - аптечная рибонуклеаза; треки-4 и 5 - рибонуклеаза, полученная по заявляемому способу, но без очистки на ДЭАЭ-целлюлозе; треки-6 и 7 - рибонуклеаза, полученная по заявляемому способу с использованием очистки на ДЭАЭ-целлюлозе.

Методом белкового электрофореза в полиакриламидном геле [Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.- М.: Наука, 1985. - С.109-145] устанавливают молекулярную массу белка ≤14 кДа, соответствующая ферменту рибонуклеаза панкреатическая (Фиг.2).

В элеатах 2 М с раствором NaCl содержится смесь белков с молекулярной массой в пределах 20-60 кДа, удельная активность которых не превышает 160000 е.а./мг (Фиг.2).

Разделение рибонуклеазы на моно- и поликомпонентную фракции является операцией целесообразной, поскольку открывается возможность создания на их основе ферментных препаратов селективного действия. Так, можно полагать, что белок с молекулярной массой ≤14 кДа способен проникать через гематоэнцефалический барьер [Глухов Б.М., Иерусалимский А.П., Салганик Р.И. // Ж. невропатол. и психиатр. 1968. В.3. С.361-364], создавая тем самым условия для ингибирования репродукции РНК-содержащих вирусов.

Отдиализованный раствор рибонуклеазы центрифугируют и пропускают через колонку с гранулированным активированным углем для удаления пирогенных примесей, затем раствор очищенной рибонуклеазы фильтруют через фильтр с размерами пор 0,22 микрон. Полученный раствор рибонуклеазы подвергают стерилизации, розливу и сушке методами, предусмотренными для лекарственных препаратов.

Существенными отличительными признаками предлагаемого способа получения биологически активных веществ являются:

- использование повышающейся концентрации сульфата аммония как приема, обеспечивающего селективное разделение всех четырех ферментов, содержащихся в сернокислотном экстракте ПЖ КРС после экстракции этанолом при (-18°С);

- применение для тонкой очистки рибонуклеазы панкреатической ультрафильтрации на полых волокнах и ионообменной хроматографии на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой.

Таким образом, нами предлагается новый подход, позволяющий осуществлять комплексную переработку поджелудочной железы крупного рогатого скота с получением четырех ферментов (холестеролэстеразы, трипсина, ДНК-азы и РНК-азы) высокой чистоты и удельной активности.

Отличие заявляемого способа от ближайших аналогов и прототипа состоит в следующем.

В заявляемом способе измельченную поджелудочную железу экстрагируют охлажденным до ((-18)-(+20)°С) этанолом, так как денатурирующее действие органических растворителей становится заметным уже при температуре (+10°С) и связано с изменением молекулярных гидрофобных взаимодействий, стабилизирующих структуру белка. При высоких температурах небольшие молекулы органического растворителя проникают через поверхностные «трещины», образующиеся спонтанно за счет естественной подвижности структуры, во внутренние участки белковой молекулы и дестабилизируют ее. Отсутствие денатурации при низких температурах обусловлено малой вероятностью того, что молекулы органического растворителя проникают во внутренние структуры белка и дестабилизируют их. Кроме того, экстракция поджелудочной железы этиловым спиртом позволяет осаждать целевые ферменты и переводить в экстракт низкомолекулярные вещества, тем самым проводится начальная стадия очистки целевых ферментов. В прототипе стадии осаждения белков из поджелудочной железы этиловым спиртом отсутствуют.

В прототипе раствор рибонуклеазы подвергался воздействию высоких температур в течение длительного времени (до +95°С). Использование высоких температур и агрессивных сред при получении рибонуклеазы в соответствующих аналогах приводит к низкому выходу целевого продукта и низкой его активности.

В соответствующем аналоге [Пат. РФ 2152995] при хроматографической очистке рибонуклеазы была использована агрессивная среда смеси щелочи со спиртом, которые могут привести к частичной и даже полной инактивации и денатурации фермента.

В заявляемом способе дробным сульфатаммонийным фракционированием было достигнуто разделение четырех продуктов (РНК-азы, ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы) из одной и той же порции поджелудочной железы. В прототипе было достигнуто разделение только трех ферментов (трипсина, химотрипсина и рибонуклеазы). Причем в заявляемом способе трипсин осаждался при 60-65% насыщении сульфатом аммония, а в прототипе высол был получен при 70% насыщении сульфатом аммония (Фиг.4).

В заявляемом способе на стадии очистки рибонуклеазы используют ультрафильтрацию на установке с полыми полимерными волокнами УПВ-6, укомплектованной колонками с размерами пор 50 кДа и 5 кДа. Ультрафильтрация позволяет легко очищать большие объемы экстракта, содержащего рибонуклеазу панкреатическую, от высокомолекулярных примесей и концентрировать ферментсодержащий раствор. В прототипе высол рибонуклеазы панкреатической растворяется в воде и подвергается обработке кизельгуром и фильтрации на воронке Бюхнера, а ультрафильтрация не используется.

На последней стадии очистки рибонуклеазы панкреатической в заявляемом способе диализат подвергают сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе с последующей элюцией градиентом солевого раствора хлорида натрия, при этом полученный раствор рибонуклеазы панкреатической подвергают диализу против 30±0,1 мМ Na-фосфатного буфера (рН 6,4±0,01) и инкубации против Na-фосфатного буфера при 40-44°С в течение 12 ч. Тем самым достигается полное отделение электрофоретически и хроматографически гомогенного мономерного целевого фермента от полимеров фермента и других белковых примесей. В соответствующем аналоге [Пат. РФ 2152995, С12N 9/22, 20.07.2000] фильтрат подвергают сорбции на изопористом макросетчатом сульфокатионите, являющемся сополимером полистирола и монохлордиэтилового эфира, при этом в качестве элюента используют этанол или изопропанол в 0,1-0,5 н. HCl. В прототипе очистку на ионообменной колонке не используют.

Пример 1.

1 кг измельченной поджелудочной железы крупного рогатого скота экстрагируют 1,2 л охлажденным до ((-18)-(+20)°С) этанолом в течение 50 мин при постоянном перемешивании, при этом белки переходят в осадок. Осадок с целевыми ферментами отделяют от спиртового раствора, содержащего спирторастворимые компоненты (основной компонент инсулин), центрифугированием при 13000 g в течение 20 мин при +5°С.

Осадок, полученный после обработки поджелудочной железы этанолом, экстрагируют при перемешивании в течение 60 мин при +5°С 2,5±0,1 мМ серной кислотой (рН 3±0,1), содержащей 5±0,01 мМ Mg⁺², в соотношении 1:8, соответственно. Экстракт центрифугируют при 13000 g в течение 20 мин при +5°С и в полученном экстракте определяют активность РНК-азы спектрофотометрическим методом при длине волны 260 нм.

Осаждения балластных белков.

Для отделения балластных белков полученный сернокислый экстракт насыщают сульфатом аммония до концентрации 30-35%.

К экстракту (V=915 мл) при +5°С добавляют 151,89 г сульфата аммония при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до полного растворения соли. Раствор белков оставляют на 1 ч в холодильнике и центрифугируют при 13000 g в течение 20 мин при температуре +5°С. Осадок отбрасывают и получают супернатант № 1.

Получение фермента холестеролэстеразы.

К полученному супернатанту № 1 (Фиг.3) (V=905 мл) добавляют сульфат аммония до 45-50% насыщения (79 г соли) (Фиг.4). Соль растворяют при +5°С, затем раствор помещают на 1 ч в холодильник для формирования осадка. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 13000 g в течение 20 мин при температуре +5°С. В результате этой процедуры осаждается холестеролэстераза. Супернатант-2, полученный при центрифугировании, используют на следующих стадиях выделения ферментов.

Для получения индивидуального фермента холестеролэстеразы осадок сырого фермента, полученный при 45-50% сульфатаммонийном осаждении, растворяют в минимальном объеме 100±0,1 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7±0,1). Раствор дотитровывают гидроокисью натрия (NaOH) до рН 7,3±0,01, добавляют холат натрия до концентрации 0,33 мг/мл и центрифугируют в течение 1 ч при 15000 g. Осадок отбрасывают, а супернатант, содержащий очищенную холестеролэстеразу, замораживают в морозильной камере при ((-18)-(+20)°С).

Таким образом, из 1 кг поджелудочной железы получают ˜3 г очищенного фермента холестеролэстеразы.

Таблица 1
Результаты выделения холестеролэстеразыФерментУдельная активность А_уд (ЕА/мг)Выход (г/кг)Суммарная активность ΣA (ЕА/кг)Холестеролэстераза2420 ЕА/мг3,17,5×10⁶

Получение фермента трипсина.

Супернатант № 2 (Фиг.3) далее насыщают сульфатом аммония до концентрации 60-65% (Фиг.4). Соль растворяют на магнитной мешалке до полного растворения. Полученный раствор помещают в холодильник на 2 ч для формирования осадка. Осадок отделяют центрифугированием при 13000 g 20 мин при температуре +5°С (супернатант № 3, полученный в ходе центрифугирования, используют для получения ферментов ДНК-азы и РНК-азы), разводят дистиллированной водой до полного растворения, а затем диализуют его против 10-кратного объема 2,5±0,1 мМ серной кислоты (рН 3-4). Диализ ведут в течение 12 ч при непрерывном перемешивании, меняя каждые 4 ч раствор серной кислоты в сборнике. Раствор после диализа центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин при +5°С и в полученном супернатанте определяют содержание трипсина.

Проанализированный супернатант, содержащий трипсин, замораживают до температуры ниже -50°С жидким азотом и направляют на лиофильную сушку. Таким образом, из 1 кг поджелудочной железы получают 1,8 г трипсина.

Таблица 2
Результаты выделения трипсинаФерментУдельная активность А_уд (ЕА/мг)Выход (г/кг)Суммарная активность ΣA (ЕА/кг)Трипсин12,0*1,82,16×10⁷** активность в тирозиновых единицах (ТЕ^HB_35,5 ⁰).

Получение фермента дезоксирибонуклеазы (ДНК-аза).

Супернатант № 3 (Фиг.3), полученный после 60-65% сульфатаммонийного насыщения, продолжают насыщать сульфатом аммония до 80-85% (Фиг.4). Соль растворяют на магнитной мешалке до полного растворения и оставляют в холодильнике на 3 ч для формирования осадка. Осадок, содержащий сырую ДНК-азу, отделяют центрифугированием (в супернатанте № 4 содержится фермент РНК-аза). Полученный осадок сырой ДНК-азы растворяют в 2,5±0,1 мМ серной кислоте (рН 3-4). Растворенный осадок диализуют против десятикратного объема 2,5±0,1 мМ серной кислоты (рН 3-4) при температуре +5°С в течение 15 ч, каждые 5 ч меняя раствор серной кислоты в сборнике. Выпавшие в результате диализа балластные белки удаляют центрифугированием при 13000 g в течение 40 мин при температуре +5°С. Супернатант анализируют на наличие ДНК-азы и пропускают через колонку (V=50 мл) с гранулированным активированным углем со скоростью прохождения раствора фермента 25 мл/ч. После очистки фермента на активированном угле полученный раствор лиофильно сушат. Чистоту препарата анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) (Фиг.5) [Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. - М.: Наука, 1985. - С.109-145; U.K.Laemmli, М.Favre. Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events. // J. Mol. Biol. - 1970. - Vol. 80. - P.575-599; C.Lee, A.Levin, D.Branton. // A. Biochem. - 1987. - Vol.166. - P.308-312].

На Фиг.5 представлен анализ дезоксирибонуклеазы в 10% ПААГ, полученной по предлагаемой технологии (3 и 5 дорожки), и препарата ОАО «Самсон-мед» (2 и 4 дорожки). 1 и 6 дорожки - маркеры: Human albumin (65 кДа), Ovalbumin (45 кДа) и Carbonic anhydrase (30 кДа).

В таблице 3 приведены основные характеристики процесса выделения и очистки фермента дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы).

Таблица 3
Характеристика процесса выделения дезоксирибонуклеазыСтадииΣм_белка (г)Выход по М_белка (%)А_уд (е.а./мг)Степень очисткиСуммарная активность ЕА(ЕА/кг)1. Экстракция спиртом и серной кислотой130,510061,518,025×10⁶2. Высаливание примесных белков (насыщение сульфатом аммония до 60%)11487,1592,21,51,05×10⁷3. Очистка от соли: диализ против серной кислоты43,1260042,31,04×10⁷4. Очистка фермента на активированном угле2,92,3250040,77,25×10⁶

Получение фермента рибонуклеазы (РНК-аза).

Супернатант № 4 (Фиг.3), содержащий фермент рибонуклеазу (РНК-азу), полученный после 80-85% высаливания сульфатом аммония, подвергают очистке методом ультрафильтрации на установках с полыми волокнами. Для проведения ультрафильтрации выбирают установку с полыми полимерными волокнами УПВ-6 укомплектованную колонками с размерами пор 50 кДа и 5 кДа. Принципиальная схема установки представлена на Фиг.6, где центробежный насос 1, предфильтр 2, колонка с размерами пор 50 кДа 3, колонка с размерами пор 5 кДа 4, фильтр РНК-азы 5, концентрированный раствор РНК-азы 6, фильтр, содержащий низкомолекулярные белки и сульфат аммония, 7.

Для очистки от высокомолекулярных примесей с молекулярной массой более 50 кДа супернатант № 4 пропускают через колонку с размером пор 50 кДа, а затем для концентрирования и очистки от избытка соли через колонку с размером пор 5 кДа.

В результате использования стадии ультрафильтрации на колонках с полыми волокнами был получен фермент рибонуклеаза панкреатическая с высокой удельной активностью и степенью очистки фермента. При этом удельная активность и степень очистки фермента увеличилась в 13 раз по сравнению с результатами, полученными на предыдущей стадии (см. таблицу 5).

Результаты отражены в таблице 4.

Таблица 4Основные характеристики фермента рибонуклеазы, полученной после процесса ультрафильтрацииСтадииΣм_белка (г/кг ПЖ)Выход по М_белка (%)А_уд (е.а./мг)Степень очисткиСуммарная активность ЕА (ЕА/кг)Очистка фермента на ультрафильтрационной установке22275000365,50×10⁸

Осаждение и диализ РНК-азы.

Раствор РНК-азы, полученный после ультрафильтрации, насыщают сульфатом аммония до конечной концентрации 95-98% (на 4 л концентрата 565 г сульфата аммония). Соль растворяют в течение 12 ч на механической мешалке при +5°С, а затем оставляют на 1,5 ч при +5°С для формирование осадка. Солевой раствор рибонуклеазы центрифугируют в течение 20 мин при 10000 g. Осадок № 4 (Фиг.3) растворяют в минимальном объеме 2,5±0,1 мМ серной кислоты (рН 3-4) в течение 2 ч на магнитной мешалке при интенсивном перемешивании.

Для удаления избытка сульфат-ионов полученный раствор рибонуклеазы диализуют против 2,5±0,1 мМ серной кислоты (рН 3-4). Диализ ведут в течение 12 ч при непрерывном перемешивании, меняя каждые 4 ч раствор серной кислоты в сборнике. Отдиализованный раствор центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин при +5°С. Полученный супернатант-5 хроматографируют на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.

Получение высокоочищенной рибонуклеазы панкреатической.

Колонку (V=50 мл) с ДЭАЭ-целлюлозой промывают 2 М раствором NaCl, затем уравновешивают 10±0,1 мМ раствором NaCl. Раствор белка в концентрации 6,5 мг/мл наносят на колонку и элюируют водным раствором NaCl в градиенте концентраций от 0,01-2 М NaCl (V=S-50 мл, R-50 мл). Оптимальная скорость элюции фермента V=50 мл составляет 25 мл/ч. В ходе всего процесса элюции отбирают пробы для анализа активности и чистоты рибонуклеазы в пиках, соответствующих белкам с разной молекулярной массой. Собирают пик, соответствующий белку с молекулярной массой ≈14 кДа (Фиг.1).

Молекулярный вес и чистоту белка определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). На Фиг.2 представлен анализ рибонуклеазы в 12,5% ПААГ, полученной по предлагаемой технологии (4 и 5 дорожки), и препарата ОАО «Самсон-мед» (2 и 3 дорожки). Дорожка 1 - маркеры. Дорожки 6 и 7 - рибонуклеаза, полученная с использованием диализа против NaP-буфера (рН 6,4).

Очищенный раствор фермента упаривают на ротационном испарителе при 45-55°С до концентрации белка 6-7 мг/мл, диализуют против 30±0,1 мМ Na-фосфатного буфера (рН 6,4±0,01). Диализ ведут при непрерывном перемешивании в течение 6 ч, заменяя каждые 2 ч Na-фосфатный буфер в сборнике. Раствор, отдиализованный против Na-фосфатного буфера, инкубируют при 40-44°С в течение 12 ч. Затем полученный после диализа и инкубации раствор центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин при +5°С и пропускают через колонку (V=50 мл) с гранулированным активированным углем. Скорость прохождения раствора фермента через колонку 25 мл/ч. Раствор фермента замораживают до температуры ниже -50°С и лиофильно высушивают. В таблице 5 приведены основные характеристики процесса выделения рибонуклеазы панкреатической (РНК-азы).

Таблица 5Основные характеристики процесса выделения фермента рибонуклеазыСтадииΣм_белка (г/кг ПЖ)Выход по М_белка (%)А_уд ^* (е.а./мг)Степень очисткиСуммарная активность ЕА (ЕА/кг)1. Экстракция спиртом и серной кислотой130,5100755019,85×10⁸2. Высаливание примесных белков (насыщение сульфатом аммония до 60%)11487115131,51,31×10⁹3. Высаливание ДНК-азы, насыщение раствора с.а. до 80%64,550210802,81,36×10⁹4. Очистка фермента на ультрафильтрационной установке22275000365,50×10⁸5. Очистка фермента на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой и активированном угле1,150,960000079,46,90×10⁸*Удельную активность проверяют на ΣPHK, обогащенной высокополимерной фракцией, полученной по методу [SU 1197462, 1982].Таблица 6Выходы и активности ферментов, выделяемых по предлагаемому подходуФерментВыход (г/кг)Суммарная активность ЕА(ЕА/кг)Рибонуклеаза1,156,9×10⁸Дезоксирибонуклеаза2,97,25×10⁶Холестеролэстераза3,17,5×10⁶трипсин1,82,16×10^7** - активность в тирозиновых единицах (ТЕ^HB 35,5⁰).

Таблица 7Сравнение удельных активностей ферментов, полученных по разработанной технологии, с ферментами, полученными по аналогичным технологиямФерментыРНК-азаДНК-азаТрипсинХолестеролэстеразаСоответствующие аналоги17500* ЕА/мг1700 ЕА/мг8,0 ЕА/мг^**1900 ЕА/мгПрепарат, полученный по разработанной технологии36800* ЕА/мг2500 ЕА/мг12,0 ЕА/мг^**2420 ЕА/мг* - активность проверена на высокополимерной дрожжевой РНК фирмы «SIGMA». Сравнение проводят с ферментом, выделенным по способу [Пат. РФ 2152995, С12N 9/22, 20.07.2000].** - активность в тирозиновых единицах (ТЕ^HB_35,5 ⁰).

В таблице 8 приводятся данные по стадиям получения рибонуклеазы панкреатической в аналоге и прототипе в сравнение с заявляемым способом.

Таблица 8Сравнительные данные по способам получения рибонуклеазыПрототипАналогПредлагаемый способ1. Экстракция измельченной поджелудочной железы раствором серной кислоты.1. Экстракция измельченной поджелудочной железы раствором серной кислоты.1. Осаждение белков из измельченной поджелудочной железы охлажденным до -18-20°С этиловым спиртом.2. Фракционирование РНК-азы, трипсина и химотрипсина из экстракта солями сульфата аммония.2. Получение высола РНК-азы путем насыщения сернокислого экстракта поджелудочной железы солями сульфата аммония.2. Экстракция РНК-азы, ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы из спиртового осадка раствором серной кислоты после отделения инсулина.3. Растворение высола РНК-азы в воде, обработка кизельгуром и фильтрация.3. Растворение полученного высола РНК-азы в 0,1 М ацетатном буферном растворе.3. Фракционирование РНК-азы и сопутствующих ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы солями сульфата аммония.4. Повышение рН раствора с 2,5 до 7,0 добавлением 1М NaOH.4. Фильтрация буферного раствора РНК-азы.4. Ультрафильтрационная очистка.5. Быстрое снижение рН до 4,8 добавлением 1 М серной кислоты.5. Нанесение полученного раствора РНК-азы в буфере на ионообменную колонку при рН 4,5-6,5.5. Осаждение и диализ фермента рибонуклеазы.6. Осаждение РНК-азы из полученного раствора насыщением сульфатом аммония до 25-30%.6. Элюция фермента с колонки водно-спиртовым раствором при рН 2-3.6. Очистка на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.7. Растворение полученного осадка в воде.7. Подщелачивание полученной фракции РНК-азы 1 М NaOH.7. Диализ и упаривание на ротационном испарителе.8. Нагрев водного раствора фермента до температуры 95-97°С.8. Осаждение фермента этанолом.8. Очистка на колонке с гранулированным активированным углем и лиофильная сушка.9. Охлаждение водного раствора фермента до комнатной температуры.9. Растворение осадка рибонуклеазы и сушка. 10. Фильтрация полученного раствора РНК-азы, диализ и сушка.  Количество фермента, получаемого с 1 кг поджелудочной железы0,047 г0,194 г1,15 гУдельная активность препарата (ЕА/мг)7000-100001750036800

Главными особенностями нашего подхода являются:

- использование повышающейся концентрации сульфата аммония как приема, обеспечивающего селективное разделение всех четырех ферментов, содержащихся в сернокислотном экстракте ПЖ КРС после экстракции этанолом при (-18°С);

- применение для тонкой очистки РНК-азы ультрафильтрации на полых волокнах и ионообменной хроматографии на колонках с ДЭАЭ-целлюлозой.

Предлагаемый способ позволяет:

получать четыре фермента (рибонуклеазу панкреатическую, дезоксирибонуклеазу, трипсин и холестеролэстеразу) из поджелудочной железы в рамках единой технологической схемы;

более чем в 2 раза увеличить выход препарата рибонуклеазы панкреатической и более чем в 3 раза повысить ее удельную активность по сравнению с прототипом;

снизить количество стадий технологического процесса;

уменьшить список используемых реактивов.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в производстве медицинских препаратов - рибонуклеазы панкреатической, дезоксирибонуклеазы панкреатической, трипсина, а также холестеролэстеразы. Способ предусматривает измельчение поджелудочной железы крупного рогатого скота, ее гомогенизацию. Полученный гомогенат экстрагируют охлажденным этиловым спиртом при постоянном перемешивании. Центрифугируют. Проводят повторную экстракцию серной кислотой, содержащей сульфат магния, при постоянном перемешивании. Экстракт, содержащий целевые ферменты, отделяют от осадка центрифугированием. Балластные белки осаждают сульфатом аммония при 30-35%-ном насыщении и удаляют центрифугированием из супернатанта. Холестеролэстеразу осаждают сульфатом аммония при 45-50% насыщении экстракта, трипсин осаждают при 60-65% насыщении, дезоксирибонуклеазу (ДНК-аза) осаждают при 80-85% насыщении. Полученный при осаждении ДНК-азы супернатант, содержащий рибонуклеазу, подвергают ультрафильтрации и осаждению сернокислым аммонием при 95-98% насыщении с последующим диализом и хроматографической очисткой на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Изобретение позволяет получать четыре фермента из поджелудочной железы в рамках единой технологической схемы, увеличить выход рибонуклеазы панкреатической, увеличить ее удельную активность. 4 з.п. ф-лы, 8 табл., 6 ил.

1. Способ получения холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклезы панкреатической из поджелудочной железы крупного рогатого скота, предусматривающий измельчение поджелудочной железы крупного рогатого скота, ее гомогенизацию, экстракцию охлажденным этиловым спиртом, центрифугирование, повторную экстракцию серной кислотой, содержащей сульфат магния, центрифугирование, осаждение балластных белков сульфатом аммония при 30-35%-ном насыщении, центрифугирование, осаждение холестеролэстеразы сульфатом аммония при 45-50% насыщении экстракта, осаждение трипсина - при 60-65% насыщении, осаждение дезоксирибонуклеазы - при 80-85% насыщении, причем полученный при осаждении ДНК-азы супернатант, содержащий рибонуклеазу, подвергают ультрафильтрации и осаждению сернокислым аммонием при 95-98% насыщении с последующим диализом и хроматографической очисткой на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гомогенат экстрагируют холодным этиловым спиртом ((-18)-(+20)°С) в соотношении 1:1,5.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию поджелудочной железы проводят 2,5±0,1 мМ раствором серной кислоты, содержащим 5±0,01 мМ сульфата магния в соотношении 1:4-1:8.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что рибонуклеазу панкреатическую подвергают диализу против 30±0,1 мМ Na-фосфатного буфера (рН 6,4±0,01) и инкубации против Na-фосфатного буфера при 40-44°С.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что после диализа рибонуклеазу панкреатическую стерильно фильтруют и осуществляют лиофильную сушку.