N-2-(4-НИТРОФЕНИЛСУЛЬФОНИЛ)ЭТОКСИКАРБОНИЛАМИНОКИСЛОТЫ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2000 года по МПК C07C317/18 C07K1/06 

Изобретение относится к области новых защищенных аминокислотных производных, используемых для синтеза пептидов, а именно, N_α- 2-(4- нитрофенилсульфонил)этоксикарбониламинокислотам, имеющим общую формулу I

где R₁ представляет собой водород, и R₂ может представлять гидроксиметил, 1-гидроксиэтил, 4-гидроксибензил, имидазолил-2-метил, бензилоксиметил, 1-бензилоксиэтил, 4-бензилоксибензил, бензилоксикарбонилметил, 2-(бензилоксикарбонил) этил, S-бензилтиометил, S-(дифенилметил)тиометил, 4-(бензилоксикарбамидо) бутил, 3-гуанидинопропил, 3-(N^G-толуолсульфонил)- гуанидинопропил, 3-(N^G-нитpo)гуaнидинoпpoпил, 3-[N^G-(4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил)] гуанидинопропил, N-(4,4'-диметоксибензгидрил)карбоксамидометил, 2-[N-(4,4'-диметоксибензгидрил)карбоксамидо] этил, S-трет-бутилдитиометил, 4-[2-(4- нитрофенилсульфонил)этоксикарбамидо]бутил, пропил, бутил, этил, 3-(бензилоксикарбамидо)пропил или 3-(трет- бутоксикарбамидо) пропил, и к способам их получения.

N_α- 2-(4-Нитрофенилсульфонил)этоксикарбониламинокислоты (Nsc-аминокислоты) I представляют класс защищенных аминокислотных производных, используемых в химическом синтезе пептидов. В этих производных N_α- 2-(4-нитрофенилсульфонил)- этоксикарбонильная (Nsc) группа служит в качестве временной N_α- защиты, которую можно селективно удалять после каждой стадии удлинения пептидной цепи. Nsc-группа является достаточно стойкой к кислотным реагентам и расщепляется в соответствии с механизмом β- элиминирования под действием органических оснований в апротонных растворителях. Мягкие условия расщепления позволяют использовать временную N_α- Nsc-защиту при синтезе пептидов вместе с защитой чувствительной к кислотам боковой цепи широко используемых трет-бутильного или бензильного типа, обеспечивая таким образом так называемую "ортогональность" направления синтеза.

Недавно в международной публикации N WО 96/25394 были описаны N_α- Nsc-аминокислоты, способы их получения и их использование в твердофазном синтезе пептидов. Однако был описан лишь минимальный ряд N_α- Nsc-производных протеогенных аминокислот, предназначенный для твердофазного пептидного синтеза с полной защитой боковой цепи кислотно-неустойчивового трет-бутильного или совместимого типа.

В связи с этим желательно разработать новые N_α- Nsc-аминокислоты для расширения арсенала производных для использования в твердофазном синтезе. С другой стороны, нужно обеспечить N_α- Nsc- аминокислотные производные другим типом боковой защиты (например, бензилсовместимым) или без боковой защиты, что может дать новые возможности для жидкофазного синтеза пептидов.

Объектом изобретения являются новые производные N_α- Nsc-аминокислот, более конкретно, N_α- 2- (нитрофенилсульфонил)-этоксикарбониламинокислот общей формулы I:

где R₁ представляет атом водорода, и R₂ может представлять гидроксиметил, 1-гидроксиэтил, 4-гидроксибензил, имидазолил-2- метил, бензилоксиметил, 1-бензилоксиэтил, 4-бензилоксибензил, бензилоксикарбонилметил, 2-(бензилоксикарбонил) этил, S-бензилтиометил, S-(дифенилметил)тиометил, 4-(бензилоксикарбамидо) бутил, 3-гуанидинопропил, 3-(N^G-толуолсульфонил)гуанидинопропил, 3-(N^G-нитро)гуанидинопропил, 3-[N^G-(4- метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил)] гуанидинопропил, N- (4,4'-диметоксибензгидрил)карбоксамидометил, 2-[N-(4,4'- димeтoкcибeнзгидpил)кapбoкcaмидo] этил, S-трет-бутилдитиометил, 4-[2-(4-нитpoфeнилcульфoнил)этoкcикapбaмидo]-бутил, пропил, бутил, этил, 3-(бензилоксикарбамидо)пропил или 3- (трет-бутоксикарбамидо) пропил, которые можно использовать как N_α-защищенные аминокислотные производные в синтезе пептидов.

Другим объектом изобретения являются способы получения указанных N_α-Nsc-аминокислот. Эти и другие объекты изобретения будут понятны из следующего описания.

N_α- Nsc-аминокислоты по изобретению (I) могут быть получены путем обработки аминокислот общей формулы II, где R₁ и R₂ имеют значения, указанные для формулы I, с 2-(4- нитрофенилсульфонил)этилхлорформиатом III в смешанном водно/органическом растворителе в присутствии основания при температуре от 0 до 40^oC, предпочтительно от 0 до 20^oC (Схема 1)

Хлорформиат III вводят в реакцию в качестве от 0,5 до 1,5 мольных эквивалентов, предпочтительно от 0,7 до 0,9 по отношению к аминокислоте. В качестве органического компонента растворителя можно использовать любой апротонный органический растворитель, способный растворять ацилирующий реагент и смешивающийся с водой, например ацетонитрил, ДМФ, тетрагидрофуран или диоксан. Основанием может быть органическое или неорганическое основание, например карбонат натрия или калия, оксид магния или кальция, триэтиламин, N-метилморфолин.

В соответствии с другим способом по настоящему изобретению аминокислоты общей формулы II сначала преобразуют в N,O-триметилсилил производные, при помощи способов, известных из уровня техники, а затем обрабатывают эквивалентным количеством хлорформиата III в безводном органическом растворителе, например, дихлорметане, в присутствии основания, например третичного амина. После водного гидролиза промежуточных ацилированных триметилсилильных производных получают желаемые N_α-Nsc-аминокислоты I в свободном виде.

Производные формулы I, где R₁ является водородом, a R₂ представляет N-(4,4'- диметоксибензгидрил)карбоксамидометил или 2-[N-(4,4'- диметоксибензгидрил)карбоксамидо]-этил, можно получить путем взаимодействия известных производных I, где R₁ является водородом, a R₂ представляет карбоксамидометил или 2-(карбоксамидо) этил, с 4,4'-диметоксибензгидролом в органическом растворителе в присутствии сильной кислоты. В качестве растворителя можно использовать уксусную кислоту, а в качестве сильной кислоты - серную или метансульфоновую кислоту.

Производное формулы I, где R₁ является водородом, а R₂ представляет 3-гуанилинопропил N_α-Nsc-Arg-OH), можно получить путем взаимодействия аргинина с 2- (4-нитрофенилтио)-этилхлорформатом в воде в присутствии бикарбоната натрия, образующийся N_α-2-(4-нитрофенилтио)этоксикарбониларгинин затем окисляют пероксидом водорода в органическом растворителе, например в этаноле или уксусной кислоте, и получают желаемый N_α-Nsc-аргинин.

Производное формулы I, где R₁ является водородом, а R₂ представляет имидазолил-2-метил N_α-Nsc-His-OH), можно получить из производного, N_α-Nsc-N_im-защищенного гистидина путем селективного удаления защиты имидазольного кольца, например, путем селективного кислотного детритилирования известного N_α-Nsc-N_im-трианилметилгистидина.

Из молекулярной формулы видно, что соединения I имеют асимметричный α-углеродный атом. Поскольку α-углеродный атом не участвует в реакциях, используемых для получения соединений I, конфигурация такого хирального центра, который существует в исходных аминокислотах II, сохраняется в полученных N_α-Nsc-производных I. Поэтому очевидно, что способы по настоящему изобретению можно использовать для получения N_α-Nsc-аминокислот I в любой хиральной форме (L или D), а также рацемических соединений, в зависимости от конфигурации соединения II.

Значения заместителей R₁ и R₂ производных формулы в соответствии с изобретением соответствуют структурам боковых цепей известных α-аминокислот, содержащих или не содержащих защитные группы, известные из уровня техники (таблица 1).

Вместе с N_α-Nsc-аминокислотами, описанными в Международной публикации N WО 96/25394, можно использовать соединения формулы I, представленные в таблице 1, для осуществления широкого разнообразия тактических подходов к синтезу пептидов, включающих не только твердофазный синтез, но также синтезы в растворе. С использованием Nsc-защиты теперь возможно разработать схемы синтеза пептидной группы в растворе на основе трет-бутилового типа или бензилового типа или смешанного типа защиты боковой цепи, а также применять тактику минимальной защиты боковой цепи.

Настоящее изобретение поэтому считается дополнением и продолжением упомянутой выше Международной Публикации N WO 96/25394.

Далее изобретение описывается с помощью примеров, которые приведены в качестве иллюстрации и не являются ограничивающими изобретение. Все аминокислоты в следующем далее описании имеют L-конфигурацию, если не указано иное.

Пример 1
N_α-Nsc-O-Бензил-тирозин (1-7)
8,15 г O-Бензил-тирозина и 7,7 г карбоната калия растворяли в 150 мл смеси вода-диоксан (3:1, об/об) и охлаждали на ледяной бане, затем при перемешивании в течение 15 мин добавляли по каплям раствор 7,5 г 2-(4-нитрофенилсульфонил)этилхлорформиата III в 70 мл диоксана. Ледяную баню удаляли и смесь перемешивали еще 20 мин, затем выпаривали до приблизительно 100 мл при пониженном давлении и помещали в делительную воронку. Добавляли 100 мл воды и полученный раствор экстрагировали 2х50 мл этилацетата. Водный слой отделяли, ацилировали до pH 2 с помощью 40%-ной серной кислоты с охлаждением на ледяной бане, затем экстрагировали этилацетатом (3х80 мл). Объединенные экстракты сушили над безводным сульфатом натрия и выпаривали при пониженном давлении. Перекристаллизация остатка из этилацетата-гексана дала целевой продукт 1-7 в виде белого кристаллического порошка (70%). Характеристики см. в таблице 2 (пример 7).

Пример 2
N_α-Nsc-Треонин (1-2).

3,58 г Треонина и 100 мл безводного дихлорметана помещали в 250 мл круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником и капельной воронкой. К суспензии добавляли 9,7 мл хлортриметилсилана при энергичном перемешивании и смесь нагревали до кипения в течение 1 часа. Полученный раствор охлаждали на ледяной бане, затем добавляли при перемешивании 9,0 мл триэтиламина и 9,0 г хлорформиата III. Смесь перемешивали в течение 20 мин на ледяной бане, затем еще в течение 1,5 часа при комнатной температуре. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и остаток распределяли между 200 мл этилацетата и 250 мл 2,5%-ного водного раствора бикарбоната натрия. Водный слой отделяли, промывали 50 мл эфира, ацилировали до pH 1 н. хлороводородной кислотой, затем экстрагировали этилацетатом (3х70 мл). Объединенные экстракты сушили над безводным сульфатом натрия и выпаривали при пониженном давлении. Растирание в порошок остатка с петролейным эфиром давало целевой продукт 1-2 в виде белого порошка (75%). Характеристики см. в таблице 2 (пример 7).

Пример 3
N_α-Nsc-N_δ- Бензилоксикарбонил-орнитин (1-24)
8,0 г N_δ-бензилоксикарбонил-орнитина и 120 мл безводного дихлорметана помещали в 250 мл круглодонную колбу, снабженную обратным холодильником и капельной воронкой. К смеси добавляли при энергичном перемешивании 12,7 мл триэтиламина и затем 7 мл хлортриметилсилана и смесь нагревали до кипения в течение 1,5 часа. Реакционную смесь затем охлаждали на ледяной бане, сразу добавляли 9,0 г хлороформиата III и перемешивание продолжали в течение 1,5 часа при комнатной температуре. Растворитель выпаривали при пониженном давлении и остаток разделяли между 250 мл этилацетата и 250 мл 2,5%-ного водного раствора бикарбоната натрия. Водный слой отделяли, промывали 50 мл эфира, ацилировали до pH 2 1н. хлороводородной кислотой затем экстрагировали этилацетатом (2х100 мл). Объединенные экстракты сушили с безводным сульфатом натрия и выпаривали при пониженном давлении. Перекристаллизация остатка из этилацетата-гексана дала целевой продукт 1-24 в виде белого порошка (84%). Характеристики см. в таблице 2 (пример 7).

Пример 4
N_α- Nsc-N(4,4'-Диметоксибензгидрил)-аспарагин (1-17)
3,89 г N_α-Nsc-аспарагина и 2,6 4,4'-диметоксибензгидрола растворяли в 25 мл ледяной уксусной кислоты. К раствору добавляли 0,4 мл метансульфоновой кислоты и смесь выдерживали в течение ночи при комнатной температуре. Полученную смесь затем выливали в 100 мл ледяной холодной воды при перемешивании, образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали водой, а затем эфиром. Неочищенный продукт растворяли в 10 мл теплого ДМФ, фильтровали и снова осаждали эфиром. Осадок собирали фильтрацией, промывали эфиром и высушивали в вакууме. Получали целевой продукт 1-17 в виде кристаллического порошка (80%). Характеристики см. в таблице 2 (пример 7).

Пример 5
N_α-Nsc-Аргинин (1-13)
К раствору 1,7 г бикарбоната натрия и 4,22 г гидрохлорида аргинина в 25 мл воды, который перемешивали при комнатной температуре, добавляли 5,74 г 2-(4-нитрофенилтио) этилхлорформиата пятью равными порциями в течение 30 минут, затем перемешивание продолжали еще 2 часа. Смесь затем омыляли до pH 8,5 концентрированным раствором аммиака и оставляли на 3 часа при 4^oC. Образовавшийся осадок собирали, промывали ледяной холодной водой, сушили на фильтре с отсосом и растворяли в 30 мл уксусной кислоты. К раствору добавляли 4 мл 34%-ной пероксида водорода и смесь оставляли стоять при комнатной температуре в течение 30 часов. Затем смесь выпаривали до сухости и осадок растирали в порошок с этилацетатом, собирали фильтрованием, промывали эфиром и высушивали на воздухе. Получали целевой продукт 1-13 (88%). Характеристики см. в таблице 2 (пример 7).

Пример 6
N_α-Nsc-Гистидин (1-3)
6,6 г N_α-Nsc-N_im-Трифенилметил-гистидина растворяли в 30 мл 90%-ного водного раствора уксусной кислоты и кипятили с обратным холодильником в течение 30 минут. После охлаждения осадок отфильтровывали и фильтрат выпаривали. Остаток растирали в порошок с эфиром и собирали фильтрованием. Получали целевой продукт 1-4 с 95%-ным выходом. Характеристики см. в таблице 2 (пример 7).

Пример 7
Свойства N_α-Nsc-аминокислот 1.

В таблице 2 представлены соединения формулы I, которые были получены с использованием способов по изобретению, подробно описанных в примерах 1-6. Цифры в графе "Способ" соответствуют номерам примеров, в которых описываются эти способы. Значения хроматографической подвижности R_f указаны для слоев тонкослойной хроматографии Alufolien Keaelgel 60 F₂₅₄ (Merck, Darmsradt, Germany); хлороформ/метанол/уксусную кислоту, 95:5:3, (A) и бензол/ацетон/уксусную кислоту, 100:50:3, (B) использовали в качестве проявляющих растворителей, пятна детектировали методом УФ-абсорбции и/или реакцией нингидрина. Молекулярные массы ионов (M+H)⁺ измеряли с помощью время-пролетного масс-спектрометра MS-BC-1 с Cf²⁵² радиационно-промотированной десорбцией (Electrom SPA, Sumy, Ukraine).

Описываются новые защищенные аминокислотные производные общей формулы I, где R₁ - атом водорода, R₂ - гидроксиметил, 1-гидроксиэтил, 4-гидроксибензил, имидазолил-2-метил, бензилоксиметил, 1-бензилоксиэтил, 4-бензилоксибензил, бензилоксикарбонилметил, 2-(бензилоксикарбонил)-этил, S-бензилтиометил, S-(дифенилметил)тиометил, 4-(бензилоксикарбамидо)бутил, 3-гуанидинопропил, 3-(N^G-толуолсульфонил)гуанидинопропил, 3-(N^G-нитро)гуанидинопропил,3-/N^G-(4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил)/-гуанидинопропил, N-(4,4-диметоксибензгидрил)карбоксамидометил, 2-/N-(4,4-диметоксибензгидрил)карбоксамидо/этил, S-трет-бутилдитиометил, 4-/2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбамидо/-бутил, пропил, бутил, этил, 3-(бензилоксикарбамидо)пропил или 3-(трет-бутоксикарбамидо)пропил. Они используются для синтеза пептидов. Описывается также способ их получения. 5 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбониламинокислота общей формулы (I)

где R₁ - атом водорода;
R₂ - гидроксиметил, 1-гидроксиэтил, 4-гидроксибензил, имидазолил-2-метил, бензилоксиметил, 1-бензилоксиэтил, 4-бензилоксибензил, бензилоксикарбонилметил, 2-(бензилоксикарбонил)-этил, S-бензилтиометил, S-(дифенилметил)тиометил, 4-(бензилоксикарбамидо)бутил, 3-гуанидинопрпил, 3-(N^G-толуолсульфонил) гуанидинопропил, 3-(N^G-нитро)гуанидинопропил, 3-[N^G-(4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил)] гуанидинопропил, N-(4,4'-диметоксибензгидрил)карбоксамидометил, 2-[N-(4,4'-диметоксибензгидрил)карбоксамидо] этил, S-трет-бутилдитиометил, 4-[2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбамидо] бутил, пропил, бутил, этил, 3-(бензилоксикарбамидо)пропил или 3-(трет-бутоксикарбамидо)пропил. 2. Способ получения N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)-этоксикарбониламинокислоты общей формулы I по п.1, заключающийся в том, что аминокислоту общей формулы (II)
HNR₁-CHR₂-COOH,
где R₁ и R₂ имеют значения, указанные в п.1,
подвергают взаимодействию с 2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонилхлорформиатом формулы III

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что аминокислоту общей формулы (II)
HNR₁-CHR₂-COOH,
где R₁ и R₂ указаны в п.1,
предварительно преобразовывают в ее O, N - триметилсилилированное производное и затем подвергают взаимодействию с 2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонилхлорформиатом. 4. Способ получения N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбониламинокислоты общей формулы I по п.1, где R₁ - атом водорода и R₂ - N-(4,4'-диметоксибензгидрил)карбоксамидометил или 2-[N-(4,4'-диметоксибензгидрил)карбоксамидо этил, заключающийся в том, что N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонил-аспарагин или N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонил-глутамин подвергают взаимодействию с 4,4'-диметоксибензгидролом в органическом растворителе в присутствии кислоты. 5. Способ получения N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбониламинокислоты общей формулы I по п.1, где R₁ - атом водорода и R₂ - 3-гуанидинопропил, заключающийся в том, что аргинин подвергают взаимодействию с 2-(4-нитрофенилтио)этилхлорформиатом в воде в присутствии бикарбоната натрия с окислением полученного таким образом N_α-2-(4-нитрофенилтио)-этоксикарбонил-аргигина пероксидом водорода в органическом растворителе. 6. Способ получения N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбониламинокислоты общей формулы I по п.1, где R₁ - атом водорода и R₂ - имидазол-2-метил, заключающийся в том, что N_α-2-(4-нитрофенилсульфонил)этоксикарбонил-N_im-трифенилметил-гистидин подвергают взаимодействию с кислотой.