СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И КОРРЕКЦИИ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ТОКСИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/21 A61P37/02 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к профилактике профессиональных патологий, и может быть использовано для коррекции возникающих нарушений здоровья у лиц, контактирующих с токсическими веществами.

Исследованиями последних лет установлено, что при контакте человека с химическими веществами, обладающими гепатотоксическими и нейротоксическим эффектами, развиваются нарушения различной степени выраженности не только со стороны печени и нервной системы, но и со стороны иммунной системы. При длительном воздействии токсикантов формируется иммунная недостаточность, которая проявляется частыми вирусными инфекциями, воспалительными и другими заболеваниями.

Для профилактики вредного действия токсических соединений и нивелирования развивающихся нарушений со стороны органов-мишеней и организма в целом необходим тщательный выбор лекарственных средств, которые в условиях высокой экзогенной нагрузки химическими веществами не вызывали бы негативных и побочных реакций, а также не создавали бы дополнительной антигенной нагрузки.

Эффективность профилактики и коррекции иммунных нарушений лекарственными средствами зависит, в первую очередь, от правильного подбора иммунных препаратов, что в настоящее время затруднено наличием огромного арсенала современных средств того же назначения, но в каждом конкретном случае отличающихся эффективностью, а в ряде случаев не дающих эффекта.

Выбор лекарственного средства определяется врачом в соответствии с субъективным мнением, опытом и компетентностью. На практике зачастую это приводит к необходимости неоднократного подбора препаратов и назначения новых, как правило, длительных курсов терапии.

Для решения этой проблемы и своевременной коррекции тактики лечения актуально наиболее раннее получение информации об иммунном ответе организма пациента.

Известны способы профилактики и коррекции нарушений, вызываемых токсическими веществами, основанные на применении детоксицирующих средств, средств симптоматической терапии, а также средств для нормализации функций иммунитета.

Из арсенала средств, нормализующих состояние иммунитета, в последние годы в клинической практике нашел широкое применение лекарственный препарат - циклоферон, занимающий одно из первых мест по уровню безвредности, переносимости и диапазону обнаруженных эффектов, основными из которых являются противовирусный, противовоспалительный и иммунокорригирующий (Романцов М.Г., Ершов Ф.И., Коваленко А.Л., Голубев С.Ю. Иммунодефицитные состояния: коррекция циклофероном / Руководство для врачей. - СПб., 1998, 80 с.).

Применение циклоферона для профилактики и коррекции нарушений, вызванных длительным или регулярным контактом с токсическими веществами, не известно, но представляется перспективным.

Однако достижение эффекта от применения циклоферона, также как и от других препаратов, возможно только при условии наличия индивидуальной чувствительности и позитивной реакции на него.

Для повышения эффективности профилактики и лечения различных заболеваний в ряде случаев определяют индивидуальную чувствительность пациентов к отдельным препаратам до начала лечения.

Это достигается путем проведения тестовых проб или определения индивидуальной реакции пациента на препарат in vitro.

Например, при онкологических заболеваниях определение индивидуальной реакции больного на фетальный протеин осуществляют до начала лечения in vitro, определяют соотношение численности CD8⁺ и CD4⁺ - лимфоцитов и при превышении количества CD8⁺-лимфоцитов на 15% и более по сравнению с CD4⁺-лимфоцитами начинают лечение (RU 2118819 C1).

Известно также определение индивидуальной реакции больного на циклоферон до начала лечения данным препаратом у больных хроническими диффузными заболеваниями печени.

За прототип предлагаемого способа профилактики и коррекции иммунных нарушений, вызываемых токсическими веществами, выбран способ, включающий введение иммуностимулятора при определенных иммунных показателях (Дидковский Н.А. и др. Принципы иммонокорригирующей терапии вторичных иммунодифицитов, ассоциированных с хронической вирусно-бактериальной инфекцией // Русский медицинский журнал. - 2992, Т.19, 21. - С.973-978, он-лайн, (найдено в Интернет на http:rmj.ru/articles 1115.hmt) 19.09.2008).

В данном способе определяют индивидуальную чувствительность к циклоферону не до лечения, а после начала терапии.

Кроме того, в данном способе критерии динамики иммунных показателей крови не представлены количественными параметрами, что оставляет место для субъективной трактовки полученной информации.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности профилактики и коррекции иммунных нарушений за счет наиболее раннего получения и более точной информации об иммунном ответе организма пациента на неспецифическую терапию.

Поставленная задача достигается тем, что в способе профилактики и коррекции нарушений, вызываемых токсическими веществами, включающем введение иммуностимулятора при определенных иммунных показателях, в качестве иммуностимулятора вводят циклоферон, до введения определяют индивидуальную реакцию на циклоферон путем инкубации in vitro с циклофероном мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациента, и циклоферон вводят при превышении количества CD19⁺-клеток - В-лимфоцитов более чем на 20% и активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток более чем на 15%.

Сущность изобретения состоит в том, что для профилактики и коррекции иммунных нарушений, вызываемых токсическими веществами, применяют препарат циклоферон.

Показаниями к применению циклоферона считают наличие у пациента чувствительности к препарату и позитивной реакции на него, которая проявляется в виде положительной динамики иммунных показателей крови под воздействием препарата. Динамику иммунных показателей крови определяют по изменению количества В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток и активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток in vitro путем инкубации мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациента, с циклофероном.

Повышение количества В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток на 20% и более, а активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток на 15% и более по сравнению с исходной величиной считают необходимым и достаточным условием для начала применения циклоферона в качестве иммунокорригирующего средства, включаемого в комплекс профилактических лечебных средств.

Предлагаемый способ является новым, так как для решения поставленной задачи предлагаемое техническое решение ранее не применялось, о чем свидетельствуют результаты проведенных патентно-информационных исследований.

Научно-технический уровень предлагаемого изобретения определяется неочевидностью технического решения. Для выработки критериев оценки чувствительности пациента к препарату потребовалось проведение научно-лабораторных и клинических исследований.

Лабораторные исследования проводились следующим образом.

В стерильных условиях производился забор крови (3 мл) из вены в центрифужную пробирку с гепарином (20 ед. гепарина на 1 мл крови). Кровь смешивали равным объемом фосфатно-забуференного физиологического раствора 0,1 М рН 7,2-7,4 (ФЗФР) и наслаивали на градиент плотности фиколл-верографин (d=1, 077 г/л). Центрифугировали в течение 30 мин при 400 g, затем собирали слой мононуклеарных клеток, переносили их в другую центрифужную пробирку, добавляли ФЗФР до 10 мл и центрифугировали в течение 10 мин при 200 g. Процедуру отмывания клеток повторяли, сливая над осадочную жидкость и добавляя новую порцию ФЗФР. Надосадочную жидкость тщательно удаляли, выделенные мононуклеарные клетки доводили ФЗФР до концентрации 1-1,5·10⁶/мл. В пробирку вносили 100 мкл взвеси клеток, смешивали с равным объемом раствора циклоферона (в концентрации 500 мкг/мл) и инкубировали в течение 60 мин при Т 37°C. Мононуклеарные клетки отмывали, добавляя ФЗФР до 10 мл и центрифугируя в течение 10 мин при 200 g. Надосадочную жидкость тщательно удаляли, клетки ресуспензировали в ФЗФР.

На чистые обезжиренные предметные стекла с лунками наносили по 10 мкл раствора поли-L-лизина и высушивали, инкубируя в течение 30 мин при Т 37°С. В 2 лунки вносили по 10 мкл клеточной суспензии интактных мононуклеарных клеток, в другие 2 лунки - по 10 мкл клеточной суспензии после нагрузки циклофероном, стекла высушивали, инкубируя в течение 40-90 мин при Т 37°С.

Высушенные предметные стекла фиксировали в холодном ацетоне в течение 1,5 мин, споласкивали дистиллированной водой, затем дважды отмывали в ФЗФР в течение 5 мин и осторожно просушивали фильтром, не касаясь клеток.

Помещали стекла во влажную камеру. Все последующие процедуры проводили при комнатной температуре. В каждую лунку вносили по 10 мкл 3% раствора перекиси водорода на 5 мин, затем стекла отмывали и просушивали, как описано выше.

Следующий этап - в лунки вносили моноклональные антитела в рабочем разведении по 10 мкл: CD19 и HLA-DR соответственно как в первые 2 лунки с интактными мононуклеарными клетками, так и последующие 2 лунки с мононуклеарными клетками после нагрузки циклофероном. Инкубировали антитела в течение 30 мин, после чего стекла отмывали и просушивали. Во все лунки вносили вторичные биотилированные антикроличьи и антимышиные антитела по 10 мкл, инкубировали в течение 30 мин и выполняли процедуру отмывания и просушивания стекол. Затем во все лунки вносят стрептавидин-пероксидазу (стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена) по 10 мкл, инкубируют в течение 15 мин и повторяют процедуру отмывания и просушивания стекол.

Во все лунки вносили свежеприготовленный хромогенный субстрат (хранящийся при Т 4°С), инкубировали в течение 5 мин (обязательно в темноте!) и повторяли процедуру отмывания и просушивания стекол. Затем окрашивали препараты в течение 30 с, нанося на лунку по 10 мкл красителя гематоксилина, с последующим ополаскиванием дистиллированной водой, потом - 37 mM аммониевой водой, и помещали в дистиллированную воду на 1-2 мин. Стекла обсушивали в течение 5 мин при Т 37°C, наносили 1 каплю глицергеля, нагретого до Т 56°C, и закрывали обезжиренным покровным стеклом. Микроскопию проводили через 20-30 мин, подсчет лимфоцитов выполняли в световом микроскопе с иммерсией, объектив 90^х, окуляр 7^х. Просчитывали 200 лимфоцитов и определяли относительное количество В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток и активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток в лунках с интактными мононуклеарными клетками (до инкубации с циклофероном) и после инкубации с циклофероном, вычисляли процент увеличения В-лимфоцитов и активированных лимфоцитов в результате действия циклоферона in vitro.

Клинико-иммунологические исследования проводили путем исследования состояния здоровья и различных показателей иммунитета до применения препарата и после применения препарата.

Результаты клинико-иммунологических исследований представлены в таблице.

Полученные данные свидетельствуют о параллелизме нарастания В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток и активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток после нагрузочной пробы с циклофероном in vitro и после терапии циклофероном (in vivo) у лиц, чувствительных к данному лекарственному препарату.

Указанные изменения обнаружены не только по средним величинам численности лимфоцитов, но и по частоте отклонений. Так, частота повышенного содержания CD19⁺-лимфоцитов в крови увеличилась с 3,33% до 31,58% (Р<0,01), а частота низкого их уровня снизилась с 76,67% до 47,37% (Р<0,05). Установлено также повышение частоты встречаемости высокого содержания HLA-DR⁺-лимфоцитов с 13,33% при фоновом обследовании до 52,38% при повторном (Р<0,001).

Работоспособность предлагаемого способа доказана клиническими исследованиями.

Среди лиц, работающих в контакте с токсикантами, эффективность предполагаемого применения курсового лечения циклофероном определялась результатами нагрузочной пробы in vitro с циклофероном до начала лечения: при увеличении относительного количества В-лимфоцитов и активированных лимфоцитов после инкубации с циклофероном по сравнению с исходными величинами наблюдался положительный клинико-иммунологический эффект. При отсутствии нарастания относительного количества В-лимфоцитов и активированных лимфоцитов после инкубации с циклофероном in vitro по сравнению с исходными величинами позитивной клинико-иммунологической динамики в результате проведения курсового лечения циклофероном не отмечалось.

Таблица
Состояние иммунитета у лиц, контактирующих с токсическими веществами, до и после применения циклоферона Изученные показатели (M±m) Фоновое обследование (до курса лечения циклофероном) n=30 Повторное обследование (после курса лечения циклофероном) n=30 Лимфоциты, % 36,43±1,74 47,8±1,41* CD3⁺-лимфоциты, % 63,3±1,63 62,2±1,53 CD4⁺-лимфoциты, % 38,3±1,63 39,57±2,25 CD8⁺-лимфоциты, % 24,93±1,91 27,0±1,77 CD16+-лимфоциты, % 15,23±1,63 20,16±1,41* CD19+-лимфоциты, % 4,33±0,77 10,47±2,04* CD25⁺-лимфoциты, % 3,23±0,50 7,33±2,13 HLA-DR⁺-лимфоциты, % 15,9±1,36 21,81±1,95* ИРИ (CD4⁺/CD8⁺) 1,79±0,18 1,68±0,16 ИЛ-1β, пг/мл 63,42±44,72 46,3 7±41,31 ИЛ-2, пг/мл 156,13±54,82 161,82±52,42 ИЛ-4, пг/мл 80,70±31,63 44,70±15,54 ФНО-α, пг/мл 157,88±56,64 237,06±35,15 ИФН-γ, пг/мл 54,05±4,17 51,66±2,42 IgM сыв., г/л 1,94±0,07 1,93±0,06 IgG сыв., г/л 12,49±0,23 12,46±0,24 IgA сыв., г/л 2,19±0,10 2,15±0,07 IgE сыв., МЕ/мл 207,05±55,16 206,58±53,30 ЦИК, мкг/мл 154,57±9,76 163,0±8,85 Лизоцим сыв., % 53,27±0,91 57,3±0,50* ФЧ, % 59,73±1,77 63,30±1,59 ФИ 0,84±0,02 0,85±0,03 НСТ-тест спонтанный, % 30,45±2,89 33,37±1,09 индуцированный, % 48,09±2,09 52,5±1,04 резерв, % 17,64±2,59 19,13±1,27 Примечания: звездочка (*) - статистически значимые различия (Р<0,05) до и после терапии циклофероном, М - средняя величина, m - средняя ошибка средней величины.

Клинический эффект терапии циклофероном (внутримышечное введение по 2 мл 12,5% раствора (250 мг) один раз в сутки в 1, 2, 4, 6, 8, 11, 14, 17, 21, 24 дни: курсовая доза - 2500 мг) заключался в существенном снижении частоты жалоб на боли, тяжесть в правом подреберьи; в отсутствии случаев обострений хронических воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта и печени, носоглотки и верхних дыхательных путей, рецидивов герпетической инфекции; в отсутствии случаев заболеваний острыми респираторными вирусными инфекциями, которые ранее имели место у обследованных, как во время проведения курса лечения циклофероном, так и в течение 4 месяцев после его окончания. Зарегистрирована также положительная динамика показателей иммунного статуса, который оценивался с использованием комплекса методов, характеризующих основные звенья врожденного и приобретенного иммунитета. Как свидетельствуют результаты таблицы, через 1 месяц после проведения курса терапии циклофероном установлено увеличение численности циркулирующих лимфоцитов в крови, натуральных киллеров - CD16⁺-лимфоцитов, В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток, активированных клеток - HLD-DR⁺-лимфоцитов, активности лизоцима при наличии тенденции к нарастанию активности фагоцитоза нейтрофилов. Отмечено понижение выраженности гиперферментемии, которая имела место у обследованных в отношении аланинаминотрансферазы (АлАт), аспартатаминотрансферазы (АсАт) и гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ). Положительная динамика заключалась преимущественно в снижении активности фермента АлАт, а также в уменьшении частоты встречаемости высокого уровня изученных ферментов, в частности, повышенная активность ГГТ после курса лечения циклофероном определялась в 2 раза реже, чем до его применения.

Подтверждение работоспособности способа дано в виде выписок из историй болезни пациентов, находившихся на обследовании в ФГУН «Нижегородский НИИ гигиены и профессиональной патологии».

Пример 1. П-в, 60 лет, компрессорщик цеха нейтрализации ракетного топлива.

После инкубации мононуклеарных клеток с циклофероном in vitro относительное количество В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток увеличилось на 20% по сравнению с исходной величиной, относительное количество активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток увеличилось на 15,4% по сравнению с исходной величиной. Последующая терапия циклофероном способствовала значительному улучшению клинических и иммунологических характеристик, в том числе нарастанию более чем в 2 раза первоначально сниженной численности В-лимфоцитов и нарастанию на 70% численности активированных клеток, что свидетельствовало о высокой эффективности проведенного лечения.

Пример 2. М-н, 48 лет, техник систем дожига ракетного топлива.

После инкубации мононуклеарных клеток с циклофероном in vitro относительное количество В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток увеличилось на 100% по сравнению с исходной величиной, а относительное количество активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток увеличилось на 8,3% по сравнению с исходной величиной. Клинико-иммунологическая эффективность последующей терапии циклофероном была недостаточной; что касается конкретных изучаемых показателей, наблюдалось снижение относительного количества активированных клеток наряду с нарастанием В-лимфоцитов.

Пример 3. Ч-в, 55 лет, техник систем дожига ракетного топлива.

После инкубации мононуклеарных клеток с циклофероном in vitro относительное количество В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток увеличилось на 100% по сравнению с исходной величиной, а относительное количество активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток снизилось по сравнению с исходной величиной. Клинико-иммунологическая эффективность последующей терапии циклофероном была недостаточной; что касается изучаемых показателей, наблюдалось снижение относительного количества В-лимфоцитов и активированных клеток.

Пример 4. Г-в, 51 г., техник систем дожига ракетного топлива.

После инкубации мононуклеарных клеток с циклофероном in vitro относительное количество В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток увеличилось на 14,3% по сравнению с исходной величиной, а относительное количество активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток увеличилось на 4,2% по сравнению с исходной величиной. Клинико-иммунологическая эффективность последующей терапии циклофероном была недостаточной; что касается изучаемых показателей, наблюдалось увеличение относительного количества В-лимфоцитов и снижение активированных клеток.

Пример 5. К-н, 34 г., начальник станции дожига ракетного топлива.

После инкубации мононуклеарных клеток с циклофероном in vitro относительное количество В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток снизилось по сравнению с исходной величиной, а относительное количество активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток осталось без изменений по сравнению с исходной величиной. Клинико-иммунологическая эффективность последующей терапии циклофероном была недостаточной; что касается изучаемых показателей, наблюдалось увеличение относительного количества активированных клеток, а численность В-лимфоцитов осталась без изменений.

Предлагаемый способ профилактики и коррекции иммунных нарушений, вызываемых токсикантами, осуществляют следующим образом.

До начала лечения пациента определяют по иммунным показателям крови in vitro индивидуальную реакцию пациента путем инкубации мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациента, с циклофероном.

В динамике определяют содержание В-лимфоцитов - CD19⁺-клеток и активированных лимфоцитов - HLA-DR⁺-клеток.

Препарат применяют при условии превышения количества В-лимфоцитов более чем на 20% и активированных лимфоцитов более чем на 15%.

Техническим результатом изобретения является исключение неоправданных дополнительных антигенных нагрузок на организм человека, контактирующего с токсикантами, в результате применения неэффективных конкретно для него профилактических и терапевтических средств.

Способ может быть широко применен в иммунологии во всех случаях применения циклоферона.

Изобретение относится к медицине, а именно к профессиональным болезням, и может быть использовано для коррекции иммунных нарушений у лиц, контактирующих с токсическими веществами. Способ осуществляется следующим образом. Перед введением иммуностимулятора циклоферона определяют индивидуальную реакцию на циклоферон путем инкубации in vitro с циклофероном мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациента. Циклоферон вводят при превышении количества CD19⁺ В-лимфоцитов более чем на 20% и активированных лимфоцитов HLA-DR⁺ более чем на 15%. Способ позволяет повысить эффективность коррекции иммунных нарушений за счет прогнозирования иммунного ответа организма на терапию циклофероном. 1 таб.

Способ профилактики и коррекции иммунных нарушений, вызываемых токсическими веществами, включающий введение иммуностимулятора при определенных иммунных показателях, отличающийся тем, что в качестве иммуностимулятора вводят циклоферон, до введения определяют индивидуальную реакцию на циклоферон путем инкубации in vitro с циклофероном мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови пациента, и циклоферон вводят при превышении количества CD19⁺ В-лимфоцитов более чем на 20% и активированных лимфоцитов HLA-DR⁺ более чем на 15%.