ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ КОМПЛЕКСНОГО ДЕЙСТВИЯ Российский патент 2000 года по МПК A61K35/66 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, ветеринарии и касается получения пробиотиков комплексного действия.

Создание пробиотиков комплексного действия, обладающих антимикробной, иммуномодулирующей активностью, является актуальной для медицины и ветеринарии заданной задачей (1,2). Для расширения спектра действия пробиотиков рекомендуется разрабатывать препараты из нескольких штаммов и видов бактерий, способных осуществлять свою жизнедеятельность и биологическую активность в различных компартаментах открытых полостей (биотопов) организма теплокровных (1). В качестве таких комплексных препаратов можно назвать "Бификол", "Биоспорин", "Бактерин-СЛ" (3). Последние два представляют собой препараты на основе спорообразующих бактерий Bacillus subtillis и Bacillus licheniformis, имеющих различные потребности в кислороде, что позволяет пролонгировать действие препарата и осуществлять специфическую активность не только в аэробных отделах желудочно-кишечного тракта, но и в анаэробных, которые, как известно, по протяженности занимают не менее 2/3 последнего.

Для получения пробиотиков с иммуномодулирующими и антивирусными свойствами рекомендуется включать в препараты компоненты, повышающие резистентность организма (иммуноглобулины, лизоцим) или оказывающие иммуностимулирующие и антивирусное действие (цитокины, пептиды тимуса) (2).

Альтернативным подходом в этом направлении является создание рекомбинантных пробиотиков, состоящих из генетически модифицированных микроорганизмов, продуцирующих биологически активные белки клонированный генов (4). Рекомбинантные пробиотики более просты в изготовлении, так как для этого не требуется дорогостоящая очистка целевых компонентов. В качестве примера можно привести пробиотический штамм Streptococcus lactus, в который был клонирован ген интерлейкина с целью дальнейшего использования рекомбинантного штамма для усиления иммунитета слизистых покровов (5). Другим примером является штамм Bacillus subtilis B-4759, синтезирующий альфа-2-интерферон человека, который при введении в организм оказывает антивирусное и иммуномодулирующее действие (6, 7).

На основе данного штамма создан рекомбинантный пробиотический препарат "Субалин" (8), который является наиболее близким аналогом предполагаемого изобретения.

Существенным недостатком препарата-прототипа является то, что штамм Bacillus subtilis B-4759, лежащий в его основе, является строгим аэробом и не может проявлять специфическую активность а анаэробных биотопах желудочно-кишечного и урогенитального трактов.

Технической задачей изобретения является создание биопрепарата, обладающего одновременно антибактериальной и антивирусной активностью, способного к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма, отличающихся по cодержанию в них кислорода.

Это достигается тем, что помимо штамма Bacillus subtilis B-4759, обладающего антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов и продуцирующего интерферон в аэробных условиях, в состав нового препарата дополнительно включают рекомбинантный штамм Bacillus licheniformis 2336/105 (9), способный к синтезу интерферона в микроаэрофильных условиях.

Новый пробиотический препарат комплексного действия "Субалин-форте" содержит в качестве основы живые клетки Bacillus subtilis B-4759 и Bacillus licheniformis 2336/105, а также стабилизатор, при следующем соотношении, об. %:
Биомасса Bacillus subtilis B-4759 (1•10⁹-10•10⁹) и Bacillus licheniformis 2336/105 (1•10⁸-10•10⁸) живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92 - 98
Стабилизатор - 8 - 2
Необходимость стабилизатора обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем высушивании препарата.

В качестве стабилизатора препарат может содержать сыворотку крови, молоко и т.д., предпочтительно сахарозожелатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатина).

Рекомбинантные штаммы, включаемые в препарат, должны характеризоваться стабильностью плазмидной ДНК и гена интерферона в ее составе при пассировании культуры через организм.

Исследование стабильности плазмидной ДНК с геном интерферона в штаммах B. subtilis B-4759 и B.lichenifomis 2336/105 проводят на беспородных белых мышах весом 18-20 г. В опыт отбирают животных, у которых в предварительных экспериментах не высевались из фекалий бактерии рода Bacillus. Животным вводят перорально по 1 дозе препарата. Через 18 ч проводят высев микрофлоры фекалий на мясо-пептонном агаре (МПА). Выросшие изолированные колонии B.subtilis и B.livheniformis перекладывают на МПА с канамицином и без канамицина для подсчета количества клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду. Из культур, выросших на МПА, готовят суспензию в физиологическом растворе и повторно вводят перорально животным. Через 18 ч повторяют процедуру высева культур Bacillus из фекалий и определения количества клонов, утративших плазмиду. Было проведено 10 пассажей культур через организм. Все анализируемые клоны росли после 10-го пассажа на среде с канамицином, что свидетельствует о репликационной стабильности плазмиды в штаммах в условиях пассирования через организм.

Для определения структурной стабильности рекомбинантной плазмиды в пассированных штаммах выделяют плазмидную ДНК из 50 случайно отобранных после пассажа клонов обоих штаммов и подвергают рестрикционному анализу. В опыте не было выявлено образцов с измененной по сравнению с исходной картиной гидролиза, что свидетельствует о высокой структурной стабильности штаммов, являющихся основой нового пробиотического препарата.

Сохранность гена интерферона в составе плазмиды определяют методом ПЦР со специфическими к гену интерферона праймерами, фланкирующими его структурную часть. Во всех исследуемых образцах плазмидной ДНК при проведении ПЦР наблюдается в агарозном геле ампликон, соответствующий по длине структурной части гена, что свидетельствует об отсутствии делеционных изменений в гене интерферона.

Полученный комплексный пробиотический препарат "Субалин-форте" характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, полученных из коллекции ГИСКа им. Тарасевича (г. Москва) (табл. 1).

Антивирусную активность препарата определяют после инкубации препарата при 37^oC на богатой среде в аэробных и микроаэрофильных условиях. После инкубации и центрифугирования получают культурную надосадочную жидкость и в ней определяют содержание интерферона после предварительного концентрирования сульфатом аммония или трихлоруксусной кислотой (до конечной концентрации 3%). Антивирусную активность препарата определяют по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита. В качестве препаратов сравнения используют препараты-аналоги: Биоспорин и Субалин в тех же дозах (табл. 2).

Препарат Субалин-форте характеризуется безвредностью для теплокровных (табл. 3), что было показано в опытах на животных.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. На основе штаммов Bacillus subtilis B-4759 и Bacillus licheniformis 2236/105 с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены 5 вариантов препарата "Субалин-форие" с различным содержанием микробных клеток.

Вариант I
Препарат, содержащий, об%:
Биомасса B. subtilis B-4759 0,5•10⁸ и B.licheniformis 2236/105 0,5•10⁷ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92
Стабилизатор (сыворотка крови КРС) - 8
Вариант II
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 1•10⁹ и B.licheniformis 2336/105 1•10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 94
Стабилизатор (молоко) - 6
Вариант III
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 5•10⁹ и B.liсheniformis 2336/105 5•10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 95
Стабилизатор (4% сахароза + 1% желатин) - 5
Вариант IV
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B. subtilis B-4759 10•10⁹ и B.licheniformis 2336/105 10•10⁸ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 98
Стабилизатор (4% сахароза + 1% желатин) - 2
Вариант V
Препарат, содержащий, об.%:
Биомасса B.subtilis B-4759 5•10¹⁰ и B.licheniformis 2336/105 5•10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 97
Стабилизатор (сыворотка крови КРС) - 3
Изготовленные варианты лиофильно высушивают, помещают в двойные полиэтиленовые (бумажные с полиэтиленовой пропиткой) пакетики, которые впоследствии запаивают.

Проверку безвредности, специфической активности в отношении тест-культур (представителей различных групп патогенных и условно патогенных микроорганизмов), а также продукцию интерферона альфа-2 в аэробных и микроаэрофильных условиях представленных вариантов препарата "Субалин-форте" осуществляют на лабораторных животных.

Пример 2. Для определения безвредности нового пробиотического препарата содержимое пакетика разводят в 0,5 мл физиологического раствора и вводят эту дозу перорально мыши. Для каждого варианта препарата используют не менее 10 мышей массой 18-20 г. Препарат считают безвредным, если все мыши остаются живыми в течение пяти суток наблюдения. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.

Пример 3. Для определения специфической активности исследуют антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляют методом "отсроченного" антагонизма. Для этого содержимое пакетика растворяют в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевают петлей в центр чашки Петри с агаризованной средой Гаузе-2 на 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевают штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводят через 18 ч инкубирования при 37^oC по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служит параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе-2 без исследуемой культуры. Данные представлены в табл. 4. В таблице представлены также данные, характеризующие безвредность препарата. Безвредность изучалась на белых беспородных мышах при введении им перорально препарата в дозах, в 100 раз превышающих рекомендуемые.

Как видно из приведенных данных, все варианты препарата Субалин-форте являются безвредными и обладают высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Пример 3. Для определения специфической антивирусной активности варианты препарата Субалин-форте исследуют на продукцию интерферона в аэробных и микроаэробных условиях. Для этого содержимое пакетика инкубируют при 37^oC в 100 мл богатой питательной среды (LB), содержащей 10 мкг/мл канамицина. Инкубацию проводят на качалке для создания аэрированных условий и в термостате - для микроаэрофильных условий. После 8-10-часовой инкубации культуру центрифугируют, к супернатанту добавляют трихлоруксусную кислоту до концентрации 3% с последующим двухкратным 12-часовым диализом против буфера HEPES, либо осаждают сульфатом аммония с последующим растворением в 10 мл HEPES буфера с добавлением ингибитора протез. Полученные образцы анализируют на антивирусную активность по содержанию в них интерферона.

Пример 4. Антивирусную активность комплексного пробиотика определяют по ингибированию цитопатического действия вируса EMC (энцефаломиокардита мышей). Суспензию диплоидных клеток фибробластов человека (ДФЧ) ДК-58 доводят до концентрации 2•10⁹ кл/мл роствовой средой. В каждую лунку полистирольного планшета вносят по 100 мкл (2•10⁹ клеток) суспензии ДФЧ в ростовой среде и инкубируют при 37^oC до формирования монослоя клеток. Под микроскопом сформировавшийся монослой клеток похож на мозаику, образовавшуюся вытянутыми игольчатыми клетками. После формирования монослоя ростовую среду отсасывают, в первую лунку вносят 20 мкл культурального образца, полученного, как описано выше, и 100 мкл поддерживающей среды; после осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносят во вторую, смешивая со 100 мкл поддерживающей среды и т.д. Клетки выдерживают 24 часа при 37^oC и после этого вносят 100 тканевых цитопатических доз вируса EMC, вызывающих поражение в половине проб, и выдерживают при 37^oC 24-48 часов. Через 1 сутки проводят первый учет, через 2 суток - второй. Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью референс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона (рекомбинантный альфа-2-интерферон), и выражают в международных единицах (ME). Результаты, представленные в таблице 5, свидетельствуют о том, что препарат Субалин-форте в различных вариантах обладает антивирусной активностью.

Испытания вариантов препарата показали идентичность вариантов по специфической активности и безвредности. Оптимальные количества живых микробных клеток B.subtilis B-4759 и B.licheniformis 2336/105 в 1 мл физиологического раствора составляет 1•10⁹-10•10⁹ и 1•10⁸-10•10⁸ клеток соответственно при их объемном содержании 92-98%. Дальнейшее увеличение микробных клеток не изменяет существенным образом специфические свойства препарата.

Полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные варианты препарата Субалин-форте безвредны для животных, характеризуются антагонистической активностью в отношении тест-культур, а также способностью продуцировать интерферон как аэробных, так и в микроаэрофильных условиях.

Таким образом, предложенный новый пробиотический препарат комплексного действия Субалин-форте, обладающий одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способный к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма, отличающихся по содержанию в них кислорода.

Литература
1. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., и др. //Вестник Росс. АМН. - 1997 - N 3 - с. 4-7.

2. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. //Вестник Росс. АМН. - 1997 - N 3 - с. 7-9.

3. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А. //Микробиол. журнал - 1993 - т. 55 - N 4 - с. 92-112
4. Сорокулова И.Б., Белявская В.А. и др.//Вестник Росс.АМН - 1997. - N 3. - С.46-49.

5. Steidler L., Robinson K., Chamberlain L. et al.//Infec. and Immunit. -1998.-V.66. N.7. - P.3183-3189.

6. Патент РФ 1839459, кл. C 12 N 1/21, 1990 г.

7. Смирнов В. В. , Чудновская Н.В., Рыбалко С.Л., Сорокулова И.В., Белявская В.А. и др.//Доклады НАН Украины, 1995, N 2, с.124-126.

8. Патнт РФ 2035185, кл. A 61 K 35/66, 1992 г.

9. Заявка на патент РФ N 98112850, 30.06.98 г.

Препарат может быть использован в медицине, биотехнологии, ветеринарии для получения пробиотиков комплексного действия. Препарат содержит следующие компоненты, об.%: смесь биомассы Bacillus subtilis ВКПМ-4759 с титром 1х10⁷ - 10х10⁹ живых микробных клеток и биомассы Bacillus licheniformis 2336/105 с титром 1х10⁸ - 10х10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92-98% и стабилизатор (сыворотки крови КРС, или молоко, или смесь 4% сахарозы и 1% желатина) - 2-8%. Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способен к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма, отличающихся по содержанию в них кислорода. 3 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Пробиотический препарат комплексного действия, включающий живую биомассу бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 и стабилизатор, отличающийся тем, что дополнительно содержит живую биомассу рекомбинантных бактерий Bacillus licheniformis 2336/105 при следующем соотношении компонентов, об.%:
Смесь биомассы Bacillus subtilis ВКПМ В-4759 с титром 1x10⁹ - 10x10⁹ живых микробных клеток и биомассы Bacillus licheniformis 2336/105 с титром 1x10⁸ - 10x10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92 - 98
Стабилизатор - 2 - 8
2. Пробиотический препарат комплексного действия по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют сыворотку крови КРС. 3. Пробиотический препарат комплексного действия по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют молоко. 4. Пробиотический препарат комплексного действия по п.1, отличающийся тем, что в качестве стабилизатора используют смесь 4% сахарозы и 1% желатина.