БИОПРЕПАРАТ "ИРИЛИС" ВЕТЕРИНАРНОГО НАЗНАЧЕНИЯ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 A61K35/66 C12N1/20 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии и касается создания новых пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus, которые могут быть использованы для неспецифической профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза животных и птиц.

Одной из причин сложной эпизоотической ситуации в животноводстве является бесконтрольное применение антибиотиков и химиотерапевтических средств. Неоправданно широкое их применение обусловливает появление возбудителей с возросшей и множественной лекарственной устойчивостью. Снижается и затягивается процесс лечения животных. Нередко возникает необходимость коррекционного применения пробиотических препаратов. Для компенсации физиологического бактериоза и возможно раннего становления колонизационной резистентности кишечника новорожденным назначают пробиотики - препараты, содержащие живую нормальную микрофлору кишечника или ее метаболиты и стимуляторы развития в кишечнике собственной нормальной микрофлоры. Таковы, например, бифидумбактерин, лактобактерин, бифилакт и бифимол, лактоамиловарин и т.п.

Известные пробиотики на основе молочнокислых бактерий в ряде случаев обладают выраженной лечебно-профилактической эффективностью при желудочно-кишечных болезнях телят. Так повышается сохранность и прирост массы тела, сокращается продолжительность болезни, снижаются тяжесть ее течения и острота технологических стрессов. Однако применение пробиотиков не всегда сопровождается положительным эффектом. Противоречивые результаты, полученные в ряде исследований, свидетельствуют о неудачном подборе использованных для их приготовления штаммов, нарушении технологии получения и других причин, снижающих качество препаратов, а также несовместимости с антимикробными средствами, что является сдерживающим фактором в лечении диспептических расстройств у новорожденных телят. Кроме того, хотя бифидо- и лактобактерии подавляют развитие патогенной микрофлоры путем образования органических кислот и других антибиотических веществ и нормализуют деятельность желудочно-кишечного тракта, но в условиях существования новорожденных телят формирование бифидофлоры происходит, как правило, после появления в кишечном тракте кишечной палочки, стафилококков, протея и других представителей условно-патогенной и патогенной микрофлоры, что приводит к дисбактериозу кишечника.

В настоящее время широкое распространение получили биопрепараты из спорообразующих бактерий. В состав препаратов - пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus входят штаммы, обладающие разным спектром антибактериальной и антимикозной активности. Эффективность препаратов определяется широтой спектра и силой антибактериальной активности входящих в препарат штаммов.

Известен штамм Bacillus subtilis X-15, используемый для профилактики и лечения эндометритов у коров (Патент RU №2180575, C 12 N 1/20, опубл. 20.03.2002).

Недостатком препарата на основе штамма Bacillus subtilis X-15 является ограниченность спектра действия, так как он активен только против узкой группы микроорганизмов, вызывающих эндометриты у коров.

Известен также пробиотический препарат «Субтилис» на основе жидкой или лиофильно высушенной культуры штамма Bacillus subtilis ВКМ №В-2250 Д. Препарат предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы, способствует увеличению усвояемости кормов, повышению продуктивности и привесов (Патент RU №2184774, C 12 N 1/20, опубл. 10.07.2002).

Недостатком препарата «Субтилис» является ограниченный спектр антагонистической активности.

Наиболее близким аналогом является пробиотический препарат комплексного действия, содержащий следующие компоненты, об.%: смесь биомассы Bacillus subtilis ВКПМ - 4759 с титром 1×10⁷-10×10⁹ живых микробных клеток и биомассы Bacillus. Licheniformis 2336/105 с титром 1×10⁸-10×10⁹ живых микробных клеток в 1 мл физиологического раствора - 92-98%, и стабилизатор на основе сыворотки крови крупного рогатого скота, или молока, или их смеси, сахарозы и желатина -2-8%. Препарат обладает одновременно антибактериальной и антивирусной активностями, способен к пролонгированному синтезу интерферона в различных отделах открытых полостей организма (Патент RU №2159625, А 61 К 35/66, опубл. 27.11.2000).

Задачей изобретения является создание пробиотического биопрепарата ветеринарного назначения, характеризующегося более выраженной антагонистической активностью в отношении условно-патогенных микроорганизмов за счет высокой лизоцимной, протеолитической и амилазной активностей входящих в биопрепарат штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, удобного в применении и имеющего разные рецептурные формы.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза животных, в том числе и птицы, за счет расширения спектра антагонистической активности входящих в биопрепарат Ирилис штаммов бактерий, повышении устойчивости биопрепарата к действию ферментов желудочно-кишечного тракта и удобстве применения, а также повышении продуктивности и привесов животных и птицы.

Сущность изобретения заключается в следующем:

Входящие в состав биопрепарата Ирилис новые штаммы В.subtilis 07 (ВКПМ №В-8611) и В.licheniformis 09 (ВКПМ №В-8610) характеризуются широким спектром антагонистической активности, высокой протеолитической и амилазной активностью (В.subtilis 07) и выраженной способностью к продукции лизоцима (В.licheniformis 09), не конкурируют друг с другом, а вступают в синергидные отношения, что проявляется в повышении антагонистического действия биопрепарата.

Штаммы B.subtilis 07 (ВКПМ №В-8611) и В.licheniformis 09 (ВКПМ №В-8610) выделены из здорового растения пшеницы, депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и характеризуются следующими свойствами:

Bacillus subtilis ВКПМ №В-8611 - грамположительные аэробные спорообразующие палочки, размером 2,7-0,6×0,8-0,7 мкм, расположенные одиночно или в виде цепочек. Клетки подвижны, образуют в аэробных условиях споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. При спорообразовании клетки не раздуваются.

На среде Гаузе №2, сусло-агаре, среде Громыко штамм растет обильно, образует матовые складчатые колонии телесного цвета с изрезанными краями, легко снимаются петлей с агара.

В протоплазме штамма после роста на глюкозном агаре не обнаруживаются включения поли-β-оксимасляной кислоты. На МПБ культура образует пленку.

Не растет в анаэробных условиях, не гидролизует мочевину, не образует газ из нитратов в анаэробных условиях, не продуцирует аргининдигидролазу. Культура образует каталазу. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет в присутствии 7% NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатин. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обесцвечивает метиленовую синьку. Не обладает коагулазной и лецитиназной активностью, обладает высокой протеолитической и амилазной активностью.

Основные физико-биохимические свойства B.subtilis ВКПМ №В-8611 представлены в табл.1 и табл.2.

Bacillus licheniformis ВКПМ №В-8610 - грамположительные спорообразующие палочки, размером 2,6-0,7×0,5-06 мкм. Клетки подвижные, перитрихи, располагаются в основном в виде цепочек. Споры овальной формы, располагаются в клетке центрально. Клетки при спорообразовании не раздуваются. После роста на глюкозном агаре в протоплазме не обнаруживаются включения поли-β-оксимасляной кислоты.

На МПА образует колонии с тусклой грубой поверхностью, непрозрачные, плотно прикрепленные к агару: нередко на поверхности обнаруживается слизь. На МПБ образуется морщинистая пленка, иногда с кремовым оттенком.

Культура образует каталазу, характеризуется способностью расти на агаре в анаэробных условиях. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, растет при 7% NaCl. Гидролизует крахмал, казеин, не гидролизует мочевину. Желатин разжижает медленно. Ферментирует глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, в анаэробных условиях из нитратов образует газ. Продуцирует аргининдигидролазу, лизоцим. Не обладает коагулазной и лецитиназной активностью.

Основные свойства штамма B.licheniformis ВКПМ № В-8610 представлены в табл. 1 и табл.2.

Штаммы B.subtilis ВКПМ №В-8611 и B.licheniformis ВКПМ №В-8610 характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к ряду антибиотиков

В составе предлагаемого биопрепарата Ирилис указанные штаммы могут быть использованы в различных сочетаниях, например, в равных соотношениях (по титру клеток): биомасса штамма В.subtilis ВКПМ №В-8611 в титре 1·10⁹ КОЕ/мл и биомасса штамма B.licheniformis ВКПМ №В-8610 в титре 1·10⁹ КОЕ/мл или в любых соотношениях в пределах (1-100):(100-1), например, биомасса штамма В.subtilis ВКПМ №В-8611 в титре 5·10⁹ КОЕ/мл и биомасса штамма B.licheniformis ВКПМ №В-8610 в титре 1·10⁹ КОЕ/мл, или биомасса штамма В.subtilis ВКПМ №В-8611 в титре 1·10¹⁰ КОЕ/мл и биомасса штамма B.licheniformis ВКПМ №В-8610 в титре 5·10⁹ КОЕ/мл, или биомасса штамма В. subtilis ВКПМ №В-8611 в титре 1·10⁹ КОЕ/мл и биомасса штамма В. licheniformis ВКПМ №В-8610 в титре 1·10⁷ КОЕ/мл и т.д.

Биопрепарат Ирилис содержит также защитную среду для обеспечения сохранности бактерий в процессе технологической переработки, получения конечной рецептурной формы и последующего хранения. В качестве защитной среды, он может содержать, например, сахарозо-желатиновую среду, сухое молоко, желатозу, лактозу, сахарозу и т.п.

Биопрепарат Ирилис может дополнительно содержать растворитель. В качестве растворителя может быть использована, например, дистиллированная или кипяченая вода, физиологический раствор и т.п.

Биопрепарат Ирилис может дополнительно также содержать наполнитель, обычно применяемый при изготовлении различных рецептурных форм. При формовании таблеток он может содержать, например, декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон, сахарозу, лактозу, стеарат кальция, глюкозу, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк и т.п. При получении суппозиторий или свечей в качестве наполнителя он содержит, например, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия и т.п.

Биопрепарат может быть инкапсулирован или иммобилизирован на различных типах носителей или сорбентах, например, на аэросиле, целлюлозе, активированном угле, карбоксиметилцеллюлозе, гидроксиэтилцеллюлозе, хитозане и т.п.

Биопрепарат может также быть лиофилизирован.

Биопрепарат «Ирилис» может быть использован для перорального или вагинального или ректального или наружного применения в виде водной суспензии. Механизм действия биопрепарата Ирилис основан на адгезивной и антагонистической активности бактерий- пробиотиков, продуцирующих различные физиологически активные вещества и вытесняющих патогенные и условно-патогенные микроорганизмы из пищеварительного тракта макроорганизма, и оказывающих стимулирующее действие на специфические и неспецифические защитные реакции макроорганизма.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение жидкого препарата.

Штаммы культивируют по отдельности или на плотных, или на жидких питательных средах.

При стационарной технологии культивирование штаммов проводят на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38°С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончании инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, стабилизатором - защитной средой, содержащей 5% раствор лактозы, сводят вместе в соотношении 10:1, разливают во флаконы. Получают биопрепарат с содержанием биомассы штамма В. subtilis ВКПМ №В-8611 в титре 1·10¹⁰ КОЕ/мл и биомассы штамма В. licheniformis ВКПМ №В-8610-1·10⁹ КОЕ/мл.

При промышленной технологии культивирование штаммов проводят в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38°С в течение от 10-18 ч. Процесс считают законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончанию инкубации раздельно выращенные культуры сводят вместе в соотношении 1:1 и добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду, разливают во флаконы. Получают биопрепарат с содержанием биомассы штамма В.subtilis ВКПМ №В-8611 в титре 5·10⁹ КОЕ/мл и биомассы штамма В.licheniformis ВКПМ №В-8610 - 5·10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2. Получение препарата в форме лиофилизата.

При стационарной технологии культивирование штаммов проводят на плотных агаризованных средах в матрацах, либо в стеклянных бутылях на термостатируемой качалке при температуре от 22 до 38°С в течение от 12-16 ч до 7 сут. По окончании инкубации смывают биомассу, выросшую на поверхности питательной среды, защитной средой, содержащей 10%-ный раствор глицерина, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

При промышленной технологии культивирование штаммов проводят в реакторе/ферментере с питательной средой для культивирования при температуре 35-38°С в течение от 10-18 ч. Процесс считают законченным, если концентрация клеток составляет 4-5 млрд/мл и соотношение спор и вегетативных клеток 1:1. По окончании инкубации раздельно выращенные культуры сводят вместе в соотношении 2:1 и добавляют стабилизатор, разливают в ампулы (флаконы) или в кассеты из нержавеющей стали, после чего подвергают замораживанию и обезвоживанию на вакуум-сушильной установке или высушивают распылительным способом.

Пример 3. Получение препарата в таблетированной форме.

Выращенные культуры штаммов В. subtilis ВКПМ №В-8611 и B.licheniformis ВКПМ №В-8610 после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с сахарным гранулятом, скользящими веществами (крахмалом или стеаратом кальция) и прессуют на ротационных прессах.

На стабильность изучено 10 экспериментально-производственных серий таблетированного препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В. subtilis ВКПМ №В-8611 и B.licheniformis ВКПМ №В-8610 в таблетках составляет не менее 10^9-7-10^8-6 КОЕ/дозе (соответственно). После хранения таблеток на протяжении 12 мес. содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 10^9-7-10^8-6 КОЕ/дозе.

Пример 4. Получение препарата в форме суппозиториев.

Выращенные культуры штаммов В.subtilis ВКПМ №В-8611 и В.licheniformis ВКПМ №В-8610 после добавления компонентов среды суспендирования обезвоживают на вакуум-сушильной или на распылительной сушильной установке, соединяют с наполнителями (кондитерским жиром или парафином) и отливают на специальной установке суппозитории.

На стабильность изучено 10 экспериментально-производственных серий препарата. Как показывают полученные результаты, непосредственно после прессования содержание живых В.subtilis ВКПМ №В-8611 и В.licheniformis ВКПМ №В-8610 в суппозиториях составляет не менее 10^9-7-10^8-6 КОЕ/ суппозиторий (соответственно). После хранения суппозиториев на протяжении 12 мес содержание живых микробных клеток ни в одной партии не оказалось ниже 10^9-7-10^8-6 КОЕ/суппозиторий.

Пример 5. Все полученные по примерам 1, или 2, или 3, или 4 варианты и формы биопрепарата Ирилис проверяют на безвредность на лабораторных животных, специфическую антагонистическую активность в отношении тест-культур-представителей различных групп патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивость к антибиотикам. Биопрепарат Ирилис характеризуется безвредностью. Для определения безвредности содержимое флакона разводят в 0,5 мл физиологического раствора и вводят эту дозу перорально мышам. Для каждого варианта опыта используют не меньше 10 мышей массой 15-16 г. Препарат считают безвредным, если все мыши остаются живыми в течение 5 суток наблюдения и ни у одной из них не выявлено заболевания.

Биопрепарат Ирилис характеризуется широким спектром антагонистической активности в отношении тест-штаммов культур патогенных микроорганизмов. Характеристика антагонистической активности препарата представлена в табл.3.

Для определения специфической активности исследуют антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляют методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое флакона растворяют в 1 мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевают штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе №2. Посевы инкубируют в термостате при 37°С в течении 72 ч. Затем к выросшей культуре подсевают штрихом тест-микроорганизмы (500 - миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе) Учет результатов проводят через 18 часов инкубирования при 37°С по величине зон отсутствия роста тест-культур.

Контролем роста тест-культур служит параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе №2 без исследуемой культуры.

Из данных табл.3 следует, что оптимальным количеством живых клеток в одной дозе препарата является 1-5×10⁹. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяет существенным образом антагонистическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов.

Пример 6. Для определения лечебной эффективности полученного по примеру 1, или 2, или 3 пробиотика Ирилис, в сравнении с применением препарата пектосорбин, в хозяйстве, длительно неблагополучном по желудочно-кишечным болезням поросят с симптомокомплексом диареи, формируют три группы из 81 поросят 1-2 дневного возраста с клиническими признаками диспепсии (диарея, кал разжижен, каловые массы имели кислый запах, содержали пузырьки газа, аппетит отсутствовал, сухость и бледность окраски видимых слизистых, пульс учащен, тоны сердца глухие, дыхание учащено).

После клинического обследования было установлено, что у 69 поросят - простая диспепсия, у 12 - токсическая.

При бактериологических исследованиях проб фекалий у всех больных поросят выделяют в больших количествах патогенные эшерихии (10⁸-10¹¹ бактерий в 1 г), в то время как штаммы эшерихий - нормальных представителей толстого отдела кишечника выделяют только у 8 поросят (10³-10⁴ бактерий в 1 г).

Патогенные эшерихии, в отличие от нормальных представителей кишечника, как правило, не ферментируют лактозу, вызывают гибель белых мышей при внутрибрюшинном введении. При серотипировании выделенных от поросят штаммов 11 штаммов относят к энтеропатогенной серогруппе 0141, остальные 40 штаммов не агглютинировались типоспецифическими сыворотками. Результаты исследований свидетельствуют о нарушении микрофлоры толстого отдела кишечника больных диспепсией поросят (дисбактериозе), что является причиной их заболеваемости.

Поросятам первой и второй групп первый раз после 3-4 часовой водо-голодной диеты за 20-30 минут до кормления выпаивают Ирилис в количестве 2 и 4 доз соответственно 2 раза в день с интервалом 12 часов до клинического выздоровления. Поросятам третьей группы три раза в день до клинического выздоровления с молозивом применяют препарат Пектосорбин в дозе 0,26 г на кг живой массы в соответствии с инструкцией по применению. За поросятами ведут клинические наблюдения, учитывают количество выздоровевших животных, длительность лечения. О выздоровлении судят по исчезновению признаков диареи, патологических примесей в фекалиях, метеоризма, спазмов, улучшению общего состояния, появлению аппетита. Результаты представлены в табл.4.

Табл.4.Сравнительная эффективность применения Ирилиса и Пектосорбина для лечения желудочно-кишечных болезней поросят, вызванных патогенной микрофлоройПоказателиГруппа поросятПервая, n=27 Ирилис 2 дозыВторая, n=27 Ирилис 4 дозыТретья, n=27 ПектосорбинВыздоровело, гол.242620Пало и вынуждено убито, гол.317Курс лечения, дней4,5±0,42,0±0,66,5±0,6Лечебная эффективность, %88,996,374,1

Как видно из табл. 4, пробиотик Ирилис обеспечивал высокую эффективность при применении его в количестве 4 доз 2 раза в день. Выздоровление наступает после 4-6-кратного применения Ирилиса при соблюдении диетического режима. Нормализация кишечной микрофлоры устраняет обезвоживание, что исключает необходимость проведения регидратационных мероприятий. После отмены препарата заболевание не регистрируют.

Пример 7. Для определения эффективности препарата Ирилис при лечении телят с симптомокомплексом диареи и оценки профилактического действия на животных до достижения ими 2-х месячного возраста было сформировано три группы из 100 здоровых новорожденных телят 1-2 дневного возраста, весом при рождении 28-30 кг.

Телят всех групп кормят в соответствии с рекомендациями по технологии выращивания: по 1,5-2 л молозива (молока) на каждое кормление три раза в сутки. Первый раз молозиво выпаивают не позднее 1,5 ч после рождения. Телятам первых двух групп (по 40 гол. каждая) за 20-30 мин. до второго кормления в течение пяти дней двумя курсами с перерывом 3-4 дня между ними дают внутрь препарат Ирилис по 1 и 2 дозы соответственно. Перед введением препарата содержимое одной ампулы (флакона) растворяют в 100 мл кипяченой и остуженной до температуры 38-39°С воды. Телятам первой опытной группы выпаивают по 50 мл, телятам второй опытной группы - по 100 мл препарата. Третья группа - контрольная (20 гол), препарат Ирилис не получает.

Телят взвешивают при рождении и в 2-х месячном возрасте. Ежедневно учитывают физическое состояние, аппетит и функционирование пищеварительной системы (характер стула, метеоризм), поведение животного. В конце опыта от пяти телят каждой группы берут пробы крови для гематологических исследований. В крови определяют содержание гемоглобина с помощью гемометра Сали, форменных элементов крови в счетной камере Горяева, лейкоцитарную формулу общепринятым методом, концентрацию общего белка в сыворотке крови рефрактометрически, содержание иммуноглобулинов с помощью цинксульфатного теста, содержание лизоцима по Э.В.Ермолаевой, бактерицидную активность по С.В.Смирновой и Т.А.Кузьминой. Результаты исследований представлены в табл.5.

Как видно из табл. 5, применение пробиотика Ирилис не оказывает существенного влияния на концентрацию в крови гемоглобина, количество форменных элементов крови и лейкоцитарную формулу. Вместе с тем в крови у телят, получавших препарат, существенно возрастает уровень общего белка в сыворотке крови, иммуноглобулинов, лизоцима и бактерицидной активности сыворотки крови.

Было установлено, что Ирилис не оказывает отрицательного влияния на здоровье животных, а существенно повышает их резистентность к желудочно-кишечным болезням улучшает качество жизни телят, они не теряют в весе. (Табл.6).

Как видно из табл.6, в контрольной группе, не получавшей Ирилис, заболело 15 из 20 телят, что составляет 75% от числа животных в группе, а в первой опытной группе (1 доза Ирилиса 1 раз в день) - 11 из 40 телят (27,5%), во второй опытной группе (2 дозы Ирилиса 1 раз в день) - 7 из 40 телят (17,5%). Профилактическая эффективность пробиотика Ирилис составляет 72,5% и 82,5% соответственно. При этом телята контрольной группы заболевают уже на 2 и 9 дни, и болезнь протекает в основном в тяжелой форме, в результате отход составляет 30%, а сохранность - 70%. Применение препарата Ирилис в количестве не менее 2 доз нецелесообразно, что подтверждается высокими процентами сохранности телят и среднесуточного привеса массы тела, соответственно равных 95% и 9%.

Табл.5Исследования основных показателей крови 2-месячных телят, после проведения профилактических мероприятийПоказателиГруппы телятОпытная 1, n=40Опытная 2, n=40Контрольная 3, n=20Гемоглобин, г/л127,0±13,6132,7±4,0126,0±3,0Эритроциты,7,2±0,27,4±0,47,2±0,2Лейкоциты,6,4±1,06,3±0,96,8±0,7Общий белок, г/л62,1±1,670,5±1,761,0±2,6Иммуноглобулины общие, г/л29,4±1,938,0±2,127,4±1,7Лизоцим, мкг/л770,0±31,0980,0±22,0765,0±33,0Бактерицидная активность, %67,0±0,586,5±2,060,2±1,7Лейкоцитарная формула, %:Базофилы---Эозинофилы433Нейтрофилы:- юные---- палочкоядерные332- сегментоядерные252324Лимфоциты666869Моноциты232

Табл.6Профилактическая эффективность Ирилиса при выращивании телят-молочниковПоказателиГруппы телятПервая, n=40Вторая, n=40Третья, n=20Заболело, гол. (%)11(27,5)7(17,5)15 (75,0)В возрасте, дней3,5±0,33,5±0,11,5±0,2 (6 гол.)
8,5±0,8 (9 гол.)Течение болезни, гол. (%)   - легкое4 (10,0)5 (12,5)5 (25,0)- тяжелое7 (17,5)2 (5,0)10 (50,0)Пало в период наблюдения, гол. (%)2 (5,0)-4 (20,0)Вынуждено убито, гол. (%)6 (20,0)2 (5,0)2 (10,0)Сохранность, гол. (%)32 (80,0)38 (95,0)14 (70,0)Среднесуточный прирост массы тела, г (%)665,0±39,0 (104,0)700,0±27,0 (109.4)640,0±25,0 (100,0)

Пример 8. Эффективность применения препарата Ирилис для профилактики желудочно-кишечных болезней с симптомокомплексом диарей определяют в условиях хозяйства, длительно неблагополучного по этим заболеваниям, в сравнении с препаратами пектосорбин и иммуноглобулином. Из 105 новорожденных телят формируют три группы по 35 гол. в каждой. Все животные здоровы, нормально развиты, а разница между группами по средней живой массе не превышает 2%.

Телятам первой группы за 20-30 мин до второй выпойки молозива дают препарат Ирилис (2 дозы), телятам второй группы - пектосорбин в соответствии с наставлением по его применению, телятам третьей группы вводят неспецифический иммуноглобулин внутримышечно согласно наставлению по его применению.

Курс профилактики по группам составляет: в первой группе - 10 дней, во второй - 10 дней, в третьей - 50 дней. Период наблюдения - 60 дней. Телят взвешивают при рождении, через один месяц и в конце периода наблюдения. Ежедневно учитывают клиническое состояние, обращая внимание на количество заболевших животных, течение и исход болезни. Результаты исследований представлены в табл.7

Как видно из табл.7, эффективность пробиотика Ирилис в сравнении с известными препаратами пектосорбином и иммуноглобулином, значительно выше, что подтверждается показателями сохранности и среднесуточного роста массы тела.

Табл.7.Сравнительная эффективность применения Ирилиса и известных препаратов для профилактики желудочно-кишечных болезней, вызываемых «хлевной» микрофлорой у новорожденных телятПоказателиГруппы телятПервая, n=35Вторая, n=35Третья, n=35Способ профилактикиирилиспектосорбинИммуноглобулинЗаболело телят, гол.287Из них пало, гол.-53ДиагнозДиспепсияТоксическая диспепсияТоксическая диспепсияТечение болезни, гол.: - тяжелое-54- легкое233Профилактическая эффективность, %94,377,180,0Сохранность, %100,080,091,4Среднесуточный рост массы тела, г820,0680,0660,0

Пример 9. Проводят испытания по включению в традиционную схему кормления пробиотического препарата Ирилис в птицеводстве при выращивании цыплят-бройлеров. Формируют 4 группы цыплят, которые получают:

1 гр. - препарат «Ветом» производства НПФ-ИЦ «Кольцово»,

2 гр. - препарат Ирилис,

3 гр. - препарат СТФ производства ООО «Биоавтоматика»,

4 гр. - препарат «Энтероспорин».

Экспериментальная профилактическая схема по дням выращивания следующая:

1 сутки - пробиотики с кормом,

1-3 сутки - фторхинолон,

4-13 сутки - пробиотики с кормом.

Далее - по действующей в хозяйствах профилактической схеме.

Учет результатов проводят по основным технологическим показателям: вес цыплят на 1, 7, 14, 28, 35 и 42-е сутки и при сдаче на убой; учет падежа каждую неделю и общий - при сдаче на убой. Результаты представлены в табл.8.

Данные, приведенные в табл.8, свидетельствуют, что использование препарата Ирилис в процессе выращивания цыплят позволяет получить высокий результат по сохранности поголовья, препарат Ирилис оказывает положительное действие на организм цыплят, обеспечивая больший прирост живой массы по сравнению с контролем.

Таким образом, проведенные испытания препарата Ирилис показали возможность и высокую эффективность его применения при выращивании животных и птицы. Он обеспечивает ингибирование патогенных эшерихий, поддержание оптимального микробного баланса в пищеварительном тракте, повышение неспецифической резистентности животных, их сохранность и прирост массы тела, оказывает профилактический лечебный эффект при заболеваниях, сопровождающихся диареей, и обеспечивает профилактику дисбактериоза. Преимуществом препарата Ирилис является является хромосомная резистентность к антибиотикам составляющих его штаммов, что делает возможным его применение в комплексе противомикробной терапии.

Табл.1Культурально-морфологические и биохимические свойстваСвойстваB.subtilis ВКПМ №В-8611B.licheniformis ВКПМ №В-8610Рост в анаэробных условиях-+Ферментация  глюкозы++арабинозы++ксилозы+-маннита++Утилизация цитрата++Утилизация пропионата-+Гидролиз крахмала++Гидролиз мочевины--Редукция нитратов++Образование газа из NO₃ ^- в анаэробных условиях-+Обесцвечивание метиленовой сини++Аргининдигидролаза-+Лецитиназа--Гиалуронидаза--Гемолитическая активность--Образование глобул поли-β-оксимасляной кислоты на глюкозном агаре  

Таблица 2Антибиотикочувствительность штаммов рода BacillusИзучаемый препаратДиаметр зон задержки роста культур, ммB.subtilis 07B.licheniformis 09ПЕНИЦИЛЛИНЫ  Азлоциллин19±0,116±0,1Амоксициллин19±0,216±0,1Ампициллин11±0,20Карбенициллин23±0,520±0,1Мезлоциллин21±0,215±0,2Метициллин20±0,110±0,1Оксациллин15±0,311±0,1Бензилпенициллин7±0,13±0,2Пиперациллин15±0,311±0,1Тикарциллин25±0,421±0,2КАРБАПЕНЕМЫ  Имипенем38±0,230±0,1ЦЕФАЛОСПОРИНЫ  Моксалактам11±0,212±0,3Цефалотин35±0,121±0,3Цефазолин25±0,219±0,2Цефамандол35±0,315±0,1Цефокситин18±0,113±0,1Цефоперазон15±0,213±0,1Цефотаксим15±0,19±0,1Цефтазидим6±0,313±0,2Цефтизоксим3±0,111±0,1Цефтриаксон20±0,412±0,2Цефуроксим2±0,13±0,1АМИНОГЛИКОЗИДЫ  Амикацин22±0,317±0,2Гентамицин25±0,319±0,2Канамицин22±0,221±0,1Тобрамицин25±0,120±0,2ДРУГИЕ  Ванкомицин12±0,110±0,1Клиндамицин9±0,212±0,1Тетрациклин26±0,124±0.1Хлорамфеникол18±0,310±0,1Полимиксин Е11±0,110±0,2Нитрофурантоин15±0,220±0,1Триметоприм23±0,125±0,2Бактрим29±0,231±0,3Норфлоксацин24±0,225±0,2Налидиксовая кислота21±0,115±0,1

Табл.3Антагонистическая активность вариантов биопрепарата Ирилис Тест-культурыВарианты биопрепарата (соотношение
B.subtilis: B.licheniformis)×10^8-6 КОЕ/мл1:12:15:11:1010:1 Staphylococcus aureus (n=20)10-1515-2015-2015-2018-20 Proteus vulgaris (n=18)10-1515-2015-2015-2015-20 Proteus mirabilis (n=15)15-1818-2018-2018-2018-20 Candida albicans (n=20)25-3025-3025-3025-3025-30 Escherihia coli (n=18)20-2222-2522-2522-2522-25 Shigella sonne (n=25)10-1212-1512-1512-1512-15 Streptococcus (n=17)10-1212-1512-1512-1512-15

Изобретение относится к биотехнологии и касается создания новых пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus, которые могут быть использованы для профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза животных и птицы. Новые штаммы B.subtilis 07 (ВКПМ №В-8611) и B.licheniformis 09 (ВКПМ №В-8610) характеризуются широким спектром антагонистической активности, высокой протеолитической и амилазной активностью и выраженной способностью к продукции лизоцима, не конкурируют друг с другом, а вступают в синергидные отношения, что проявляется в повышении антагонистического действия биопрепарата. Биопрепарат содержит штаммы Bacillus subtilis ВКПМ №В-8611 и Bacillus licheniformis ВКПМ №В-8610 в эффективном количестве и защитную среду. Биопрепарат может дополнительно содержать растворитель и/или наполнитель. Биопрепарат обладает более высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и устойчивостью к целому ряду антибиотиков. Проведенные испытания препарата Ирилис показали возможность и высокую эффективность его применения при выращивании животных и птицы. Он обеспечивает ингибирование патогенных эшерихий, поддержание оптимального микробного баланса в пищеварительном тракте, повышение неспецифической резистентности животных, их сохранность и прирост массы тела, оказывает профилактический лечебный эффект при заболеваниях, сопровождающихся диареей, и обеспечивает профилактику дисбактериоза. Преимуществом препарата Ирилис является хромосомная резистентность к антибиотикам составляющих его штаммов, что делает возможным его применение в комплексе противомикробной терапии. 11 з.п. ф-лы, 8 табл.

1. Биопрепарат ветеринарного назначения, содержащий живую микробную массу штаммов Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis и защитную среду, отличающийся тем, что из штаммов Bacillus subtilis он содержит штамм Bacillus subtilis ВКПМ №В-8611, а из штаммов Bacillus licheniformis - Bacillus licheniformis ВКПМ №В-8610, взятые в эффективном количестве.2. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит наполнитель.3. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что в качестве наполнителя он содержит протеин, органический полимер, молоко, сыворотку, альбумин, сахарозу, лактозу, стеарат кальция, глюкозу, гидрокарбонат натрия, гидроокись алюминия, метилцеллюлозу, тальк, кондитерский жир, парафин, ланолин, масло какао, гель гидроокиси алюминия.4. Биопрепарат по п.3, отличающийся тем, что из органических полимеров он содержит декстраны, полиглюкин, крахмал, поливинилпирролидон.5. Биопрепарат по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит растворитель.6. Биопрепарат по п.5, отличающийся тем, что в качестве растворителя он содержит дистиллированную или кипяченую воду, физиологический раствор.7. Биопрепарат по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он лиофильно высушен.8. Биопрепарат по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он гранулирован.9. Биопрепарат по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он заключен в полимерную капсулу.10. Биопрепарат по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он таблетирован.11. Биопрепарат по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он представлен в форме свечей или суппозиторий.12. Биопрепарат по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что смешан с компонентами корма.