ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS LICHENIFORMIS, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИВИРУСНОЙ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/10 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, ветеринарии и касается получения штаммов пробиотиков.

Пробиотики - биопрепараты на основе живых бактерий, представителей нормальной микрофлоры, которые применяются в лечебной практике для коррекции нарушений микробиоценоза пищеварительного и урогенитального тракта.

Известно, что аэробные спорообразующие бактерии характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных бактерий, что позволяет использовать их в составе пробиотиков. Среди пробиотиков, широко применяемых в медицинской и ветеринарной практике, все большее распространение получают препараты, основой которых являются бактерии рода Bacillus.

В медицине уже нашли широкое применение пробиотики из бацилл: это югославский препарат бактисубтил, цериобиоген (Китай), флонивин (Франция), энтерогермин (Италия) и т.п. [1-5]. Известен и отечественный препарат биоспорин на основе живых микробных культур Bacillus sybtilis 3 и Bacillus licheniformis 31 для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека [6] . Однако все перечисленные выше пробиотики не обладают ярко выраженной противовирусной активностью.

Наиболее близким аналогом в данной области является штамм Bacillus subtilis ВКПМ-475 [2] , который получен путем трансформации исходного штамма плазмидой pBMB 105 [8]. Полученный рекомбинант приобрел антивирусную активность за счет продукции интерферона, колируемого плазмидой, сохранив при этом антибактериальную активность родительского штамма [2]. Однако бактерии Bacillus subtilis являются облигатными аэробами и не могут осуществлять свою жизнедеятельность в условиях с пониженным содержанием кислорода. В этих условиях наблюдается лизис бактерий. Известно, что многие участки внутренних полостей организма отличаются по содержанию кислорода, что ограничивает активность Bacillus subtilis при введении в макроорганизм в составе препарата пробиотика.

Технической задачей изобретения является получение штамма бацилл, безвредного для теплокровных, способного наряду с давлением патогенной и условно патогенной микрофлоры продуцировать антивирусный агент - альфа-2-интерферон в микроаэрофильных условиях.

Известен бактериальный штамм Bacillus licheniformis 31 [7], характеризующийся антагонистической активностью в отношении ряда патогенных и условно патогенных бактерий и являющийся факультативным аэробом. Благодаря этому он способен расти и проявлять антимикробные свойства в условиях с пониженным содержанием кислорода, но не обладает выраженной антивирусной активностью.

Поставленная задача решается путем трансформации штамма Bacillus licheniformis 31 плазмидой pBMB 105, кодирующей синтез альфа-2-интерферона человека.

Получение компетентных клеток и трансформацию плазмидной ДНК проводят известным методом [3]. Трансформанты высевают на чашки с селективной средой, содержащей канамицин (10 мкг/мл) и выращивают при 37^oC 24 часа. Сконструированный штамм Bacillus licheniformis 2336/105 характеризуется следующими признаками:
Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. Окраска по Граму - грамположительны.

Культуральные признаки.

Штамм хорошо растет на мясо-пептонном агаре (МПА), сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре, а также на этих средах с добавлением 10 мг/мл канамицина, образуя блестящие складчатые колонии кремоватого цвета с неровными краями. На мясо-пептонном бульоне (МПБ) культура образует равномерную муть. Оптимальная температура роста - 37^oC, pH - 7,0. Культуру поддерживают на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с периодическими пассажами не реже 1 раза в месяц, а хранят на МПА и картофельном агаре с добавлением 50 мкг/мл канамицина.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм растет в аэробных условиях, не гидролизует мочевину. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Растет в присутствии 10% NaCl. Гидролизует крахмал и казеин, разжижает желатину. При росте на МПБ образует аммиак, не образует сероводород и индол. Ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитиназной активностью не обладает. Обладает липазной активностью.

Для культивирования Bac. licheniformis 2336/105 применяют среду следующего состава:
K₂HPO₄ • 3H₂O - 18,3 г/л
KH₂PO₄ (б/в) - 6,0 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2,0 г/л
Na₃C₆H₅O₇ • 5,5H₂O - 1,2 г/л,
pH - 7,0(0,15)
Антивирусную активность нового сконструированного штамма определяют по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита мышей (EMC) в микроаэрофильных условиях в сравнении с антивирусной активностью родительского штамма Bacillus licheniformis 31 и прототипного рекомбинантного Bacillus subtilis ВКПИ 475.

Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью референс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона и выражают в международных единицах (ME).

Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что образцы культуральной жидкости штамма Bacillus licheniformis 2336/105 при выращивании в микроаэрофильных условиях обладают антивирусной активностью в отличие от штаммов-аналогов.

Сконструированный штамм характеризуется также высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, как и исходная культура Bacillus licheniformis 31 (табл. 2).

Безвредность нового штамма Bacillus licheniformis изучают стандартными методами, оценивая токсичность фильтрата культуры (результаты представлены в таблице 3.1. ), вирулентность (табл. 3.2), токсичность (табл. 3.3) в сравнении с контролем (табл. 3.4) и проводя наблюдения за животными.

Введение суспензии живых клеток 24-часовой культуры перорально в дозах 1-10 млрд. микробных клеток и внутрибрюшинно в дозах 1-10 млрд. микробных клеток/на мышь не вызывает у животных каких-либо признаков заболевания. Изучение внутренних органов животных не выявляет у них патологических изменений, регистрируемых микроскопически.

Введение мышам фильтратов среды роста (после культивирования штамма Bacillus licheniformis 2336/105 на мясо-пептонном бульоне) не выявляет у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.

Таким образом, полученные данные дают основание отнести сконструированный штамм к 4-му классу по классификации, приведенной в методических указаниях МЗ СССР, главного санитарно-эпидемиологического управления "Постановка исследований для обоснования предельно допустимых концентраций производственных штаммов и на их основе готовых форм препаратов...", /М., 1983/, т.е. к микроорганизмам, практически не обладающим аллергенным и общетоксическим действием.

Стабильность рекомбинантной плазмиды pBMB 105 в штамме Bacillus licheniformis 2336/105 определяют следующим образом: клетки Bacillus licheniformis 2336/105 выращивают в 5 мл среды 2xLB с крахмалом до стационарной фазы; затем 0,5 мл выросшей культуры переносят в 4,5 мл свежей среды 2xLB и вновь выращивают до стационарной фазы; проводят 5 пересевов, причем после каждого пересева проводят высев на МПА без антибиотика. Выросшие изолированные колонии перекапывают на чашки с МПА с канамицином и без антибиотика на нитроцеллюлозный фильтр. После подкрашивания подсчитывают и сравнивают число колоний, выросших на МПА с антибиотиком и без антибиотика. Таким образом определяют количество клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду после каждого пересева. Отсутствие плазмиды подтверждают методом выделения плазмидной ДНК.

Сохранность гена интерферона человека типа альфа-2 в рекомбинантной плазмиде pBMB 105 после пересевов подтверждают методом гибридизации: нитроцеллюлозные фильтры с отпечатками колоний после пересевов инкубируют с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона альфа-2, выделенным из плазмиды pBMB 105. Все клоны, не потерявшие рекомбинантные плазмиды после пересевов, гибридизуются с меченым фрагментом, что свидетельствует о сохранности гена интерферона в составе плазмиды pBMB 105. Кроме того, из случайно отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК и анализируют ее с помощью эндонуклеаз рестрикции. В результате описанных экспериментов установлено, что рекомбинантная плазмидная ДНК рBMB 105 сохраняется и наследуется в течение 5 пересевов на МПА без селективного давления.

Таким образом, впервые получен штамм бактерий Bacillus licheniformis 2336/105, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью в микроаэрофильных условиях, который может служить основой для создания препаратов, используемых для лечения и профилактики инфекционных заболеваний смешанной этиологии у животных и человека.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения:
Пример 1. Получение штамма Bacillus licheniformis 2336/105. Трансформацию штамма Bacillus licheniformis 31 плазмидой pMB 105 проводили стандартным методом [3]. Для выделения плазмид из штаммов бацилл известная методика [9] была модифицирована. Изменения были введены на основании экспериментов по изучению влияния различных составов лизирующих буферов и времени обработки клеток бацилл для достижения более полного лизиса и максимального выхода плазмидной ДНК. Период инкубации с лизоцимом был увеличен с 20 мин до 40 мин.

Пример 2. Определение антивирусной активности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.

Для определения антивирусной активности штамма, детерминируемой интерфероном, готовят опытные образцы культуральной жидкости.

Для сравнения и в качестве контроля используют штаммы-аналоги: родительский Bacillus licheniformis 31 и рекомбинантный Bacillus subtilis ВКПМ-475.

Для приготовления опытных образцов по три случайно отобранных клона выращивают в 450 мл жидкой питательной среды 2xLB с крахмалом и с канамицином (дрожжевой экстракт, 10 г/л; бактотриптон, 20 г/л; растворимый крахмал, 10 г/л; сернокислый аммоний, 1 г/л; калий фосфорно-кислый двузамещенный, 7 г/л; калий фосфорно-кислый однозамещенный, 2 г/л; канамицин, 50 мкг/мл) при температуре 37^oC в течение 16-18 часов при разных уровнях аэрации: в аэробных и микроаэрофильных условиях. Клетки центрифугируют при 800 об/мин при 4^oC. К 400 мл супернатанта добавляют 25 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), помещают в лед на 2,5-3 часа. Затем центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 20 мин при 4^oC. Осадок подсушивают на воздухе 15 мин и растворяют в 5 мл буфера HN (110 mM Hepes, 33 mM NaCl; pH-7,4), содержащего 1 mM фенилметансульфонилфторида (PMSF) и 1 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). При растворении контролируют pH раствора до 7,4, при необходимости добавляя концентрированный раствор HCl. Полученный раствор диализуют против HN- буфера, содержащего ЭДТА, при 4^oC в течение 6 часов при двухкратной смене и помещают по 5 мл в стерильные пробирки по 0,5 мл, замораживают жидким азотом и хранят при -20^oC.

Антивирусную активность определяют по ингибированию цитопатического действия вируса EMC (энцефаломиокардита мышей). Суспензию диплоидных клеток фибробластов человека (ДФЧ) ДК-58 доводят до концентрации 2 х 10 кл/мл ростовой средой. В каждую лунку полистированного планшета вносят по 100 мкл (2 х 10 клеток) суспензии ДФЧ в ростовой среде и инкубируют при 37^oC до формирования монослоя клеток. Под микроскопом сформировавшийся монослой клеток похож на мозаику, образовавшуюся вытянутыми игольчатыми клетками. После монослоя отсасывают ростовую среду, в первую лунку вносят 20 мкл титруемого образца и 180 мкл ростовой среды, после осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносят во вторую, смешивают со 100 мкл ростовой среды и т.д. Клетки выдерживают 24 часа при 37^oC и после этого вносят 100 тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение в половине проб, вируса EMC и выдерживают при 37^oC 24-48 часов. Через 1 сутки проводят первый учет, через 2 суток - второй. Величину антивирусной активности в исследуемых образцах определяют методом сравнения с антивирусной активностью референс-препарата, в качестве которого используют препарат реаферона, и выражают в международных единицах (ME). Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что образцы культуральной жидкости штамма Bacillus licheniformis 2336/105 при выращивании в микроаэрофильных условиях обладают антивирусной активностью в отличие от штаммов-аналогов.

Пример 3. Определение антагонистической активности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.

Антагонистическую активность исследуют методом радиальных штрихов [4]. 18-часовую культуру Bacillus licheniformis 2336/105 высевают в центр чашки диаметром 12 см на площадь, очерченную кругом диаметром 2,5 см. Через 3 суток инкубирования при 28^oC подсевают по радиальным штрихам тест-культуры на бактериальной суспензии 5 х 10 кл/мл. Зоны отсутствия роста учитывают через 18-24 часа инкубирования. Контролем служат чашки без культуры B.licheniformis.

результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о сохранении антагонистических свойств у рекомбинантного штамма по сравнению с исходным родительским штаммом.

Пример 4. Изучение безвредности штамма Bacillus licheniformis 2336/105.

Безвредность штамма изучают стандартными методами, оценивая токсичность фильтрата культуры (табл. 3.1), вирулентность (табл. 3.2.), токсичность (табл. 3.3), сравнивая с контролем (табл. 3.4) и проводя наблюдения за животными.

Наблюдения за животными проводят на протяжении 15 дней после окончания курса инъекций или перорального введения. В период наблюдений все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменения массы тела животных в опыте и контроле была сходной. Все подопытные и контрольные животные после окончания срока наблюдения были умерщвлены, вскрыты и их органы подвергнуты микроскопическому изучению.

Результаты вскрытия показали следующее:
Сердце - обычной формы и величины; у подопытных животных такое же, как и у контрольных.

Легкие - по объему, строению долей у подопытных и контрольных животных одинаковые; поверхности легких гладкие, доли легко отделяются друг от друга, спаек не отмечено.

Желудок, петли тонкого и толстого кишечника - внешне обычные, признаков воспалительных изменений не отмечено. При вскрытии просвета виден неизмененный (такой же, как и у контрольных животных) рисунок слизистых.

Печень - темно-красного цвета, среднего кровенаполнения, не увеличена. Доли отделены друг от друга, поверхности гладкие.

Почки - по размерам и форме не отличаются у контрольных и подопытных животных, поверхности гладкие, на разрезе виден четкий рисунок коркового и мозгового вещества.

Селезенка - не увеличена, обычной консистенции. На разрезе пульпа умеренно полнокровна, темно-красного цвета.

Результаты экспериментов свидетельствуют о безвредности штамма Bacillus licheniformis 2336/105 для теплокровных.

Литература:
1. Смирнов В.В., Резник С.Р. и др. //Микробиол.журнал, 1993, Т. 55, N 4 с. 92-112.

2. Патент РФ 1839459, кл. C 12 N 1/21, 1990 г.

3. Chang S. , Gray O., Ho D. et.al. //Molecular Cloning and Gene Regulation in Bacillus. Acad. press, 1982, p. 159-169.

4. Егоров Н.С - Основы учения об антибиотиках. Высшая школа. М., 1969, с. 176.

5. Смирнов В.В., Резник С.Р. и др. //Микробиол.журнал 1992, Т. 54, N 6, с. 82-94.

6. А.с.СССР 1722502, кл. A 61 K 39/02, 1989г.

7. Вьюницкая В.А. // Биологические свойства B.subtilis и B.licheniformis в связи с их использованием для создания препарата Бактерин-СЛ: Автореф. дис.канд. биол. наук. - Киев, 1988.

8. Щелкунов С. Н. , Ильичев А.А., Красных В.Н. и др. // Биотехнология, 1987, Т.3, N 2. с. 146-150.

9. Бациллы. Генетика и биотехнология. //Под редакцией К.Харвуда, М., "Мир", 1992, с. 460.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения штаммов пробиотиков. Клетки штамма Bacillus licheniformis 31 трансформируют плазмидой рВМВ 105 и получают новый рекомбинантный штамм Bacillus licheniformis 2336/105. Данный штамм безвреден для теплокровных, способен наряду с подавлением патогенной и условно-патогенной микрофлоры продуцировать альфа - 2-интерферон в микро-аэрофильных условиях в количестве 102 МЕ/мг. Сконструированный штамм позволяет составить основу для нового пробиотического противоинфекционного препарата. 6 табл.

Рекомбинантный штамм бактерий Bacillus licheniformis 2336/105, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью.