Изобретение относится к способам проведения анализа на присутствие гидролазной активности (т.е. гидролитических ферментов) в образце или препарате. В частности, настоящее изобретение относится к способу обнаружения кандидоза путем проведения анализа на присутствие в образце ферментативно активной аспарагиновой протеазы.
Предшествующий уровень техники
Candida albicans и другие виды Candida вызывают ряд широко распространенных и с медицинской точки зрения серьезных инфекций. Так, например, кандидоз пищеварительной системы часто встречается у пациентов с иммунодефицитом. Кроме того, вульвовагинальный кандидоз является одним из наиболее распространенных заболеваний в акушерстве и гинекологии. По оценкам специалистов было установлено, что приблизительно три четверти взрослых женщин страдает по крайней мере от одного из этих заболеваний. (De. Bernardis et al., J. Clin Microbiol 27(11):2598-2603 (1989)). В результате такой широкой распространенности заболеваний кандидозом были проведены многочисленные исследования, которые привели к выявлению этиологии кандидоза.
Эти исследования показали, что этиологическим фактором возникновения кандидоза у человека являются грибы вида Candida albicans и других видов Candida; причем в настоящее время считается, что возникновение кандидоза в основном обусловлено присутствием Candida albicans. Кроме того, получены данные, свидетельствующие о роли аспарагиновой протеазы или (что одно и то же) кислой протеиназы как фактора вирулентности Candida albicans. Известно, что чистые культуры Candida albicans выделяют аспарагиновую протеазу при культивировании в конкретно определенных условиях. Известно также, что чистые штаммы Candida albicans, полученные от женщин с симптоматическим вульговагинитом, секретируют указанный фермент после культивирования этих штаммов в специально подобранной культуральной среде.
Антиген кислой протеиназы Candida albicans, т.е. антиген аспарагиновой протеазы, был обнаружен иммунологически в вагинальных выделениях женщин, от которых был выделен вульвовагинальный Candida albicans (De Bernardis et al., Abstracts N F-91, в "Abstracts of Annual Meeting of the American Society for Microbiology Micro, (Anaheim, CA 1990)). Однако у пациентов с симптоматическим вульвовагинальным кандидозом концентрация антигена кислой протеиназы Candida albicans значительно выше, чем у бессимптомных носителей. Концентрация этого антигена в вагинальных выделениях женщин, страдающих кандидозом, составляет приблизительно 176 ± 15,2 нг/мл, тогда как его концентрация у женщин, у которых не был выделен Candida albicans, т.е. у женщин, не страдающих клиническим кандидозом, составляет менее чем 2 нг/мл. Бессимптомные носители Candida albicans имеют промежуточные уровни антигена 94 ± 18,5 нг/мл. Эти данные явно свидетельствуют о том, что кислая протеиназа (т.е. аспарагиновая протеаза) участвует в патогенезе вульвовагинального кандидоза. Однако известно, что аспарагиновая протеаза Candida albicans нестабильна при температурах тела. Кроме того, иммунологическое обнаружение антигена аспарагиновой протеиназы не позволяет определить, присутствует ли данный фермент в ферментативно активной форме.
Кислая протеиназа Candida albicans представляет собой внеклеточную аспарагиновую протеазу. Аспарагиновые протеазы являются одним из обширных классов протеаз. Они содержат один или несколько ключевых остатков аспарагиновой кислоты, ответственных за ферментативную активность. Аспарагиновая протеаза Candida albicans обладает широкой специфичностью к белковому субстрату, например к альбумину, гемоглобину, казеину, иммуноглобулину A и многим другим белкам. Этот фермент оптимально действует в кислых условиях (т.е. при pH 2,5-5,5) и быстро инактивируется при высоких pH (т.е. при pH 7,5). Аспарагиновая протеаза Candida albicans сильно ингибируется пепстатином, но не ингибируется тиоловыми реагентами, хелаторами или ингибиторами сериновых протеаз.
Многие фармацевтические компании и ведущие ученые проводят исследования с целью изучения ингибиторов аспарагиновых протеаз и их возможного терапевтического использования. Однако эти исследования связаны с определенными трудностями из-за отсутствия подходящего ферментного анализа для аспарагиновых протеаз. Для некоторых сериновых, тиоловых, металло-, кислых и щелочных протеаз и пептидаз существуют простые колориметрические анализы, однако эти анализы не могут быть использованы для аспарагиновых протеаз. Субстратная специфичность этого особого класса ферментов требует присутствия нескольких гидрофобных аминокислот. Это свойство указанных ферментов создает значительные трудности в поиске простых синтетических хромогенных субстратов, поскольку гидрофобные аминокислоты, которые служат в качестве субстрата для аспарагиновых протеаз, как известно трудно растворяются в воде. Поэтому хромогенные субстраты для аспарагиновых протеаз не изготавливаются промышленностью, их трудно синтезировать и охарактеризовывать, и они плохо растворяются в воде. В результате этих ограничений ферментативная активность, определяемая указанными хромогенными субстратами, является исключительно низкой, а поэтому колориметрические анализы абсолютно нечувствительны для аспарагиновой протеазы. Аналогично этому были описаны флуорогенные субстраты для аспарагиновых протеаз, но и они также имеют ограниченное применение. Во-первых, как уже упоминалось выше, субстратная специфичность этого класса ферментов требует присутствия нескольких гидрофобных аминокислот, в результате чего указанные субстраты являются практически нерастворимыми. Во-вторых, при достижении низких концентраций, указанные флурогенные субстраты гидролизуются очень медленно, а поэтому флуорогенные анализы требуют больших временных затрат. Кроме того, многие биологические препараты содержат флуоресцентные вещества, которые могут служить помехой при флуорогенном анализе на присутствие аспарагиновых протеаз.
Из-за отсутствия подходящих колориметрических или флуорогенных анализов для обнаружения аспарагиновых протеаз, обычно используют ультрафиолетовый (УФ) спектрофотометрический метод анализа. При типичном УФ-спектрофотометрическом методе анализа, аспарагиновую протеазу добавляют к раствору белка (например, такого как гемоглобин или альбумин), и полученную смесь инкубируют при 30 - 37oC в течение 0,5-4 часов. После инкубирования, к охлажденной инкубационной смеси добавляют холодную концентрированную трихлоруксусную кислоту (TCA) для осаждения негидролизованного белка, а пептиды, абсорбирующие ультрафиолетовый свет, остаются в растворе. И, наконец, осажденный негидролизованный белок центрифугируют в течение примерно 1 часа при температурах охлаждения, после чего супернатант отсасывают и для оценки степени гидролиза белка определяют оптическую плотность (ОП) при 280 нм. Хотя этот анализ и может быть использован для определения аспарагиновых протеаз, однако он является трудоемким и требует большого количество времени.
Поэтому можно сказать, что на сегодняшний день не существует какого-либо удобного, простого и оперативного метода обнаружения присутствия ферментативно активных аспарагиновых протеаз. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия ферментативно активных аспарагиновых протеаз, который позволяет решить проблемы, связанные с недостатками предшествующих методов анализа. Кроме того, способы настоящего изобретения могут быть также использованы для обнаружения присутствия других гидролитических ферментов, т.е. гидролаз.
Краткое описание изобретения
Было обнаружено, что ферментативно активная аспарагиновая протеаза Candida albicans присутствует в вагинальных выделениях женщин с вульвовагинальным кандидозом. Кроме того, было установлено, что присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы в образце или препарате может служить индикатором для обнаружения и диагностики кандидоза. В соответствии с этим был разработан способ обнаружения кандидоза путем проведения анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы в образце.
В этом способе образец, например вагинальные выделения, подвергают контакту с твердым носителем. На этом твердом носителе, т.е. носителе, с которым контактирует данный образец, иммобилизуют фермент-репортер (т.е. сигналгенерирующий фермент). Причем указанный фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе, отделяется от указанного твердого носителя под действием ферментативно активной аспарагиновой протеазы, если эта ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в данном образце. После того, как образец был подвергнут взаимодействию с твердым носителем, он объединяется с индикатором. Индикатором является любое химическое вещество, способное к видимому или обнаруживаемому изменению (например, такому как изменение окраски) под действием фермента-репортера. Если после контакта с образцом, индикатор подвергается обнаруживаемому изменению, то ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в данном образце, а следовательно, может быть поставлен диагноз кандидоза.
До настоящего изобретения не существовало быстрых и прямых способов анализа на присутствие ферментативно активных аспарагиновых протеаз или, что более важно, анализа на кандидоз. Для анализа на присутствие активной аспарагиновой протеазы использовались спектрофотометрический, флуорогенный и иммунологический анализы, однако эти анализы являются трудоемкими, занимают слишком много времени и могут быть использованы лишь в клинических условиях специально обученным персоналом. Аналогичным образом Candida albicans может быть обнаружена путем культивирования препарата в определенной среде или с помощью микроскопического исследования влажного препарата. Процесс культивирования требует очень много времени (т.е. она занимает около 48 часов), и для осуществления обеих указанных операций необходимо дорогостоящее оборудование и специальная подготовка персонала. В отличие от этих известных способов анализа, заявленный в настоящей заявке способ проведения анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы, и соответственно, на наличие кандидоза, является быстрым, точным, экономически эффективным и простым в применении.
Технология высвобождения фермента-репортера, которая была положена в основу анализа на присутствие аспарагиновой протеазы, может быть также использована для детекции присутствия любого активного гидролитического фермента, включая, (но не ограничиваясь ими), следующие ферменты: протеазы или протеиназы (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидазы, липазы, нуклеазы, гомоолигосахаридазы, гетероолигосахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы и экстеразы. В соответствии с этим в данной работе были также разработаны методы анализа на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы.
В этих методах образец или препарат подвергают контакту с твердым носителем. На этом твердом носителе, с которым контактирует данный образец, иммобилизован фермент-репортер (т. е. сигналгенерирующий фермент). Указанный фермент-репортер иммобилизован на твердом носителе так, что он отделяется от этого твердого носителя под действием гидролазы, если такая ферментативно активная гидролаза присутствует в данном образце. После контакта с твердым носителем, образец взаимодействует с индикатором. Таким индикатором является любое химическое вещество, обладающее способностью к видимому или детектируемому изменению (обычно, изменению окраски) под действием фермента-репортера. Детектируемое изменение индикатора свидетельствует о том, что в данном образце присутствует ферментативно активная гидролаза. И напротив, отсутствие детектируемого изменения в индикаторе указывает на то, что в данном образце ферментативно активная гидролаза отсутствует. Как и в случае анализа на ферментативно активную аспарагиновую протеазу, и, соответственно, кандидоз, заявленные способы анализа на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы являются быстрыми, точными, экономически эффективными и простыми в применении.
Кроме того, технология высвобождения фермента-репортера, которая была положена в основу вышеописанных методов, может быть также использована для анализа на присутствие ингибитора любого известного гидролитического фермента, включая, без ограничений, ингибиторы протеаз или протеиназ (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидаз, липаз, нуклеаз, гомоолигосахаридаз, гетероолигосахаридаз, гомополисахаридаз, гетерополисахаридаз, фосфатаз, сульфатаз, нейраминидаз иэстераз. В соответствии с этим в данной работе были разработаны методы анализа на присутствие в образце ингибитора гидролазы.
В этих методах образец или препарат подвергают взаимодействию с твердым носителем. На этом твердом носителе, с которым контактирует данный образец, иммобилизован фермент-репортер (т.е. сигналгенерирующий фермент). Указанный фермент-репортер иммобилизован на твердом носителе таким образом, что он отделяется от твердого носителя под действием целевой гидролазы при условии, что указанная целевая гидролаза не инактивируется в присутствии ингибитора гидролазы. После того, как образец был подвергнут контакту с целевой гидролазой и ферментом-репортером, он реагирует с индикатором. Индикатором является любое химическое вещество, способное к детектируемому изменению, обычно изменению окраски под действием фермента-репортера, если указанный фермент-репортер был отделен от твердого носителя посредством целевой гидролазы. В случае, если ингибитор целевой гидролазы не присутствует в образце, то целевая гидролаза будет способствовать отделению фермента от носителя, вызывая тем самым детектируемое изменение индикатора. И напротив, если ингибитор целевой гидролазы присутствует в образце, то он будет ингибиторовать целевую гидролазу, и фермент-репортер не будет отделяться от твердого носителя, а поэтому детектируемые изменения или ответ индикатора не будут наблюдаться. Как и в случае вышеописанных методов, заявленные методы обнаружения присутствия ингибитора гидролазы в образце являются быстрыми, точными, экономически эффективными и простыми в применении.
Помимо методов анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы и других активных гидролитических ферментов, настоящее изобретение относится к автономному устройству, предназначенному для анализа образца на наличие кандидоза путем обнаружения присутствия ферментативно активной аспарагиновой протеазы. Кроме того, было также разработано сухое, автономное устройство, предназначенное для анализа на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы. Эти испытательные устройства объединяют фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе, индикатор и один или несколько других реагентов в сухом виде, которые находятся на пластинчатой панели с внутренней камерой, причем эта камера является пустой до тех пор, пока вовнутрь не будет помещен образец. Для удобства, части панели и расположения функциональных химических материалов на панели описываются исходя из горизонтального положения панели, поскольку именно такое положение обычно имеет панель во время использования. В таком положении панели, в частности, для предпочтительных панелей настоящего изобретения, которые являются тонкими и плоскими, испытуемый образец помещают в указанную камеру через отверстия в верхней части панели. Из всех слоев, образующих панель, самый верхний слой в этом положении, т.е. слой, через который вводят образец будет обозначаться верхним слоем, при этом нижняя поверхность этого слоя образует верхнюю поверхность камеры. Аналогичным образом, самый нижний слой панели будет далее называться нижним слоем панели, при этом верхняя поверхность этого нижнего слоя образует нижнюю поверхность камеры. Тонкие края по периметру верхнего и нижнего слоев будут далее называться боковыми краями панели, а тонкие боковые концы камеры вдоль краев ее верхней и нижней поверхностей будут далее называться боковыми стенками камеры. Участки любой данной поверхности, которые примыкают к любому другому участку в той же самой горизонтальной плоскости, будут далее называться горизонтально смежными, а слои нанесенные непосредственно поверх других слоев, и образующие параллельные горизонтальные плоскости, будут далее называться вертикально смежными.
Верхний, нижний и оба слоя панели изготавливают из пропускающего свет, а предпочтительно прозрачного материала. Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе; индикатор и другие компоненты и реагенты, необходимые для проведения испытания, располагают в одном или нескольких слоях внутри камеры в виде покрытий либо на верхней поверхности камеры, либо на нижней поверхности камеры, либо на обеих поверхностях. Индикатором является любое химическое соединение, способное к детектируемому изменению, обычно к изменению окраски, под действием фермента-репортера в том случае, когда он отделяется от твердого носителя с помощью ферментативно активной гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. Слой, содержащий индикатор, может находиться на верхней или нижней поверхности камеры. Один или несколько реагентов, необходимых для проведения анализа, могут быть включены в тот же самый слой, который содержит индикатор, либо они могут быть включены в отдельные слои, располагающиеся на той же самой поверхности или противоположной поверхности. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, индикатор находится в слое, нанесенном непосредственно под поверхностью светопроницаемой стенки, а фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе, находится в слое, нанесенном на противоположную стенку.
Реагенты, заполняющие указанные слои, могут быть подобраны таким образом, что для осуществления испытания потребуется лишь добавить образец и минимальное количество дополнительных реагентов, например, таких как проявитель. Однако, в особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения, указанные слои содержат все необходимые реагенты, кроме самого образца, так, что для осуществления анализа необходимо лишь добавить образец и ничего более.
Все слои до их контакта с образцом являются твердыми, а слой, содержащий индикатор, предпочтительно представляет собой композицию, которая является нерастворимой в жидком образце, для анализа которого она предназначена, поэтому индикатор остается в этом тонком слое в процессе исследования. Следовательно, для образцов в водной или водорастворимой среде, предпочтительным индикаторным слоем является либо индикатор, который не растворяется в воде, либо индикатор, который содержится в матрице, не растворяющейся в воде. Таким образом, при использовании индикатора, содержащегося в тонком концентрированном слое, нанесенном непосредственно на внутреннюю сторону светопроницаемой стенки, изменение в окраске индикатора, которое наблюдается через светопроницаемую стенку, происходит в короткий период времени, что позволяет получить высокочувствительный и быстрый результат.
Настоящее изобретение может быть адаптировано и использовано для проведения анализа на присутствие различных гидролаз широкого ряда в образцах, взятых из различных источников. Кроме того, настоящее изобретение может быть адаптировано и использовано для проведения анализа на присутствие ингибиторов гидролазы широкого ряда. Испытание может быть проведено с помощью либо одной реакции, либо последовательности реакций, кульминация которых приводит к детектируемому изменению в индикаторе; причем число и типы реагентов и реакций могут соответственно варьироваться от одного теста к другому в зависимости от детектируемой гидролазы. В некоторых случаях, наилучшие результаты могут быть получены, если предварительно нанесенные реагенты распределяются между верхней и нижней поверхностями камеры, при этом они отделены друг от друга зазором до тех пор, пока этот зазор не заполняется испытуемым образцом. В других случаях, реагенты могут находиться в общем слое или в двух или нескольких различных, но вертикально смежных слоях на верхней или нижней поверхности камеры, что никоим образом не отражается на надежности испытания. Однако, во всех случаях, эти слои конструируются и располагаются так, что реакции, кульминация которых приводит к детектируемому изменению индикатора, происходили лишь тогда, когда камера наполняется испытуемым образцом; причем если такое детектируемое изменение индикатора имеет место, то оно по крайней мере, концентрируется в слое, непосредственно примыкающем к светопроницаемой стенке, и предпочтительно ограничивается этим слоем.
В предпочтительных вариантах настоящего изобретения, испытательное устройство включает в себя положительный контроль, отрицательный контроль, либо тот и другой, которые активируются лишь путем добавления образца. Активация этих контрольных реагентов происходит во время проведения испытания, а детектируемые показания (например, изменение окраски или ее отсутствие), представляющие как контроль, так и испытания, индуцируются лишь добавлением образца в устройство, и наблюдаются через светопроницаемую стенку. В данном устройстве, контрольные зоны являются горизонтально смежными и испытательной зоной; причем для идентификации контрольных зон и дифференциации их от испытательной зоны, на нижней или на верхней (предпочтительно на верхней) поверхности устройства имеются соответствующие метки. Сами контрольные зоны обычно состоят из дополнительных слоев, содержащих реагенты или другие подходящие вещества, которые либо непосредственно индуцируют детектируемое изменение в индикаторе, либо препятствуют возникновению такого изменения и которые действуют лишь в присутствии испытуемого образца, причем независимо от того, присутствует или отсутствует "подозреваемая" гидролаза в испытуемом образце. И аналогично, выбор положительного и отрицательного контроля и химических механизмов, с помощью которых они действуют, а также выбор их местоположения (т.е. на поверхности, на которой присутствует индикатор, или на противоположной поверхности камеры) могут варьироваться от одного теста к другому.
В еще более предпочтительном варианте настоящего изобретения предусматривается повышение эффективности испытаний. Для водных образцов, введение поверхностно-активного вещества (ПАВ) в слои, непосредственно примыкающие к зазору, заполняемому образцом, будет стимулировать смачивание слоев образцом и быстрое и однородное заполнение камеры. ПАВ может быть единственным функциональным ингредиентом в данном слое, или он может быть комбинирован с реакционными реагентами в этом слое. Предпочтительно, чтобы обе стороны зазора граничили со слоями, несущими ПАВ. Для непосредственного ввода образца в камеру, устройство снабжено отверстием для ввода образца, а в предпочтительном варианте, в камере имеется одно или несколько вентиляционных отверстий, отделенных друг от друга отверстием для ввода образца и предназначенных для облегчения заполнения камеры.
Другие отличительные признаки, цели и преимущества настоящего изобретения, а также его предпочтительные варианты будут очевидны из нижеследующего описания.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1 - вид в перспективе характерного испытательного устройства настоящего изобретения.
Фиг. 2 - вид сбоку в разрезе части испытательного устройства, показанного на фиг. 1.
Подробное описание изобретения и его предпочтительного осуществления
В одном из аспектов, настоящее изобретение относится к способу анализа на присутствие ферментативно активной гидролазы в образце, включающего:
(a) контактирование образца с твердым носителем, на котором иммобилизован фермент-репортер таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием гидролазы;
(b) после контактирования с указанным твердым носителем, соединение образца с индикатором, который подвержен детектируемому изменению под действием фермента-репортера; и
(c) наблюдение за детектируемым изменением индикатора; при этом детектируемое изменение индикатора свидетельствует о присутствии ферментативно активной гидролазы в образце.
Термин "гидролаза", используемый в настоящем описании, относится к ферменту, катализирующему гидролитические реакции. Способ настоящего изобретения может быть использован для анализа на присутствие любого известного гидролитического фермента. Такими гидролитическими ферментами, т.е. гидролазами, являются, без ограничений, следующие ферменты: протеазы или протеиназы (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидазы, липазы, нуклеазы, гомо- или гетероолигосахаридазы, гомо- или гетерополисахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы и эстеразы. В предпочтительном варианте, способ настоящего изобретения может быть использован для анализа на присутствие протеаз, включая, не ограничиваясь ими, аспарагиновые протеазы, сериновые протеазы, тиоловые протеазы, металлопротеазы, кислые протеазы и щелочные протеазы. В другом предпочтительном варианте способ настоящего изобретения может быть использован для анализа на присутствие гомо- или гетероолигосахаридаз, или гомо- или гетерополисахаридаз, включая, не ограничиваясь ими, хитиназу, амилазу, целлюлазу и лизицим.
Термины "фермент-репортер" или "фермент-маркер" (эти термины являются взаимозаменяемыми), используемые в настоящем описании, относятся к сигналгенерирующему ферменту, т. е. к ферменту, активность которого вызывает детектируемое изменение. Такими ферментами-репортерами являются, не ограничиваясь ими, пероксидазы, фосфатазы, оксидоредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. При выборе фермента-репортера для использования в методе настоящего изобретения, необходимо иметь в виду, что этот фермент-репортер не должен подвергаться инактивации под действием какого-либо агента, присутствующего в образце, включая любую активную гидролазу, присутствующую в образце и участвующую в инактивирующем гидролизе. Выбор подходящего фермента-репортера или -маркера может быть легко осуществлен квалифицированным специалистом. Предпочтительными ферментами-репортерами являются пероксидазы, например, такие как пероксадаза хрена. Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе, на таком, как нерастворимый полимерный материал, неорганическая или органическая матрица, гель, агрегат, преципитат, или смола, таким образом, чтобы указанный фермент-репортер отделялся от носителя под действием гидролазы, присутствие которой необходимо детектировать в данном анализе. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными твердыми носителями являются, не ограничиваясь ими, целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиакриламид или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые шарики и диальдегидсодержащий полимер, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерий или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты, и стекло, имеющее поры определенного размера. Иммобилизацию фермента-репортера на твердом носителе осуществляют с использованием стандартных методов и операций, известных каждому специалисту.
Фермент-репортер может быть связан непосредственно с твердым носителем. В этом случае нерастворимый носитель служит непосредственно в качестве субстрата для гидролазы. Так, например, если анализируемой гидролазой является хитиназа, то репортерный или маркерный фермент, (такой, как пероксидаза хрена) может быть присоединен непосредственно к нерастворимому хитину. В присутствии хитиназы, пероксидаза хрена будет отделяться от твердого носителя. Аналогичным образом, если исследуемой гидролазой является целлюлоза, то фермент-репортер, например пероксидаза хрена, может быть присоединен непосредственно к целлюлозе, и в присутствии целлюлозы, пероксидаза хрена будет отделяться от твердого носителя. И наконец, если детектируемой гидролазой является лизоцим, то фермент-репортер, например пероксидаза хрена, может быть присоединен непосредственно к пептидогликану клеточной стенки бактерии, и в присутствии лизоцима, пероксидаза хрена будет отделяться от твердого носителя.
Альтернативно, фермент-репортер может быть иммобилизован на твердом носителе посредством использования линкерной молекулы, которая представляет собой гидролизуемый субстрат для детектируемой гидролазы. Такими линкерными молекулами являются, не ограничиваясь ими, белки, углеводы, липиды, пептиды, сложные эфиры, и нуклеиновые кислоты. Выбор конкретной линкерной молекулы, используемой для присоединения фермента-репортера к твердому носителю, зависит от типа детектируемой гидролазы, и в любом случае, может быть легко осуществлен квалифицированным специалистом.
Термин "индикатор", используемый в настоящем описании, относится к любому химическому соединению, которое подвергается детектируемому изменению в результате реакции или в результате кульминации реакций, происходящих в случае присутствия в образце или препарате ферментативно активной гидролазы. Индицируемое в результате этого детектируемое изменение указывает на то, что в данном препарате или образце присутствует ферментативно активная гидролаза.
Предпочтительными индикаторами являются визуальные индикаторы, а, в частности, хромогенные индикаторы, то есть, такие индикаторы, в которых видимым изменением является изменение окраски (включая образование окраски в другом бесцветном материале) под действием фермента-репортера или фермента-маркера, в случае, если он отделяется от твердого носителя с помощью ферментативно активной гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. Альтернативно, фермент-репортер может оказаться способным катализировать образование флуоресцентного сигнала, фосфоресцентного сигнала, биолюминесцентного сигнала, хемилюминесцентного сигнала, или электрохимического сигнала после своего отделения от твердого носителя под действием гидролазы. Кроме того, фермент-репортер может оказаться способным продуцировать другие видимые или детектируемые сигналы, например, такие как образование сгустков, агглютинация, преципитация, или образование зон осветления. В этих случаях, индикатор должен быть химическим соединением или субстратом, необходимым для того, чтобы данный фермент-репортер или фермент-маркер продуцировал нужное детектируемое изменение.
В качестве визуальных индикаторов, действующих с помощью фермента-репортера, такого, как пероксидаза хрена, могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т.е. хромогены) и другие соединения, имеющие аналогичное действие. Предпочтительные хромогенные индикаторы в соответствии с настоящим изобретением содержат гидропероксид и хромоген, включая, но не ограничиваясь ими, гваяковую смолу, 2,2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол, 4-аминоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновую кислоту. Особенно предпочтительным хромогенным индикатором является гидропероксид и гваяковая смола, т.е. хромоген, который является бесцветным в его восстановленном виде и темно-синим в окисленном виде. Гваяковая смола может быть (но необязательно) очищена до ее использования, например, путем экстракции растворителем. Выбор наиболее подходящего хромогенного индикатора для данного фермента-репортера зависит от реакции или реакций, которые этот фермент способен катализировать или инициировать, и в любом случае, этот выбор может быть легко осуществлен каждым специалистом.
Если в качестве визуального индикатора применяется хромогенный индикатор, то в этом случае, может быть использована либо жидкая хромогенная система, либо твердая хромогенная система. Если для данных пероксидаз используется жидкая хромогенная система, то такая система должна состоять из растворителя, гидропероксида и хромогена, способного окислять гидропероксидами в присутствии пероксидазы, например пероксидазы хрена. Альтернативно, если используется твердая хромогенная система, то такая система должна состоять из гидроксипероксида; хромогена способного окисляться гидропероксидами в присутствии пероксидазы; и твердого носителя, который пропитывают хромогеном или на который иммобилизуют хромоген, а затем высушивают. В этой системе, хромогеном может быть пропитана промокательная бумага или подложка, как это было сделано в случае с препаратами Hemoccult® или альтернативно, хромоген может быть осажден тонким слоем на пластике или другом материале, изготовленном в виде пластины. В последнем варианте, хромоген может быть нанесен слоем в виде раствора, содержащего полимерный материал (например, такой как гидроксипропилцеллюлоза, этилцеллюлоза и т.п.). Если хромоген сам по себе является водорастворимым, то он может быть введен в матрицу материала, нерастворимого в воде. Альтернативно, если хромоген не растворяется в воде, то он может быть нанесен слоем в виде раствора в органическом растворителе либо отдельно, либо в комбинации с растворимым или нерастворимым в воде полимером.
В твердой хромогенной системе для детектирующих пероксидаз, гидропероксид может быть использован в твердом состоянии (например, такой как гипероксид титана), либо он может быть генерирован in situ. Так, например, пероксид водорода может быть генерирован in situ с использованием глюкозы, атмосферного кислорода и глюкооксидазы. Альтернативно, пероксид водорода может быть получен in situ путем использования сухого слоя, образованного после осаждения суспензии пербората натрия в спирте. При низком pH, перборат натрия спонтанно выделяет пероксид водорода. В присутствии пероксида водорода и пероксидазы, после ее отделения от твердого носителя с помощью гидролазы, хромоген окисляется, в результате чего можно визуально наблюдать изменение окраски. Это изменение окраски указывает на присутствие ферментативно активной гидролазы в образце или препарате.
Этот метод, а также другие методы настоящего изобретения могут быть использованы для одновременного анализа на присутствие двух или более активных гидролаз в образце или препарате. В указанном методе может быть использована смесь двух или более ферментов-репортеров, иммобилизованных на твердом носителе (носителях) посредством субстратных сшивок, восприимчивых к специфическим гидролазам; и двух или более систем индикатора и реагента для индуцирования детектируемого ответа к каждому из ферментов-репортеров. Например, методы настоящего изобретения могут быть использованы для одновременной детекции смеси протеаз, липаз, и полисахаридаз с получением гидролитического профиля данного патогена или патологического процесса.
Кроме того, каждому специалисту ясно, что для повышения гидролазной специфичности и для дифференциации различных гидролаз, присутствующих в образце, реакционные условия в методах настоящего изобретения (такие как выбор линкерной молекулы или мостиковой связи, твердых носителей, pH, буферной емкости, буферной идентичности, солей, и т.п.) могут быть модифицированы и скорректированы. Например, известно, что некоторые гидролазы функционируют при низких pH и ингибируются при высоких pH. В противоположность этому, другие гидролазы функционируют при высоких pH и ингибируются при низких pH. Таким образом, путем регулирования pH аналитической смеси можно проводить селективную детекцию на присутствие конкретной гидролазы. Кроме того, каждому специалисту понятно, что для увеличения гидролазной активности и специфичности, а также для дифференциации различных гидролаз, в методах настоящего изобретения могут быть использованы специфические ингибиторы ферментов.
В другом аспекте настоящего изобретения рассматривается метод анализа на присутствие ферментативно активной гидролазы в образце, заключающийся в том, что образец помещают в устройство, содержащее первый и второй твердые носители, при этом на первом твердом носителе иммобилизован фермент-репортер таким образом, что под действием гидролазы, он отделяется от этого первого носителя, а на втором твердом носителе, который не контактирует с первым твердым носителем, иммобилизуют индикатор, способный подвергаться детектируемому изменению под действием фермента-репортера, причем указанный образец помещают в это устройство таким образом, чтобы он контактировал с первым и вторым твердыми носителями, в результате чего любой фермент-репортер, высвобожденный под действием активной гидролазы, присутствующей в образце, может диффундировать через этот образец ко второму твердому носителю; и после этого наблюдают, подвергается ли индикатор детектируемому изменению, и если такое детектируемое изменение имеет место, то это означает, что ферментативно активная гидролаза присутствует в данном образце.
Этот метод настоящего изобретения может быть также использован для анализа на присутствие любого известного гидролитического фермента, включая (но не ограничиваясь ими) такие гидролазы, как протеазы или протеиназы (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидазы, липазы, нуклеазы, гомо- или гетероолигосахаридазы, гомо- или гетерополисахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы, и эстеразы. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, этот метод используется для анализа на присутствие протеаз, включая (но не ограничиваясь ими) такие протеазы, как аспарагиновые протеазы, сериновые протеазы, тиоловые протеазы, металлопротеазы, кислые протеазы и щелочные протеазы.
Фермент-репортер или фермент-маркер, используемый в этом методе, может быть любым сигналгенерирующим ферментом, который не подвергается инактивации каким-либо агентом, присутствующим в образце, включая инактивацию посредством гидролиза под действием активной гидролазы, присутствующей в образце. Такими ферментами-репортерами являются, но не ограничиваются ими, пероксидазы, фосфатазы, оксиредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреазы и глюкуронидазы. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными ферментами-репортерами или ферментами-маркерами являются пероксидазы, например, такие как пероксидазы хрена.
Фермент-репортер иммобилизуют на первом твердом носителе, т.е. на нерастворимой матрице, геле или смоле, таким образом, чтобы этот фермент-репортер отделялся от указанного твердого носителя под действием ферментативно активной гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. Этот фермент-репортер может быть непосредственно связан с первым твердым носителем, если таким твердым носителем является субстрат для гидролазы; либо, альтернативно, фермент-репортер может быть иммобилизован на первом твердом носителе посредством линкерной молекулы, являющейся субстратом для ферментативно активной гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. Такими линкерными молекулами являются (но не ограничиваются ими); белки, углеводы, липиды, пептиды, сложные эфиры, и нуклеиновые кислоты. Выбор конкретной линкерной молекулы, используемой для связывания фермента-репортера с первым твердым носителем, зависит от анализируемой гидралазы, но в любом случае, этот выбор может быть легко осуществлен каждым специалистом. Иммобилизацию фермента-репортера на первом твердом носителе осуществляют с использованием стандартных методов и операций, хорошо известных каждому специалисту.
В этом методе настоящего изобретения индикатор связывают со вторым твердым носителем, который не контактирует с первым твердым носителем. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными первым и вторым носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиакриламид, или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые шарики, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его ферменты, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты, и стекло, имеющее поры определенного размера. Иммобилизацию визуального индикатора на втором твердом носителе осуществляют с использованием стандартных методов и процедур, известных каждому специалисту.
Индикатором может быть любое химическое соединение, которое подвергается детектируемому изменению в результате реакции или в результате кульминации реакций, происходящих под действием ферментативно активной гидролазы, в том случае, если он присутствует в образце или препарате. Индуцируемое в результате этого детектируемое изменение в индикаторе указывает на то, что ферментативно активная гидролаза присутствует в данном образце. Предпочтительными индикаторами являются визуальные индикаторы, а в частности, хромогенные индикаторы, то есть такие индикаторы, в которых видимым изменением является изменение окраски, включая образование окраски в другом бесцветном материале, под действием фермента-репортера или фермента-маркера, в том случае, если он отделяется от твердого носителя с помощью ферментативно активной гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе.
В качестве визуальных индикаторов могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т.е. хромогены) широкого ряда, и другие соединения, имеющие аналогичное действие. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные хромогенные индикаторы для пероксидазоподобных ферментов-репортеров состоят из гидропероксида и хромогена, представляющего собой следующие соединения (но не ограничиваясь ими): гваяковую смолу, 2,2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновую кислоту), тетраметилбензидин, фенол, 4-аминоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновую кислоту. Особенно предпочтительный хромогенный индикатор состоит из гидроксида и гваяковой смолы, т.е. хромогена, который является бесцветным в восстановленном состоянии и темно-синим в окисленном состоянии. Выбор наиболее подходящего хромогенного индикатора для данного фермента-репортера зависит от реакции или реакций, которые этот фермент способен катализировать или инициировать, и в любом случае, этот выбор может быть легко осуществлен каждым специалистом.
Если в качестве визуального индикатора для пероксидазных реакций используется хромогенный индикатор, а в частности, твердая хромогенная система, то такая система состоит из гидропероксида; хромогена, окисленного гидропероксидами в присутствии пероксидазы; и твердого носителя, который пропитывают хромогеном, или на который иммобилизуют хромоген, а затем высушивают. В этой системе, хромогеном может быть пропитана промокательная бумага или носитель, как это было сделано в случае с препаратом Hemoccult® , или альтернативно, хромоген может быть осажден тонким слоем на пластике или другом материале, изготовленном в виде пластины. В последнем варианте, хромоген может быть нанесен слоем в виде раствора, содержащего полимерный материал (например, такой как гидроксипропилцеллюлоза, этилцеллюлоза, и т.п.). Если сам хромоген является водорастворимым, то он может быть введен в матрицу материала нерастворимого в воде. Альтернативно, если хромоген не растворяется в воде, то он может быть нанесен слоем в виде раствора в органическом растворителе либо отдельно, либо в комбинации с растворимым или нерастворимым в воде полимером.
В твердой хромогенной системе, используемый гидропероксид может быть в твердом состоянии (например, такой как гидропероксид титана), либо, он может быть генерирован in situ в аналитическом устройстве. В присутствии гидропероксида и пероксидазы, после ее отделения от первого твердого носителя с помощью гидролазы, хромоген окисляется, в результате чего наблюдается визуально обнаружимое изменение окраски. Это изменение окраски свидетельствует о том, что ферментативно активная гидролаза присутствует в данном образце или препарате.
В предпочтительном варианте осуществления этого метода настоящего изобретения, детектируемой гидролазой является ферментативно активная аспарагиновая протеаза, а сам метод
заключается в том, что образец помещают в устройство, содержащее первый и второй твердые носители, при этом на первом твердом носителе, являющимся полиакрилатом, иммобилизуют пероксидазу хрена посредством молекулы миоглобина, которая является субстратом для аспарагиновой протеазы, а на втором твердом носителе, неконтактирующем с первым твердым носителем и являющимся производным целлюлозы, иммобилизуют гидропероксид и гваяковую смолу, которая представляет собой хромогенный субстрат, подвергающийся изменению окраски под действием пероксидазы хрена в присутствии гидропероксида; причем указанный образец помещают в данное устройство таким образом, чтобы он контактировал с первым и вторым твердыми носителями, в результате чего, любая пероксидаза хрена, высвобожденная под действием любой ферментативно активной аспарагиновой протеазы, присутствующей в образце, может диффундировать через этот образец ко второму твердому носителю; и после этого наблюдают, подвергается ли гваяковая смола изменению в окраске, и, если такое изменение окраски имеет место, то это означает, что ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в данном образце.
Как было упомянуто выше, любому специалисту ясно, что для повышения специфичности аспарагиновой протеазы могут быть использованы определенные реакционные условия (такие как конкретно выбранные линкерная молекула, твердый носитель, pH, буферная емкость, буферная идентичность, соли, и т.п.), и специфические ингибиторы. Например, путем проведения анализа на аспарагиновую протеазу при pH, равном от приблизительно 2,5 до 5,0, аспарагиновые протеазы могут быть обнаружены избирательно по отношению к тиоловым, сериновым, металло- и щелочным протеазам. Кроме того, селективная детекция аспарагиновых протеаз может быть проведена путем добавления ингибиторов металлопротеаз, тиоловых протеаз, сериновых протеаз и кислых или щелочных протеаз.
В еще одном аспекте настоящего изобретения рассматривается метод обнаружения кандидоза путем проведения анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы в образце, заключающийся в:
(a) контактировании образца с твердым носителем, на котором иммобилизован фермент-репортер таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием аспарагиновой протеазы;
(b) после контакта с указанным твердым носителем взаимодействии образца с индикатором, который способен подвергаться детектируемому изменению под действием фермента репортера; и
(c) наблюдении за детектируемым изменением индикатора; и если детектируемое изменение имеет место, то это указывает на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы в данном образце, а значит, на наличие кандидоза.
Фермент-репортер или фермент-маркер, используемый в этом методе, может быть любым сигналгенерирующим ферментом, т.е. ферментом, активность которого вызывает видимое или обнаруживаемое изменение и который не подвергается инактивации каким-либо агентом, присутствующим в образце, включая инактивацию посредством гидролиза под действием любой аспарагиновой протеазы или любой другой активной гидролазы, присутствующей в образце. Такими ферментами-репортерами являются (но не ограничиваются ими): пероксидазы, фосфатазы, оксидоредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. Выбор подходящего фермента-репортера или фермента-маркера может быть легко осуществлен любым специалистом. В этом методе настоящего изобретения предпочтительными ферментами-репортерами являются пероксидазы. При этом особенно предпочтительным ферментом-репортером является пероксидаза хрена, поскольку этот фермент не поддается легко гидролизу под действием аспарагиновой протеазы или многих других хорошо известных протеаз, которые могут присутствовать в данном образце.
Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе, т.е. на нерастворимой матрице, геле или смоле, таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием аспарагиновой протеазы. В соответствии с настоящим изобретением твердыми носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиариламид или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые гранулы, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты, и стекло, имеющее поры определенного размера. Особенно предпочтительными твердыми носителями в этом методе настоящего изобретения являются хитин, полиакрилат, целлюлоза, и их производные, и сефароза. Иммобилизацию репортерного фермента на твердом носителе осуществляют с использованием стандартных методов операций, известных и понятных каждому специалисту.
Фермент-репортер может быть иммобилизован на твердом носителе посредством линкерной молекулы, которая является гидролизуемым субстратом для ферментативно активной аспарагиновой протеазы. В этом методе настоящего изобретения, такими линкерными молекулами являются белки и пептиды, при этом предпочтительными линкерными молекулами являются белки. Если линкерной молекулой является белок, то предпочтительными белками являются (но не ограничиваются ими): азоказеин, казеин, каппа-казеин, иммуноглобулины, гемоглобин, миоглобин, альбумин, эластин, кератин и коллаген. В предпочтительном варианте осуществления этого метода настоящего изобретения, линкерной молекулой является каппа-казеин, казеин, гемоглобин или миоглобин.
Индикатором может быть любое химическое соединение, которое подвергается детектируемому изменению в результате реакции или кульминации реакций, происходящих под действием ферментативно активной аспарагиновой протеазы, в том случае, если она присутствует в образце или препарате. Индицируемое в результате детектируемое изменение указывает на то, что ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в образце, а присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы в данном образце, в свою очередь, свидетельствует о наличии кандидоза.
Предпочтительными индикаторами являются визуальные индикаторы, а в частности, хромогенные индикаторы, т.е. такие индикаторы, в которых детектируемым изменением является изменение окраски, включая образование окраски в другом бесцветном материале, под действием фермента-репортера или фермента-маркера, в том случае, если он отделяется от твердого носителя с помощью ферментативно активной аспарагиновой протеазы. Альтернативно, фермент-репортер может обладать способностью катализировать образование флуоресцентного сигнала, фосфоресцентного сигнала, биолюминесцентного сигнала, хемилюминесцентного сигнала или электрохимического сигнала после своего отделения от твердого носителя под действием аспарагиновой протеазы. Кроме того, фермент-репортер может обладать способностью вызывать другие видимые или детектируемые сигналы, например, такие как образование сгустков, агглютинация, преципитация или образование зон осветления. В этих случаях, индикатор должен быть химическим соединением или субстратом, необходимым для того, чтобы данный фермент-репортер или фермент-маркер вызывал нужное детектируемое изменение.
Если ферментами-репортерами или ферментами-маркерами являются пероксидазы, то в качестве визуальных индикаторов могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т.е. хромогены) широкого ряда, а также другие соединения, имеющие аналогичное действие. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные хромогенные индикаторы состоят из гидропероксида и хромогена, представляющего собой следующие соединения (но не ограничиваясь ими): гваяковая смола, 2-2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол, 4-аминоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновая кислота. Особенно предпочтительный хромогенный индикатор состоит из гидроксида и гваяковой смолы, т.е. хромогена, который является бесцветным в восстановленном состоянии и темно-синим в окисленном состоянии. Гваяковая смола может быть, но необязательно, очищена перед использованием, например, путем экстракции растворителем. Выбор наиболее подходящего хромогенного индикатора для данного фермента-репортера зависит от реакции или реакций, которые этот фермент способен катализировать или инициировать, и в любом случае, этот выбор может быть легко осуществлен любым специалистом. Как было описано ранее, если визуальным индикатором является хромогенный индикатор, то в этом случае может быть использована либо жидкая хромогенная система, либо твердая хромогенная система.
В еще одном аспекте настоящего изобретения рассматривается метод обнаружения Trichomonas vaginalis путем проведения анализа на присутствие ферментативно активной тиоловой протеазы в образце, заключающийся в:
(a) контактировании образца с твердым носителем, на котором иммобилизован фермент-репортер таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием ферментативно активной типовой протеазы;
(b) после контакта с указанным твердым носителем, взаимодействии образца с индикатором, который способен вызывать детектируемое изменение под действием фермента-репортера; и
(c) наблюдении за детектируемым изменением индикатора, и, если такое детектируемое изменение имеет место, то это указывает на присутствие ферментативно активной тиоловой протеазы в данном образце, а значит, и на присутствие Trichomonas vaginalis.
Как и в методах, описанных выше, фермент-репортер или фермент-маркер, используемый в этом методе, может быть любым сигналгенерирующим ферментом, т.е. ферментом, активность которого вызывает видимое или обнаруживаемое изменение и который не подвергается инактивации каким-либо агентом, присутствующим в образце, включая инактивацию посредством гидролиза под действием любой активной гидролазы, присутствующей в образце. Такими ферментами-репортерами являются (но не ограничиваются ими): пероксидазы, фосфатазы, оксиредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. Выбор подходящего фермента-репортера или фермента-маркера может быть легко осуществлен любым специалистом. В этом методе настоящего изобретения предпочтительными ферментами-репортерами являются пероксидазы, а в частности, пероксидаза хрена.
Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе, т.е. на нерастворимой матрице, геле или смоле таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием ферментативно активной тиоловой протеазы. В соответствии с настоящим изобретением твердыми носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиакриламид или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые гранулы, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты и стекло с порами определенного размера. Особенно предпочтительными твердыми носителями в этом методе настоящего изобретения являются хитин, полиакрилат, целлюлоза, их производные и сефароза. Иммобилизацию репортерного фермента на твердом носителе осуществляют с использованием стандартных методов и операций, известных и понятных каждому специалисту.
Фермент-репортер может быть иммобилизован на твердом носителе посредством линкерной молекулы, которая является гидролизуемым субстратом для ферментативно активной тиоловой протеазы. В этом методе настоящего изобретения такими линкерными молекулами являются белки и пептиды, при этом предпочтительными линкерными молекулами являются белки. Если линкерной молекулой является белок, то предпочтительными белками являются (но не ограничиваются ими): азоказеин, казеин, каппа-казеин, иммуноглобулин, гемоглобин, миоглобин, альбумин, эластин, кератин и коллаген. В предпочтительном варианте осуществления этого метода настоящего изобретения, линкерной молекулой является каппа-казеин, гемоглобин или миоглобин.
Индикатором может быть любое химическое соединение, которое подвергается детектируемому изменению в результате реакции или кульминации реакций, происходящих под действием ферментативно активной тиоловой протеазы, в том случае, если она присутствует в образце или препарате. Индуцируемое в результате детектируемое изменение указывает на то, что ферментативно активная тиоловая протеаза присутствует в данном образце, а присутствие ферментативно активной тиоловой протеазы в образце, в свою очередь, свидетельствует о присутствии Trichomonas vaginalis.
Предпочтительными являются визуальные индикаторы, а в частности, хромогенные индикаторы, т.е. такие индикаторы, в которых детектируемым изменением является изменение окраски, включая образование окраски в другом бесцветном материале под действием фермента-репортера или фермента-маркера в том случае, если он отделяется от твердого носителя посредством ферментативно активной тиоловой протеазы. Альтернативно, фермент-репортер может обладать способностью катализировать образование флуоресцентного сигнала, фосфоресцентного сигнала, биолюминесцентного сигнала, хемилюминесцентного сигнала или электрохимического сигнала после своего отделения от твердого носителя под действием ферментативно активной тиоловой протеазы. Кроме того, фермент-репортер может обладать способностью вызывать другие видимые или детектируемые сигналы, например такие как образование сгустков, агглютинация, преципитация или образование зон осветления. В этих случаях, индикатор должен быть химическим соединением или субстратом, необходимым для того, чтобы данный фермент-репортер или фермент-маркер вызывал нужное детектируемое изменение.
Если ферментами-репортерами или ферментами-маркерами являются пероксидазы, то в качестве визуальных индикаторов могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т.е. хромогены) широкого ряда, а также другие соединения, имеющие аналогичное действие. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные хромогенные индикаторы состоят из гидропероксида и хромогена, представляющего собой следующие соединения (но не ограничиваясь ими): гваяковая смола, 2-2'-азинобис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол, 4-амииоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновая кислота. Наиболее предпочтительный хромогенный индикатор состоит из гидропероксида и гваяковой смолы, т.е. хромогена, который является бесцветным в восстановленном состоянии и темно-синим в окисленном состоянии. Выбор наиболее подходящего хромогенного индикатора для данного фермента-репортера зависит от реакции или реакций, которые этот фермент способен катализировать или инициировать, и в любом случае, этот выбор может быть легко осуществлен любым специалистом. Как было описано ранее, если визуальным индикатором является хромогенный индикатор, то в этом случае может быть использована либо жидкая хромогенная система, либо твердая хромогенная система.
Как и в случае анализа на аспарагиновую протеазу, в этом методе для повышения активности и специфичности тиоловой протеазы могут быть использованы определенные условия реакции и специфические ингибиторы. Так, например, для того, чтобы в данной аналитической системе могла функционировать, а следовательно, и могла быть обнаружена лишь тиоловая протеаза, к этой системе могут быть добавлены ингибиторы (такие как пепстатин для ингибирования аспарагиновых протеаз, соевый ингибитор трипсина для ингибирования трипсина, EDTA или другие хелаторы для ингибирования металлопротеаз или любые другие из известных природных ингибиторов протеиназ, не относящихся к группе тиоловых протеаз). Кроме того, многие тиоловые протеазы активны при pH около 7,4 тогда, как аспарагиновые протеазы при этом значении pH будут инактивированы.
Важно отметить, что технология высвобождения фермента-репортера в соответствии с настоящим изобретением может быть также использована для детекции присутствия или отсутствия ингибитора гидролазы в образце. Многие биологические процессы, включая регуляцию кровяного давления, свертывания крови, репликацию бактерий и т. п. требуют участия очень специфических тщательно смодулированных гидролаз. Более того, известно, что многочисленные лекарственные средства, пестициды и гербициды действуют посредством ингибирования специфических гидролаз. При определенных обстоятельствах, крайне необходимо определить концентрацию в крови терапевтического средства, ингибирующего гидролазу, либо определить уровень загрязнения продукта потенциальным пестицидным ингибитором гидролазы и т.п. Поэтому в этих случаях необходимо проводить детекцию не самой гидролазы, а ее ингибитора.
В соответствии с этим в другом аспекте настоящего изобретения рассматривается метод анализа на присутствие ингибитора целевой гидролазы в образце, включающего:
(a) контактирование образца с целевой гидролазой и твердым носителем, на котором иммобилизован фермент-репортер таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием целевой гидролазы в том случае, если целевая гидролаза не инактивируется благодаря присутствию ингибитора;
(b) после контакта с целевой гидролазой и твердым носителем, взаимодействие образца с индикатором, который способен подвергаться детектируемому изменению под действием фермента-репортера; и
(c) наблюдение за детектируемым изменением индикатора, и, если такое изменение имеет место, то это указывает на то, что ингибитор целевой гидролазы в данном образце отсутствует.
Для обнаружения присутствия ингибитора гидролазы в образце в аналитическую систему вводят определенное количество целевой гидролазы, и последующие испытания направлены на обнаружение способности данного образца ингибировать целевую гидролазу. Если ингибитор целевой гидролазы отсутствует в образце, то целевая гидролаза будет способствовать отделению фермента-репортера от твердого носителя, в результате чего в индикаторе будет наблюдаться детектируемое изменение. И наоборот, если ингибитор целевой гидролазы присутствует в образце, то целевая гидролаза будет ингибироваться, в результате чего, фермент-репортер не будет отделяться от твердого носителя, а значит, и в индикаторе не будет наблюдаться детектируемое изменение или детектируемый ответ. При этом вовсе не обязательно, чтобы ингибитор, присутствующий в данном образце, полностью ингибировал целевую гидролазу добавленную в аналитическую систему. Необходимо только, чтобы целевая гидролаза ингибировалась в количестве, достаточном для продуцирования заметного изменения в ожидаемом детектируемом ответе.
Этот метод настоящего изобретения может быть использован для анализа на присутствие или отсутствие любого известного ингибитора гидролитического фермента, включая (но не ограничиваясь ими) ингибиторы протеаз или протеиназ (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидаз, липаз, нуклеаз, гомо- или гетероолигосахаридаз, гомо- или гетерополисахаридаз, фосфатаз, сульфатаз, нейраминидаз и эстераз. В предпочтительном варианте, этот метод используется для анализа на присутствие ингибиторов протеаз, включая (но не ограничиваясь ими) ингибиторы аспарагиновой протеазы, ингибиторы сериновой протеазы, ингибиторы тиоловой протеазы, ингибиторы металлопротеазы, ингибиторы кислой протеазы и ингибиторы щелочной протеазы. В более предпочтительном варианте этот метод используется для анализа на присутствие ингибиторов аспарагиновой протеазы, например, таких как пепстатин, овомакроглобулин, галоперидол, имитаторы переходного состояния, U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 и A-7003. U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 и A-7003 представляют собой экспериментальные лекарственные средства, которые были ранее описаны в литературе. В еще более предпочтительном варианте осуществление этого метода настоящего изобретения предусматривает детекцию пепстатина, который является ингибитором аспарагиновой протеазы.
В соответствии с этим методом настоящего изобретения целевыми гидролазами являются (но не ограничиваются ими): протеазы, протеиназы, пептидазы, липазы, нуклеазы, гомо- или гетероолигосахаридазы, гомо- или гетерополисахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы и эстеразы. Выбор конкретной целевой гидролазы, используемой в вышеописанном методе, зависит от ингибитора, присутствие которого необходимо определить в данном анализе, и в любом случае, этот выбор может быть легче осуществлен каждым специалистом. Так, например, детектируемым ингибитором является пепстатин, то в качестве целевой гидролазы, в вышеописанной аналитической системе должна быть использована аспарагиновая протеаза.
Фермент-репортер или фермент-маркер, используемый в этом методе настоящего изобретения, может быть любым сигналгенерирующим ферментом, т.е. ферментом, активность которого вызывает видимое или обнаруживаемое изменение и который не подвергается инактивации каким-либо агентом, присутствующим в образце, включая инактивацию посредством гидролиза под действием целевой гидролазы, присутствующей в образце. Такими ферментами-репортерами являются (но не ограничиваются ими): пероксидазы, фосфатазы, оксиредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. Выбор подходящего фермента-репортера или фермента-маркера может быть легко осуществлен любым специалистом. В этом методе настоящего изобретения предпочтительными ферментами-репортерами являются пероксидазы, а в частности пероксидаза хрена.
Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе, т.е. на нерастворимой матрице, геле или смоле таким образом, чтобы этот фермент-репортер отделялся от твердого носителя под действием целевой гидролазы, в том случае, если эта целевая гидролаза не инактивируется благодаря присутствию ингибитора. В соответствии с настоящим изобретением твердыми носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиакриламид или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые гранулы, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его фрагмент, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты и стекло с порами определенного размера.
Фермент-репортер может быть иммобилизован на твердом носителе посредством линкерной молекулы, которая является гидролизуемым субстратом для ферментативно активной целевой гидролазы. Такими линкерными молекулами являются (но не ограничиваются ими) белки, углеводы, липиды, пептиды, сложные эфиры и нуклеиновые кислоты. Выбор конкретной линкерной молекулы, используемой для связывания фермента-репортера с твердым носителем, зависит от конкретной целевой гидролазы, добавляемой в аналитическую систему, который может быть легко осуществлен каждым специалистом.
Индикатором может быть любое химическое соединение, которое вызывает детектируемое изменение в результате реакции или кульминация реакций, происходящих под действием ферментативно активной целевой гидролазы в том случае, если эта гидролаза не инактивируется вследствие присутствия ингибитора в образце или препарате. Предпочтительными являются визуальные индикаторы, а в частности, хромогенные индикаторы, т.е. такие индикаторы, в которых детектируемым изменением является изменение окраски, включая образование окраски в другом бесцветном материале под действием фермента-репортера или фермента-маркера, если он отделяется от твердого носителя посредством ферментативно активной целевой гидролазы при условии, что эта целевая гидролаза не инактивируется благодаря присутствию ингибитора в образце или препарате.
В качестве визуальных индикаторов могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т. е. хромогены) широкого ряда, а также другие соединения, обладающие аналогичным действием. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные хромогенные индикаторы для пероксидазоподобных ферментов-репортеров состоят из гидропероксида и хромогена, представляющего собой следующие соединения (но не ограничиваясь ими): гваяковая смола, 2,2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол, 4-амино-антипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновая кислота. Особенно предпочтительный хромогенный индикатор состоит из гидропероксида и гваяковой смолы, т.е. хромогена, который является бесцветным в восстановленном состоянии и темно-синим в окисленном состоянии. Как было описано ранее, если визуальным индикатором является хромогенный индикатор, то в этом случае может быть использована либо жидкая хромогенная система, либо твердая хромогенная система.
В еще одном аспекте настоящего изобретения рассматривается испытательное устройство для проведения анализа на присутствие ферментативно активной гидролазы в образце, где указанное устройство включает в себя: приемник, образуемый частично первой и второй противоположными стенками, обращенными друг к другу внутренними поверхностями с зазором между ними, причем первая, вторая или обе стенки изготовлены из светопроницаемого материала; фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе на внутренней поверхности первой или второй стенки, причем этот фермент-репортер иммобилизован таким образом, что он высвобождается под действием гидролазы; индикатор, содержащийся на внутренней поверхности первой или второй стенки и обладающий способностью подвергаться детектируемому изменению под действием фермента-репортера; и отверстие в указанном приемнике, предназначенное для ввода образца.
В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения указанный приемник устройства является плоским и тонким и имеет такой размер, который позволяет его легко держать в руке. В соответствии с этим камера является предпочтительно плоской и неглубокой, причем ее длина и ширина намного превышает глубину, а глубина остается в основном постоянной. Указанная камера является предпочтительно неглубокой, т. е. имеющей глубину достаточную для обеспечения спонтанного смачивания стенок камеры препаратом в целях достижения максимального контакта между препаратом и покрытиями сухих реагентов на верхней и нижней поверхностях. Особый интерес представляет вариант, когда реагенты нанесены на верхнюю и нижнюю поверхность камеры. В этом случае небольшое постоянное расстояние между этими поверхностями будет также минимизировать расстояние, через которое реагенты, находящиеся на поверхности, противоположной поверхности с нанесенным на ней визуальным индикатором, должны будут диффундировать до достижения индикатора.
Исходя из этих соображений следует отметить, что глубина камеры не имеет решающего значения для данного изобретения и может варьироваться. В основном глубина камеры, которая составляет в пределах от приблизительно 3 - 50 милов (0,003-0,050 дюймов; 0,0076-0,127 см), а предпочтительно от приблизительно 5 - 15 (0,005-0,015 дюймов; 0,0127-0,0381 см), позволяет получить наилучшие результаты. Для любой данной глубины, поперечные размеры камеры (т.е. расстояние между ее боковыми стенками) будут определяться размером образца, для которого должно быть приспособлено данное устройство, а в остальном эти размеры не имеют решающего значения, за исключением того случая, когда они определяют размеры и форму испытательной площади на внешней поверхности устройства. Так, например, поперечные размеры должны быть такими, чтобы испытательная площадь была достаточно большой для проведения наблюдения и в то же время достаточно малой для того, чтобы камера была полностью заполнена препаратом приемлемого размера. Размер препарата может варьироваться в зависимости от его типа и, от источника и метода отбора образца. В типичных устройствах, площадь боковой поверхности предполагается равной приблизительно от 0,1 см2 до 10 см2, а предпочтительно от 0,3 см2 до 3 см2. Кроме того, внутренний объем камеры в типичных устройствах может варьироваться, но для большинства типов образцов наиболее приемлемый и подходящий объем составляет приблизительно от 3 мкл до 300 мкл.
Испытательное устройство настоящего изобретения может быть использовано для анализа на присутствие любого известного гидролитического фермента, включая (но не ограничиваясь ими): протеазы или протеиназы (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидазы, липазы, нуклеазы, гомо- или гетероолигосахаридазы, гомо и гетерополисахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы и эстеразы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения испытательное устройство может быть использовано для анализа на присутствие протеаз, включая (но не ограничиваясь ими) сериновые протеазы, аспарагиновые протеазы, тиоловые протеазы, металлопротеазы, а также кислые и щелочные протеазы. В другом предпочтительном варианте, испытательное устройство настоящего изобретения может быть использовано для анализа на присутствие гомо- или гетероолигосахаридаз или гомо- или гетерополисахаридаз, включая (но не ограничиваясь ими) хитиназу, целлюлозу, амилазу и лизоцим.
Фермент-репортер или фермент-маркер, используемый в этом испытательном устройстве может быть любым сигналгенерирующим ферментом, т.е. ферментом, активность которого вызывает обнаруживаемое изменение и который не подвержен инактивации каким-либо агентом, присутствующим в образце, включая инактивацию посредством гидролиза под действием активной гидролазы, присутствующей в образце. Такими ферментами-репортерами являются (но не ограничиваются ими): пероксидазы, фосфатазы, оксидоредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. Выбор подходящего фермента репортера или фермента-маркера может быть легко осуществлен любым специалистом. Предпочтительными ферментами-репортерами в данном варианте настоящего изобретения являются пероксидазы, например пероксидаза хрена.
Фермент-репортер иммобилизуют на первом твердом носителе, т.е. на нерастворимой матрице, геле или смоле таким образом, чтобы этот фермент-репортер отделялся от твердого носителя под действием гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными твердыми носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиакриламид или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые гранулы, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты и стекло с порами определенного размера. Иммобилизацию фермента-репортера на первом твердом носителе осуществляют с использованием стандартных методов и операций, хорошо известных и понятных каждому специалисту.
Этот фермент-репортер может быть непосредственно связан с первым твердым носителем, либо альтернативно, он может быть иммобилизован на первом твердом носителе посредством линкерной молекулы, имеющей гидролизуемую связь, являющейся субстратом для ферментативно активной гидролаза, детектируемой в данном анализе. Такими линкерными молекулами являются (но не ограничиваются ими): белки, углеводы, липиды, пептиды сложные эфиры и нуклеиновые кислоты. Выбор конкретной линкерной молекулы, используемой для связывания фермента-репортера с первым твердым носителем, зависит от детектируемой гидролазы, который может быть легко осуществлен каждым специалистом.
В испытательном устройстве настоящего изобретения индикатор иммобилизуют на втором твердом носителе, который не контактирует с первым твердым носителем. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными твердыми носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые гранулы, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты и стекло с порами определенного размера. Иммобилизацию индикатора на втором носителе осуществляют с использованием стандартных методов, известных каждому специалисту.
Индикатором может быть любое химическое соединение, которое вызывает детектируемое изменение в результате реакции или в результате кульминации реакций, происходящих в том случае, если в образце или препарате присутствует ферментативно активная гидролаза. Индуцируемое в результате этого детектируемое изменение в индикаторе указывает на то, что ферментативно активная гидролаза присутствует в данном образце или препарате. Предпочтительными индикаторами являются визуальные индикаторы, а в частности хромогенные индикаторы, т. е. такие индикаторы, в которых видимым изменением является изменение окраски, включая образование окраски в другом бесцветном материале под действием фермента-репортера или фермента-маркера в том случае, если он отделяется от твердого носителя с помощью гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе. Альтернативно, фермент-репортер может обладать способностью катализировать образование флуоресцентного сигнала, фосфоресцентного сигнала, биолюминесцентного сигнала, хемилюминесцентного сигнала или электрохимического сигнала после своего отделения от твердого носителя под действием гидролазы. Кроме того, фермент-репортер может вызывать другие видимые или детектируемые сигналы, например, такие как образование сгустков, агглютинация, преципитация или образование зон осветления. В этих случаях индикатор должен быть химическим соединением или субстратом, необходимым для того, чтобы данный фермент-репортер или фермент-маркер продуцировал нужное детектируемое изменение.
В качестве визуальных индикаторов могут быть использованы различные хромогенные индикаторы широкого ряда (т.е. хромогены) и другие соединения, имеющие аналогичное действие. Если в качестве ферментов-репортеров или ферментов-маркеров используются пероксидазы, то предпочтительные хромогенные индикаторы состоят из гидропероксида и хромогена, представляющего собой следующие соединения (но не ограничиваясь ими): гваяковая смола, 2-2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол, 4-аминоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновая кислота. Наиболее предпочтительный хромогенный индикатор состоит из гидропероксида и гваяковой смолы, т.е. хромогена, который является бесцветным в восстановленном состоянии и темно-синим в окисленном состоянии. Перед использованием гваяковая смола может быть, но необязательно, очищена, например, путем экстракции растворителем. Выбор наиболее подходящего хромогенного индикатора для данного фермента-репортера зависит от реакции или реакций, которые этот фермент способен катализировать или инициировать и легко может быть осуществлен любым специалистом.
Для визуальных хромогенных индикаторов используют твердую хромогенную систему. Эта твердая хромогенная система состоит из гидропероксида; хромогена, способного подвергаться окислению гидропероксидами в присутствии пероксидазы; и твердого носителя, который пропитывают хромогеном или на который иммобилизуют хромоген, а затем высушивают. В этой системе хромоген может пропитывать промокательную бумагу или носитель, как это было сделано в случае с микропрепаратами Hemoccult® или альтернативно, хромоген может быть осажден тонким слоем на пластике или другом материале изготовленном в виде листа. В этом последнем варианте хромоген может быть нанесен слоем в виде раствора, содержащего полимерный материал (например, такой как гидроксипропилцеллюлоза, этилцеллюлоза и т.п.). Если сам хромоген является водорастворимым, то он может быть введен в матрицу из нерастворимого в воде материала. Альтернативно, если хромоген не растворяется в воде, то он может быть нанесен в виде раствора в органическом растворителе как отдельно, так и в комбинации с растворимым или нерастворимым в воде полимером.
В указанной хромогенной системе может быть использован гидропероксид в твердой форме (например, гидропероксид титана), либо он может быть генерирован in situ в испытательном устройстве. Так, например, пероксид водорода может быть генерирован in situ путем нанесения осушенной глюкозы и глюкозооксидазы на внутренние поверхности испытательного устройства или путем нанесения суспензии пербората натрия в спирте на внутренние поверхности испытательного устройства. При низком pH происходит спонтанное высвобождение пероксида водорода из пербората натрия. В присутствии пероксида водорода и пероксидазы (например, перкосидазы хрена), после ее отделения от первого твердого носителя с помощью гидролазы хромоген окисляется, в результате чего наблюдается визуально обнаруживаемое изменение окраски. Как было упомянуто выше, это изменение окраски свидетельствует о том, что ферментативно активная гидролаза присутствует в данном образце или препарате.
Любому специалисту ясно, что для повышения специфичности и активности гидролазы, а также для дифференциации различных гидролаз, которые могут присутствовать в образце, условия реакции (такие как выбор твердого носителя, линкерной молекулы, pH, буферной емкости, буферной идентичности, солей и т. п.) в заявленном испытательном устройстве могут быть модифицированы и скорректированы. Кроме того, каждому специалисту ясно, что для повышения активности и специфичности гидролазы и для дифференциации различных гидролаз, присутствующих в образце, в заявленные испытательные устройства могут быть добавлены специфические ингибиторы ферментов.
Испытательное устройство снабжено отверстием для ввода образца в камеру. Это отверстие находится, предпочтительно, на той же самой стенке, на которой наблюдаются изменения визуального индикатора, т. е. на пропускающей свет стенке. Указанное отверстие должно иметь форму, которая была бы подходящей для переносного устройства, используемого для переноса образца из его источника, а поэтому это отверстие может варьироваться в соответствии с различными типами переносных устройств, которые могут быть использованы в этих целях. Примерами переносных устройств являются шприцы, пипетки, стержень с тампоном для взятия мазка и медицинское зеркало. Могут быть использованы и другие инструменты, хорошо известные специалистам. В основном отверстие имеет круглую форму, хотя для некоторых инструментов, таких как тампоны на стержне, это отверстие может иметь прямой край, вдоль которого можно сделать соскоб для лучшего отделения пробы.
Предпочтительные варианты испытательного устройства имеют дополнительные особенности, способствующие продвижению жидкости, необходимой для заполнения камеры и тем самым для приведения всех реагентов в контакт с препаратом. Одно из таких отличительных особенностей заключается в том, что камеру снабжают одним или несколькими вентиляционными отверстиями для прохождения воздуха. Для увеличения площади поверхности, смачиваемой образцом, указанные вентиляционные отверстия должны находиться на адекватном расстоянии от отверстия для ввода образца. Во избежании получения ошибочных или неопределенных данных, в устройствах, где активированные образцы положительная и отрицательная контрольные зоны находятся внутри камеры и являются горизонтально смежными с испытательной зоной, вентиляционные отверстия должны быть расположены таким образом, чтобы образец достигал обе контрольные зоны и заполнял их. Как обсуждается ниже, в одной из предпочтительных конструкций данного устройства испытательная зона находится между контрольными зонами, причем положительная и отрицательная контрольные зоны не имеют общей границы, хотя каждая из них имеет общую границу с испытательной зоной. В этой конструкции, отверстие для ввода образца чаще всего расположено в том месте стенки, которое находится непосредственно над испытательной зоной, при этом одно вентиляционное отверстие расположено над каждой из двух контрольных зон, либо вблизи внешних краев этих зон, в результате чего образец заполняет сначала испытательную зону, а затем обе контрольные зоны.
Другой отличительной особенностью в предпочтительном варианте настоящего изобретения, способствующей перемещению жидкости в устройстве, заключается в том, что вдоль внутренней поверхности камеры помещают поверхностно-активное вещество. Это вещество может быть помещено вдоль одной или другой верхней и нижней поверхностей камеры, а предпочтительно вдоль обеих поверхностей и может быть включено в виде сухого растворенного вещества в матрицу носителя, составляющего самый верхний слой или покрытие на данной поверхности. В некоторых случаях этот слой может также содержать один или несколько реагентов, участвующих в испытательных реакциях. В других случаях поверхностно-активное вещество может быть единственным функциональным компонентом данного слоя.
Поверхностно-активные вещества (ПАВ) могут быть использованы для препаратов, содержащих воду, представляющих большинство биологических препаратов. Подходящими ПАВ являются такие вещества, которые могут быть получены в твердой форме и в целях настоящего изобретения могут быть использованы различные вещества широкого ряда, обладающие поверхностно-активным действием. Такими веществами могут быть детергенты, смачивающие агенты или эмульгаторы, при этом они могут широко варьироваться по своей химической структуре и электронным свойствам и представлять собой анионогенные, катионогенные, цвиттерионогенные и неионогенные вещества. В качестве примеров могут служить алкил-алкоксисульфаты, алкил-арилсульфонаты, сложные эфиры глицерина, образованные жирными кислотами, производные на основе ланолина, полиоксиэтиленалкилфенолы, полиоксиэтиленамины, полиоксиэтиленовые жирные кислоты и сложные эфиры, полиоксиэтиленовые жирные спирты и простые эфиры, поли(этиленгликолевые) жирные кислоты и сложные эфиры, полиоксиэтиленовые жирные сложные эфиры и масла, продукты конденсации полиоксипропилена/полиоксиэтилена и блок-полимеры, сложные сорбитанэфиры жирных кислот, сульфо-производные сукцинатов, алкилглюкозиды и производные холевой кислоты. Некоторые из этих веществ имеются в виде готовых продуктов под следующими торговыми марками; Lubrol, Brij, Tween, Tergitol, Igepal, Triton, Teepol и многие другие.
Формирование твердых слоев индикатора и реагента может быть осуществлено путем нанесения материала в жидком виде с последующей его сушкой или затвердеванием каким-либо другим способом. Такой жидкой формой вещества может быть, например, раствор, суспензия или незастывшее жидкое состояние вещества, последующая стадия отвержения которой может быть осуществлена, например, путем выпаривания растворителя или затвердевания вещества. Данное вещество может быть соединено с другими материалами, например, в целях:
(1) облегчения нанесения жидкости на поверхность путем модификации вязкости этой жидкости;
(2) образование непрерывного ровного твердого слоя, который оставался бы однородным и не подвергался бы дезинтеграции и грануляции с течением времени или после нанесения на него других слоев;
(3) модификации растворимости данного слоя растворителями, используемыми в слоях, наносимых поверх этого слоя; либо придания данному слою способности растворяться в растворителях, которые не растворяют слои, нанесенные ниже этого слоя; либо для достижения всех этих целей одновременно. Для достижения одной или всех из указанных целей предпочтительными добавками являются полимерные материалы. В качестве примеров могут служить целлюлоза и ее различные производные с заместителями, выбранными таким образом, чтобы достигались нужные характеристики растворимости. Если испытательные устройства предназначены для водных или других водосодержащих образцов, индикаторный слой содержит предпочтительно индикатор, включенный в матрицу из твердого материала, который не растворяется в воде. Это предохраняет индикатор от миграции из данного слоя и от пропускающей свет поверхности. И если этот индикатор является нерастворимым в воде, то он сам будет образовывать когерентный слой, который будет оставаться интактным.
Для тех вариантов настоящего изобретения, где в устройство вводят индикатор положительного и отрицательного контроля или тот и другой для каждого контроля могут быть использованы один или несколько реагентов. Такие дополнительные реагенты могут быть введены в один из слоев в горизонтальной части этого слоя, либо они могут быть нанесены в виде отдельного слоя, который является вертикально смежным по отношению к горизонтальной части имеющегося слоя. Поэтому благодаря своему положению эти дополнительные реагенты определяют контрольные зоны, которые являются горизонтально отделенными друг от друга и от испытательной зоны.
Выбор реагентов, подходящих для положительного или отрицательного контроля, зависит от гидролазы, присутствие которой детектируется в данном анализе, от типа визуального индикатора, используемого для обнаружения присутствия данной гидролазы и от цели использования данного реагента, т.е. от того, будет ли этот реагент использован в качестве положительного и отрицательного контроля. Если используются известные химические соединения, то в большинстве случаев выбор подходящего реагента может быть легко осуществлен каждым специалистом. Так, например, реагентом для положительного контроля может быть образец самой гидролазы,
аналог гидролазы или любое другое вещество с аналогичным механизмом действия, которое инициирует или индуцирует реакцию или каскад реакций, приводящих в совокупности к детектируемому изменению индикатора. Слой, содержащий этот реагент, может находиться либо на верхней, либо на нижней поверхности камеры при условии, что указанный реагент не будет инициировать или индуцировать детектируемое изменение до тех пор, пока не будет введен образец, но при этом он должен действовать независимо от того присутствует или отсутствует ферментативно активная гидролаза в образце. Реагентом для отрицательного контроля может являться ингибирующее вещество, такое как денатурирующий, ингибирующий или какой-либо другой инактивирующий агент, который предупреждает или блокирует реакцию или каскад реакций, предотвращая тем самым детектируемое изменение, происходящее независимо от того присутствует или отсутствует ферментативно активная гидролаза в образце или препарате.
Оба контроля активируются при введении препарата в испытательное устройство. В некоторых случаях это может быть достигнуто с большей эффективностью, если контрольные реагенты будут находиться в слоях, расположенных на той же самой поверхности, что и слой (или слои), содержащий другой реагент (или реагенты). В других случаях наилучшие результаты могут быть достигнуты, если контрольные реагенты будут находиться в слоях на той поверхности камеры, которая противоположна поверхности, несущей другой реагент (или реагенты) так, что данный контрольный реагент будет отделен от другого реагента (или реагентов) воздушным промежутком. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения контрольные зоны устройства содержат все компоненты и реагенты, используемые в испытательной зоне, а также контрольные реагенты, которые либо вводят в горизонтально очерченные участки одного и того же слоя одного или нескольких слоев, используемых в испытательной зоне, либо наносят в виде отдельных слоев на таких горизонтально очерченных участках. Для получения четких границ контрольных зон и для предохранения испытательной зоны от активации или дезактивации контрольными реагентами, часто оказывается предпочтительным, чтобы в слоях на границах, отделяющих контрольные зоны от испытательной зоны, имелись разрывы для того, чтобы минимизировать или исключить возможность латеральной диффузии контрольных реагентов из соответствующих контрольных зон. Эти разрывы непрерывности в слоях могут присутствовать как вдоль верхней поверхности, нижней поверхности или вдоль обеих поверхностей.
Как указывалось выше, контрольные зоны активируются предпочтительно тем же самым препаратом, который используется для испытательной зоны. Это с успехом осуществляется благодаря тому, что контрольные зоны являются как бы продолжением испытательной зоны, причем все они находятся в одной и той же камере испытательного устройства с беспрепятственным перемещением жидкости между различными зонами. В предпочтительном варианте, где используются положительная и отрицательная контрольные зоны, эти контрольные зоны отделены друг от друга испытательной зоной, которая расположена между ними. Заполнение всех указанных зон с помощью одного внесения образца может быть осуществлено благодаря наличию в устройстве отверстия для ввода образца и вентиляционных отверстий, описанных выше. Поскольку детектируемые изменения или их отсутствие обнаруживаются посредством пропускающей свет стенки устройства, то идентификация как положительных, так и отрицательных контрольных зон осуществляется с помощью соответствующих меток, проставляемых на внешней поверхности устройства.
Пропускающая свет стенка может быть изготовлена из любого материала, который является инертным и достаточно жестким для поддержания индикаторного слоя, а также достаточно прозрачным для наблюдения за изменением индикатора, если таковое имеет место. Могут быть использованы светопроницаемые или прозрачные материалы, предпочтительно неабсорбирующие материалы, при этом предпочтительными являются прозрачные материалы. Примерами прозрачных полимерных материалов, подходящих для использования в вышеуказанных целях, являются полиэтилентерефталаты (например, такие как Mylar® ) и поликарбонаты (например, такие как Lexan® ). Противоположная (т.е. нижняя) стенка устройства также может быть изготовлена как из прозрачного или светопроницаемого материала, так и из непрозрачного материала, поскольку наблюдение за результатами анализа, а также за положительным и отрицательным контролем осуществляется лишь с одной стороны устройства. Если нижняя стенка является прозрачной, то детекция изменений в испытательной и контрольной зонах либо в той и другой, осуществляемая через верхнюю стенку, может быть усилена путем нанесения штаммов или покрытия на любую поверхность нижней стенки с использованием окрашенного или отражающего материала для повышения цветового контраста.
Испытательное устройство может быть изготовлено различными путями. Например, листы из полимерного материала с соответствующими выемками, определяющими форму камеры, с отверстиями для ввода образца и с вентиляционными отверстиями, могут быть наслоены друг на друга. Глубина камеры, а также ее форма и поперечные размеры определяются толщиной центрального листа, тогда как положение отверстий будет регулироваться верхним листом. Покрытия индикатора и реагента могут быть нанесены на верхний лист, нижний лист или на оба листа, если это необходимо, после чего листы соединяют, образуя слоеную конструкцию. Для надежности указанные листы могут быть затем скреплены вместе любым стандартным способом, например, путем сварки или скрепления с использованием адгезивов.
Особенно предпочтительный способ получения устройства настоящего изобретения состоит в том, что для этой цели используют всего один лист из прозрачного или какого-либо другого светопроницаемого полимерного материала, который подвергают тиснению или какой-либо другой механической или химической обработке в определенных участках таким образом, чтобы внутренняя поверхность камеры содержала углубление или выемку одинаковой глубины. Это углубление находится на одной половине листа, тогда как отверстие для ввода образца и вентиляционные отверстия находятся на другой половине листа. На определенные участки листа наносят покрытия индикатора и реагента, после чего этот лист складывают таким образом, чтобы его половина, содержащая указанные отверстия, накладывалась на другую половину, образуя тем самым закрытую камеру с точным соответствием площадей, представляющих собой верхнюю и нижнюю поверхности камеры. Противоположные поверхности листа (т.е. поверхности разворота) скрепляются вместе способами, указанными в предыдущем абзаце для получения ламината.
В предпочтительном методе скрепления двух половин листа предусматривается использование клея, активируемого нагреванием, склеивающего при надавливании, на водной основе или на основе растворителя. Во избежании контакта с реагентами, участвующими в испытании, этот клей может быть нанесен на периферические участки, удаленные от камеры, либо он может покрывать всю поверхность листа, но в этом случае этот клей должен быть нанесен перед нанесением покрытий индикатора и реагентов. В последнем случае необходимо использовать клей, который является прозрачным, инертным, смачиваемым и совместимым по каким-либо другим параметрам со слоями, которые наносятся на этот клей. Существует много типов адгезивов, удовлетворяющих указанным требованиям, и выбор наиболее подходящего из них варьируется от одной системы к другой в зависимости от наносимых на них слоев.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к испытательному устройству для проведения анализа образца на наличие кандидоза путем детекции присутствия ферментативно активной аспарагиновой протеазы, где указанное испытательное устройство включает в себя: приемник, образуемый частично первой и второй противоположными стенками с обращенными друг к другу внутренними поверхностями и с зазором между ними, причем первая, вторая или обе стенки изготовлены из светопроницаемого материала; фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе на внутренней поверхности первой или второй стенки таким образом, что этот фермент-репортер высвобождается под действием аспарагиновой протеазы; индикатор, иммобилизованный на внутренней поверхности первой или второй стенки, и обладающий способностью подвергаться детектируемому изменению под действием фермента-репортера; отверстие в указанном приемнике для введения образца.
Фермент-репортер или фермент-маркер, используемый в этом испытательном устройстве, может быть любым сигналгенерирующим ферментом, который не подвергается инактивации каким-либо агентом, присутствующим в образце, включая инактивацию посредством гидролиза под действием любой активной аспарагиновой протеазы или любой другой активной гидролазы, присутствующей в образце. Такими ферментами-репортерами являются (но не ограничиваются ими): пероксидазы, фосфатазы, оксидоредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. Особенно предпочтительными ферментами-репортерами являются пероксидазы, например пероксидаза хрена.
Фермент-репортер иммобилизуют на первом твердом носителе, т.е. на нерастворимой матрице, геле или смоле таким образом, чтобы этот фермент-репортер высвобождался под действием аспарагиновой протеазы. Фермент-репортер может быть иммобилизован на твердом носителе посредством линкерной молекулы, имеющей гидролизуемую связь, которая является субстратом для аспарагиновой протеазы. В этом испытательном устройстве такими линкерными молекулами являются белки и пептиды, при этом предпочтительными линкерными молекулами являются белки. Если линкерной молекулой является белок, то предпочтительными белками являются (но не ограничиваются ими): азо-казеин, казеин, каппа-казеин, иммуноглобулин, гемоглобин, миоглобин, альбумин, эластин, кератин и коллаген. В предпочтительном варианте испытательного устройства настоящего изобретения линкерной молекулой является каппа-казеин, казеин, гемоглобин или миоглобин.
В испытательном устройстве настоящего изобретения индикатор иммобилизуют на втором твердом носителе, который не контактирует первым твердым носителем. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными твердыми носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые гранулы, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталаты, поликарбонаты и стекло с порами определенного размера. Иммобилизацию индикатора на втором носителе осуществляют с использованием стандартных методов, известных каждому специалисту.
Индикатором может быть любое химическое соединение, которое подвергается детектируемому изменению в результате реакции или кульминации реакций, происходящих в том случае, если в образце или препарате присутствует ферментативно активная гидролаза. Индицируемое в результате этого детектируемое изменение указывает на то, что ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в данном образце, а присутствие в образце ферментативно активной аспарагиновой протеазы в свою очередь свидетельствует о наличии кандидоза. Предпочтительными индикаторами являются визуальные индикаторы, а в частности хромогенные индикаторы, т.е. такие индикаторы, в которых видимым изменением является изменение окраски, включая образование окраски в другом бесцветном материале под действием фермента-репортера или фермента-маркера, в том случае, если он отделяется от твердого носителя с помощью ферментативно активной аспарагиновой протеазы, присутствие которой детектируется в данном анализе.
В качестве визуальных индикаторов могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т.е. хромогены) широкого ряда, а также другие соединения, имеющие аналогичное действие. Если в качестве высвобождаемого фермента-репортера используется пероксидаза, то в соответствии с настоящим изобретением предпочтительные хромогенные индикаторы состоят из гидропероксида и хромогена, представляющего собой одно из следующих соединений (но не ограничиваясь ими): гваяковая смола, 2-2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол 4-аминоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновая кислота. Особенно предпочтительный хромогенный индикатор состоит из гидропероксида и гваяковой смолы, которая является бесцветной в восстановленном состоянии и темно-синей в окисленном состоянии.
Если визуальным индикатором является хромогенный индикатор для пероксидаз или псевдопероксидаз, то в этом случае используется твердая хромогенная система, которая состоит из гидропероксида, хромогена, способного подвергаться окислению гидропероксидами в присутствии пероксидазы и твердого носителя, который пропитывают хромогеном или на котором иммобилизуют хромоген, а затем высушивают. В этой системе хромоген может пропитывать промокательную бумагу или носитель, как это было сделано в случае с микропрепаратами Hemoccult®, или альтернативно хромоген может быть осажден тонким слоем на пластике или на другом материале, изготовленном в виде листа. В этом последнем варианте хромоген может быть нанесен в виде раствора, содержащего полимерный материал (например, такой как гидроксипропилцеллюлоза, этилцеллюлоза и т.п.). Если хромоген сам является водорастворимым, то он может быть включен в матрицу из материала, который не растворяется в воде. Альтернативно, если хромоген не растворяется в воде, то он может быть нанесен в виде раствора в органическом растворителе, как отдельно, так и в комбинации с растворимым или нерастворимым в воде полимером.
В указанной твердой хромогенной системе может быть использован гидропероксид в твердой форме (например, гидропероксид титана), либо он может быть генерирован in situ в данном испытательном устройстве. В присутствии гидропероксида и пероксидазы после ее отделения от первого твердого носителя под действием ферментативно активной аспарагиновой протеазы хромоген окисляется, в результате чего наблюдается визуально обнаруживаемое изменение окраски. Как было упомянуто выше это изменение окраски свидетельствует о том, что ферментативно активная аспарагиновая протеаза присутствует в данном образце или препарате, что в свою очередь указывает на наличие кандидоза. И в последнем аспекте настоящее изобретение относится к испытательному устройству для проведения анализа образца на присутствие в нем ингибитора целевой гидролазы, где указанное испытательное устройство включает в себя: приемник, образуемый, частично, первой и второй противоположными стенками с обращенными друг к другу внутренними поверхностями и с зазором между ними, причем первая, вторая или обе стенки изготовлены из светопроницаемого материала; целевую гидролазу, находящуюся на внутренней поверхности первой или второй стенки и способную подвергаться инактивации в присутствии ингибитора; фермент-репортер, иммобилизованный на твердом носителе на внутренней поверхности первой или второй стенки таким образом, что этот фермент-репортер высвобождается под действием целевой гидролазы в том случае, если эта гидролаза не инактивируется вследствие присутствия ингибитора; индикатор, иммобилизованный на внутренней поверхности первой или второй стенки и способный подвергаться детектируемому изменению под действием фермента-репортера, и отверстие в указанном приемнике для ввода образца.
Для обнаружения присутствия ингибитора гидролазы в образце в испытательное устройство вводят определенное количество целевой гидролазы либо непосредственно перед проведением испытания, либо, что предпочтительно, в процессе изготовления данного испытательного устройства. Осуществление испытания предусматривает определение способности данного образца ингибировать целевую гидролазу. Если ингибитор целевой гидролазы отсутствует в образце, то целевая гидролаза будет способствовать отделению фермента-репортера от твердого носителя, в результате чего в индикаторе будет индуцироваться детектируемый ответ. И наоборот, если ингибитор целевой гидролазы присутствует в образце, то целевая гидролаза будет ингибироваться, в результате чего фермент-репортер не будет определяться от твердого носителя, а в индикаторе не будет наблюдаться детектируемое изменение или детектируемый ответ. При этом совсем не обязательно, чтобы ингибитор, присутствующий в образце, полностью ингибировал целевую гидролазу, добавленную в испытательное устройство. Необходимо только, чтобы целевая гидролаза ингибировалась в количестве, достаточном для продуцирования заметного изменения в ожидаемом детектируемом ответе. Элементы положительного и отрицательного контроля, имеющиеся в испытательном устройстве, позволяют проводить сравнение ответов в целях иллюстрации внешнего вида полностью ингибированной целевой гидролазы и неингибированной целевой гидролазы.
Если необходимо, то чувствительность описанной технологии высвобождения фермента может быть скорректирована путем введения определенных количеств целевой гидролазы в целевое устройство. Аналогичным образом, если необходимо, время, в течение которого целевая гидролаза подвергается действию любого ингибитора, присутствующего в образце, может регулироваться путем физического или химического отделения целевой гидролазы от иммобилизованного фермента-репортера. Например, с помощью покрытия иммобилизованного фермента-репортера в матрице с пролонгированным высвобождением, pH-деградируемого покрытия или другого материала с регулируемым высвобождением и относительно медленным растворением, можно регулировать временной доступ целевой гидролазы к иммобилизованному ферменту-репортеру. Альтернативно, целевая гидролаза может присутствовать в определенном месте или в определенной химической форме, которая является непосредственно доступной для любого ингибитора, присутствующего в образце. Поэтому до того, как целевая гидролаза будет доступной иммобилизованному ферменту-репортеру, она может быть сначала подвергнута воздействию ингибитора в течение периода времени, достаточного для осуществления ингибирования. Поскольку доступ к иммобилизованному ферменту-репортеру может быть подвергнут временному регулированию, то в данном тесте может быть обнаружено присутствие даже очень медленно действующих ингибиторов.
Это испытательное устройство настоящего изобретения может быть использовано для анализа на присутствие или отсутствие любого известного ингибитора гидролитического фермента, включая (но не ограничиваясь ими) ингибиторы протеаз или протеиназ (эти термины являются взаимозаменяемыми), пептидаз, липаз, нуклеаз, гомо- или гетероолигосахаридаз, гомо- или гетерополисахаридаз, фосфатаз, сульфатаз, нейраминидаз и эстераз. В предпочтительном варианте это испытательное устройство используется для анализа на присутствие ингибиторов протеаз, включая (но не ограничиваясь ими): ингибиторы аспарагиновой протеазы, ингибиторы сериновой протеазы, ингибиторы тиоловой протеазы, ингибиторы металлопротеазы, ингибиторы кислой протеазы и ингибиторы щелочной протеазы. В более предпочтительном варианте это испытательное устройство используется для анализа на присутствие ингибиторов аспарагиновой протеазы, например, таких как пепстатин, овомакроглобулин, галоперидол, имитаторы переходного состояния, U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 и A-7003. U-81749, H-261, MV7-101, A-75925, A-76928 и A-7003 представляют собой экспериментальные лекарственные средства, которые были ранее описаны в литературе. В еще более предпочтительном варианте этого испытательного устройства настоящего изобретения детектируемым ингибитором аспарагиновой протеазы является пепстатин.
В соответствии с настоящим изобретением в данном испытательном устройстве целевыми гидролазами являются (но не ограничиваются ими): протеазы, протеиназы, пептидазы, липазы, нуклеазы, гомо- или гетероолигосахаридазы, гомо- или гетерополисахаридазы, фосфатазы, сульфатазы, нейраминидазы и экстеразы. Выбор конкретной целевой гидролазы, используемой в данном испытательном устройстве, зависит от ингибитора, присутствие которого определяется в данном анализе, и может быть легко осуществлен специалистом. Так, например, если детектируемым ингибитором является пепстатин, то в качестве целевой гидролазы в вышеописанном испытательном устройстве должна быть использована аспарагиновая протеаза. Кроме того, подходящие концентрации целевой гидролазы, геометрическая локализация целевой гидролазы в испытательном устройстве, а также подходящие технологии и матрицы временного и регулируемого высвобождения известны специалистам.
Как и в других испытательных устройствах настоящего изобретения, фермент-репортер или фермент-маркер, используемый в данном конкретном испытательном устройстве, может быть любым сигналгенерирующим ферментом, т.е. ферментом, активность которого вызывает видимое или обнаруживаемое изменение и который не подвергается инактивации каким-либо агентом, присутствующим в образце, включая инактивацию посредством гидролиза под действием целевой гидролазы, присутствующей в испытательном устройстве. Такими ферментами-репортерами являются (но не ограничиваются ими): пероксидазы, фосфатазы, оксиредуктазы, дегидрогеназы, трансферазы, изомеразы, киназы, редуктазы, деаминазы, каталазы, уреаза и глюкуронидаза. Выбор подходящего фермента-репортера или фермента-маркера может быть легко осуществлен любым специалистом. В этом испытательном устройстве настоящего изобретения предпочтительными ферментами-репортерами являются пероксидазы, а в частности пероксидаза хрена.
Фермент-репортер иммобилизуют на твердом носителе, т.е. на нерастворимой матрице, геле или смоле таким образом, чтобы этот фермент высвобождался под действием целевой гидролазы в том случае, если эта целевая гидролаза не инактивируется присутствием ингибитора. В соответствии с настоящим изобретением твердыми носителями являются (но не ограничиваются ими): целлюлоза, агароза, декстран, полиакрилат, полиаакриламид, или их производные, хитин, сефароза, оксиранакриловые гранулы, полимерный диальдегид, крахмал, коллаген, кератин, эластин, порошок из бычьей кожи, пептидогликан клеточной стенки бактерии или его фрагменты, найлон, полиэтилентерефталат, поликарбонаты и стекло с порами определенного размера.
Как обсуждалось выше, фермент-репортер может быть иммобилизован на твердом носителе посредством линкерной молекулы, которая является гидролизуемым субстратом для ферментативно активной целевой гидролазы. Такими ленкерными молекулами являются (но не ограничиваются ими): белки, углеводы, липиды, пептиды, сложные эфиры и нуклеиновые кислоты. Выбор конкретной линкерной молекулы, используемой для связывания фермента-репортера с твердым носителем, зависит от конкретной целевой гидролазы, вводимой в данное испытательное устройство, и может быть легко осуществлен каждым специалистом.
Индикатором может быть любое химическое соединение, которое подвергается детектируемому изменению в результате реакции или кульминации реакций, происходящих под действием ферментативно активной целевой гидролазы в том случае, если эта целевая гидролаза не инактивируется вследствие присутствия ингибитора в образце или препарате. Предпочтительными являются визуальные индикаторы, а в частности хромогенные индикаторы, т.е. такие индикаторы, в которых детектируемым изменением является изменение окраски, включая образование окраски в другом бесцветном материале под действием фермента-репортера или фермента-маркера в том случае, если он отделяется от твердого носителя посредством ферментативно активной целевой гидролазы при условии, что эта целевая гидролаза не инактивируется благодаря присутствию ингибитора в образце или препарате.
В качестве визуальных индикаторов могут быть использованы различные хромогенные индикаторы (т.е. хромогены) широкого ряда, а также другие соединения, обладающие аналогичным действием. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные хромогенные индикаторы для пероксидазоподобных ферментов-репортеров состоят из гидропероксида и хромогена, представляющего собой следующие соединения (но не ограничиваясь ими): гваяковая смола, 2-2'-азино-бис(3-этил-бентиазолин-6-сульфоновая кислота), тетраметилбензидин, фенол, 4-аминоантипирин и 4,5-дигидроксинафталин-2,7-дисульфоновая кислота. Особенно предпочтительный хромогенный индикатор состоит из гидропероксида и гваяковой смолы, т.е. хромогена, который является бесцветным в восстановленном состоянии и темно-синим в окисленном состоянии. Как было описано ранее, если визуальным индикатором является хромогенный индикатор, то в этом случае может быть использована либо жидкая хромогенная система, либо твердая хромогенная система.
При этом следует отметить, что предыдущее обсуждение, касающееся структуры испытательного устройства для проведения анализа на присутствие гидролазы, его конструкции и предпочтительных вариантов этого устройства, полностью применимо к испытательному устройству для испытания образца на наличие кандидоза путем проведения анализа на присутствие ферментативно активной аспарагиновой протеазы, а также к испытательному устройству для проведения анализа образца на присутствие ингибитора целевой гидролазы.
Хотя настоящее изобретение не ограничивается какой-либо конкретной конструкцией испытательного устройства, однако на рисунках, прилагаемых к настоящему описанию и начерченных без соблюдения масштаба, иллюстрируется один из возможных способов изготовления такого устройства.
На фиг. 1 показана опорная конструкция данного устройства, изображенного в перспективе до нанесения индикатора и реагентов и до закрытия камеры. Эта опорная конструкция состоит из одного листа 11, сделанного из относительного жесткого, прозрачного, химически инертного пластика, на котором отмечена линия сгиба 12, разделяющая этот лист на две половины 13, 14, имеющие одинаковую длину и ширину. Нижняя половина 13 содержит углубление сложной формы, состоящее из окружности 15 в центре с двумя прямоугольными удлинениями 16, 17, расположенными в разные стороны. Верхняя половина 14 имеет три отверстия, включая центральное отверстие 18, которое служит в качестве отверстия для ввода образца и два боковых отверстия 19, 20, которые служат в качестве вентиляционных отверстий. Эти два вентиляционных отверстия 19, 20 являются круглыми, а отверстие для ввода образца 18 представляет собой окружность с прямым краем, сделанным для удобства при соскабливании образца с тампона, который используется в качестве переносчика. Указанные отверстия расположены таким образом, что при складывании пластика по линии сгиба 12 и при контакте верхней половины 14 с нижней половиной 13, отверстие для ввода образца 18 находится над центром круговой части 15 углубления, а вентиляционные отверстия 19, 20 находятся над двумя прямоугольными удлинениями 16, 17 у краев, наиболее удаленных от центра. Эти два прямоугольных удлинения 16, 17 представляют собой положительную и отрицательную контрольные зоны данного устройства.
Устройство, изображенное на фиг. 1, может быть изготовлено в множестве вариантов. Например, две половины 13, 14 могут иметь разную длину, ширину либо то и другое. Данная конструкция имеет лишь один важный отличительный признак, который заключается в том, что углубления в нижней половине и отверстия в верхней половине должны быть расположены относительно линии сгиба таким образом, чтобы при сложении этих двух половин по линии сгиба, указанные углубления и отверстия совмещались так, как это необходимо для работы данного устройства. В качестве другого примера можно указать на конструкцию, где прямоугольные удлинения 16, 17 в нижней половине данного устройства могут заканчиваться кругом (или полукругом) для полного соответствия вентиляционным отверстиям 19, 20 в верхней половине. Сами вентиляционные отверстия могут иметь любую форму. Действительно вентиляционные отверстия, форма которых отличается от формы отверстия для ввода образца 18, имеют то преимущество, что пользователь уже не сможет спутать эти отверстия с отверстием для ввода образца.
На фиг. 2 показан вид сбоку в разрезе устройства, проиллюстрированного на фиг. 1, где изображена камера 31 (в разрезе) после нанесения покрытий и после сложения двух половин друг с другом с последующим их герметичным скреплением. Внутренние поверхности каждой из двух половин 13, 14 прозрачного полимера покрывают клеем 32, 33, соответственно. Непосредственно ниже верхнего слоя 33 находится слой, содержащий визуальный индикатор 34, а ниже этого слоя индикатора находится слой реагента 35. При этом следует отметить, что слой визуального индикатора 34 и слой реагента 35 могут простираться по всей длине и ширине камеры, окружая отверстие для ввода образца 18 и распространяясь на все области камеры.
Испытательная и контрольные зоны камеры определяются горизонтальным положением покрытий на нижней стенке 13 камеры. Реагент для отрицательного контроля содержится в одном из покрытий 36, которые занимает нижнюю поверхность одного из двух прямоугольных удлинений 16 камеры (см. фиг. 1), а реагент для позитивного контроля содержится во втором покрытии 37, которое аналогичным образом находится на другом прямоугольном удлинении 17. Альтернативно, контрольные реагенты могут быть помещены не на нижнюю поверхность камеры, а на ее верхнюю поверхность. Для некоторых анализов такое расположение реагентов является более предпочтительным. Часть нижней поверхности, находящуюся под центральной круговой частью 15 камеры (см. фиг. 1), покрывают слоем 38, который может содержать дополнительный реагент, используемый в аналитической реакции, либо может вообще не содержать никаких реагентов. Так, например, если смотреть на закрытую камеру сверху, то с двух диаметрально противоположных сторон круговой испытательной зоны 41 располагаются прямоугольные зоны отрицательного контроля 42 и положительного контроля 43. Три сегмента 36, 37, 38 могут быть разделены зазорами или разрывами 44, 45 для замедления или минимизации диффузии между этими сегментами или контакта между содержимым этих сегментов. Непосредственно над разрывами 44, 45 в нижнем слое могут присутствовать аналогичные разрывы в любом из слоев визуального индикатора и реагента или в обоих этих слоях 34, 35. Разрывы в слоях визуального индикатора и реагента служат дополнительным препятствием для диффузии контрольных компонентов или других реагентов из контрольных зон в испытательную зону. Большинство обращенных вовнутрь слоев 35, 36, 37, 38 могут, помимо присутствующих в них реагентов, содержать смачивающий агент или детергент для стимулирования быстрого и полного распространения образца вдоль верхней и нижней поверхностей с заполнением всей камеры. В некоторых случаях аналогичный эффект может быть достигнут с использованием слоя белка.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения качество реагентов может ухудшаться при продолжительном воздействии на них воздуха или содержащейся в воздухе влаги. В устройстве, показанном на фиг. 2, это явление может быть предотвращено путем использования тонкого листа, сделанного из материала 46, который не пропускает воздух и влагу. Этот лист закрывает отверстие для ввода образца и оба вентиляционных отверстия, охраняя тем самым камеру от воздействия окружающей среды до ее использования, а когда данное устройство будет готово к использованию, этот лист легко снимается. Если используемые материалы являются особенно чувствительными к воздействию воды или воздуха, то желательно, чтобы и нижняя поверхность данного устройства была покрыта влаго- и воздухонепроницаемым листовым покрытием, которое может быть либо постоянным, либо съемным. Дополнительная защита от воздействия влаги и воздуха может быть осуществлена путем помещения данного устройства в упаковку, которая полностью закрывает это устройство.
Как указывалось выше, размеры устройства, показанного на фиг. 1 и 2, а также его конструкция и форма могут варьироваться. Однако одним из типичных примеров может служить конструкция, в которой опорный лист представляет собой Mylar® имеющий толщину 5 милов (0,005 дюймов, 0,0127 см); адгезивный слой представляет собой полиэтилен низкой плотности толщиной 2 мила (0,002 дюймов, 0,0051 см); ширина зазора 47 составляет 7,5 мила (0,0075 дюймов, 0,019 см), площадь испытательной зоны представляет собой окружность диаметра 5/16 дюймов (площадь: 0,0766 кв. дюймов, 0,494 см2), а размеры отрицательной и положительной контрольных зон составляют каждая 1/8 и 1/16 дюймов (площадь: 0,0078 кв. дюймов, 0,0504 см2). В этом примере вентиляционные отверстия являются круглыми, причем размеры этих отверстий, а также отверстия для ввода образца составляют (каждое) 1/8 дюймов (0,32 см) в диаметре. Объем камеры составляет приблизительно 12 мкл.
Испытуемое устройство настоящего изобретения может быть использовано для анализа образцов на присутствие гидролазы, происходящей от различных источников широкого ряда, включая биологические источники и др. Примерами таких источников могут служить физиологические жидкости, такие как кровь, сыворотка, плазма, моча, выделения из мочеиспускательного канала, слезы, вагинальные выделения, цервикальный экссудат, цереброспинальная жидкость и слюна, а также нефизиологические жидкости такие, как пищевые продукты, вода в прудах и бассейнах для плаванья и жидкие отходы.
Примеры
1. Получение
A. Получение твердых носителей, активированных бромцианом
1. Материалы
a. Твердые нерастворимые носители (Сефароза 4B, хитин, и Sigmacell® 20 (закупленные фирмой Sigma Chemical Co));
b. Дистиллированная вода и лед из дистиллированной воды;
c. 4,0 М NaOH;
d. Твердый CNBr;
e. Связующий буфер (0,1 М NaHCO3, содержащий 0,5 М NaCl);
f. Двигатель магнитной мешалки и стержень для перемешивания, pH-метр и химический вытяжной шкаф.
2. Порядок выполнения
10 мл холодной дистиллированной воды добавляют к 5 г влажного, промытого твердого носителя и полученную смесь охлаждают до температуры 10-15oC. Затем pH этой суспензии доводят до значения 10,8 и поддерживают, если это необходимо при помощи 4,0 NaOH, после чего добавляют 100 мг твердого измельченного CNBr на 1 г влажного твердого носителя. Затем температуру суспензии повышают до 18-20oC в течение процесса активации. Активация считается завершенной, если для подержания pH, равной 10,8, больше не требуется добавления 4,0 М NaOH. На этой стадии для охлаждения реакционной смеси добавляют измельченный лед и суспензию фильтруют через предварительно охлажденную воронку из спеченного стекла. Полученный фильтрат собирают в отсасывающей колбе, содержащей твердый сульфат железа (II), инактивирующий остаточный CNBr и цианид, оставшийся в реакционной смеси. Твердый носитель промывают холодной дистиллированной водой (1 л) и связующим буфером (1 л), в вакууме, а затем выдерживают при 4oC в виде влажной пасты.
B. Получение конъюгатов [каппа-казеин-HRPO] (гидразивный метод)
1. Материалы
a) Каппа-казеин и гидразид пероксидазы хрена обыкновенного (HRPO) (закупаемые фирмой Sigma Chemical Co.).
b) Дистиллированная вода;
c) Буферы:
i) 50 мМ 2-[Морфолино(этансульфоновая кислота)] (MES)-буфер, pH 6,0
ii) 100 мМ натриевый буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
iii) 100 мМ борат натрия (pH 9,0), содержащий 0,5 М хлорида натрия;
d) Твердый периодат натрия;
e) 100 мМ Формальдегид.
2. Порядок выполнения
a) Активация периодата каппа-казеина
20 мг каппа-казеина растворяют в 2 мл MES-буфера и к раствору добавляют 8,6 мг твердого периодата натрия. Затем полученную смесь инкубируют на роторе в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре. Реакционную смесь диализируют приблизительно 300 мл 50 мМ MES, pH 6,0 в течение приблизительно 45 минут при комнатной температуре, после чего жидкость для диализа заменяют и диализ проводят в течение еще 45 минут.
b. Ковалентное связывание HRPO с каппа-казеином
5 мг гидроазида пероксидазы хрена обыкновенного (HRPO) (приблизительно 175 единиц/мг белка), довносят в активированный диализованный каппа-казеин и полученную смесь инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре, перемешивая при этом. К этой смеси добавляют 200 микролитров 100 мМ формальдегида и инкубируют при комнатной температуре в течение еще 30 минут. Затем к смеси приливают 2 мл 1 М холодного ацетатного буфера (pH 4,0) и конъюгат осаждают в течение 30 минут при температуре 4oC. Образовавшийся осадок удаляют путем центрифугирования, повторно растворяют в 2 мл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0) и хранят при температуре 4oC, после чего используют по назначению.
C. Связывание конъюгатов /каппа-казеин-HRPO/ (гидразидный метод) с носителями, активированными бромцианом
1. Материалы
a) Конъюгаты /каппа-казеин-HRPO/ (пример B);
b) Дистиллированная вода;
c) Буферы:
i) Связующий буфер (0,1 М NaHCO3, содержащий 0,5 М хлорида натрия);
ii) 1,0 М Трис-буфер, pH 8,0;
iii) 100 мМ ацетат-натриевый буфер, (pH 4,0), содеражщий 0,5 М NaCl;
iv) 100 мМ боратнатриевый буфер (pH 9,0), содержащий 0,5 М NaCl;
d) Сефароза 4B и Sigmacell® 20, активированные бромцианом (пример A);
e) Сефароза 6 MB (от фирмы Sigma Chemical Co.), активированная бромцианом.
2. Порядок выполнения
a) Сефароза 4B и Sigmacell® 20, активированные бромцианом
2 мл конъюгата каппа-казеин-HRPO, полученного из гидразида HRPO, как описано в примере B, разводят 3 мл связующего буфера и добавляют к 1 г влажной бромцианактивированной Сефарозы 4B или Sigmacell® Полученную суспензию непрерывно перемешивают в течение двух часов при комнатной температуре. Твердый носитель промывают связующим буфером и водой, а затем прибивают 3 мл 1,0 М Трис-буфера, pH 8. Затем суспензию инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре для инактивации оставшихся активных сайтов на твердом носителе. Для удаления несвязанных материалов из носителя используют три цикла промывок, каждый из которых осуществляют ацетатным буфером с pH 4,0, а затем связующим буфером. Окончательную промывку осуществляют с использованием дистиллированной воды и влажную суспензию перед использованием хранят при температуре 4oC.
b) Промышленная активированная Сефароза 6 MB (Sigma Chemical Co.).
Влажный гель (1 г от влажной массы) промывают 200 мл 1 мМ соляной кислоты перед тем, как использовать его в соответствии с описанием, приведенным выше.
C) Активированный хитин
Повторяют ход работы, описанной в примере A за исключением того, что вместо 1 г используют 500 мг влажного активированного хитина.
D. Получение альдегида пероксидазы хрена обыкновенного (HRPO)
1. Материалы
a. HRPO, Тип II, 200 единиц/мг (от фирмы Sigma Chemical Co);
b. 20 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновокислотный (MES)-буфер, pH 5,0;
c. Твердый периодат натрия
d. Biogel® P-30 (полиакриламидный гель в форме сфер, поставляемый фирмой Rio-Rad).
2. Порядок выполнения
25,7 мг (40 миллимоль) твердого периодата натрия добавляют к 30 мг пероксидазы хрена обыкновенного в 3 мл MES-буфера. Полученный раствор инкубируют в темноте в течение 30 минут при комнатной температуре с непрерывным вращением. Этот раствор пропускают через колонку P-30 в MES-буфере для удаления избыточного количества периодата натрия и окрашенную пероксидазу хрена обыкновенного собирают в полном объеме 3 мл. Полученный альдегид пероксидазы хрена обыкновенного (HRPO) сразу присоединяют к нужному белку (гемоглобину, миоглобину или казеину).
E. Связывание гемоглобина и миоглобина с бромцианактивированными твердыми носителями
1. Материалы
a. Твердые нерастворимые носители;
i. Бромцианактивированная сефароза 6MB (поставляемая фирмой Sigma Chemical Co.
ii. Sigmacell® 20 (описанный в примере A);
b. Дистиллированная вода
c. Буферы:
i. Связывающий буфер (0,1 М NaHCO3, содержащий 0,5 М NaCl)
ii. 1,0 М Трис-буфер, pH 8,0.
iii. 100 мМ ацетатнатриевый буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
iv. 100 мМ натриевый буфер (pH 8,0), содержащий 0,5 М NaCl
v. 0,1%-ный (об/об) глутаральдегидный раствор в воде.
2. Порядок выполнения
100 мг гемоглобина или миоглобина, растворенного в 5 мл связующего буфера, добавляют к 1 г влажного твердого носителя. Полученную суспензию непрерывно перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем твердый носитель промывают связующим буфером и водой, после чего добавляют 3 мл 1,0 М Трис-буфера (pH 8) и эту суспензию инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре для инактивации оставшихся активных центров на твердом носителе. Для удаления несвязанных материалов из носителя, используют три цикла промывания, каждый из которых осуществляют ацетатным буфером (pH 4,0), а затем боратным буфером, содержащим хлорид натрия. Для носителей, дериватизированных миоглобином, используют конечную промывку дистиллированной водой и влажную суспензию хранят при температуре 4oC вплоть до ее использования. Для носителей, дериватизированных гемоглобином, к влажной суспензии, полученной в соответствии с вышеописанной процедурой, добавляют 5 мл 0,1%-ного глутаральдегидного раствора и полученную суспензию инкубируют в течение ночи при температуре 4oC. Для удаления несвязанных материалов из носителя используют три цикла промывки, каждый из которых проводят ацетатным (pH 4,0), а затем боратными буферами (pH 8,0). После конечной промывки дистиллированной водой полученную влажную суспензию хранят при 4oC вплоть до ее использования.
F. Связывание альдегида пероксидазы хрена обыкновенного (HRPO) с носителями, дериватизированными гемоглобином или миоглобином
1. Материалы
a. Альдегид HRPO, полученный способом, описанным в примере D.
b. Твердые носители, дериватизированные гемоглобином или миоглобином и полученные способом, описанным в примере E
c. 100 мМ цианоборогидрида натрия
d. 1,0 М NaCl
e. Дистиллированная вода.
2. Порядок выполнения
3 мл альдегида HRPO (30 мг), полученного с колонки P-30 (пример D), добавляют к 1 г твердых носителей, дериватизированных гемоглобином или миоглобином и описанных в примере E. Образовавшуюся суспензию инкубируют в течение 16 часов при температуре 4oC, а затем в течение 4 часов при комнатной температуре. Для удаления несвязанных материалов из носителя используют три цикла промываний, каждый из которых проводят с использованием дистиллированной воды и 1,0 М NaCl. Затем твердый носитель инкубируют 5 мл 100 мМ цианоборогидрида в течение ночи при температуре 4oC. После окончательной промывки дистиллированной водой влажную суспензию хранят при 4oC вплоть до ее использования.
C. Получение альдегидактивированного Sigmacell® 20
1. Материалы:
a. Sigmacell® 20 (поставляемый фирмой Sigma Chemical Co.).
b. Дистиллированная вода
c. Твердый периодат натрия
d. 20 мМ Бикарбонат натрия, pH 9,5.
2. Порядок выполнения
Твердый периодат натрия (428 мл) добавляют к 1 г Sigmacell®, суспендированному в 10 мл дистиллированной воды. Полученную смесь непрерывно перемешивают путем вращения в течение 2 часов при комнатной
температуре. Образовавшийся осадок удаляют путем центрифугирования, а затем промывают пять раз 10 мл дистиллированной воды и один раз 10 мл 20 мМ бикарбоната натрия pH 9,5. Продукт в виде смолы используют непосредственно после получения.
H. Ковалентное связывание гемоглобина и миоглобина с альдегидактивированным Sigmacell® 20
1. Материалы
a. Альдегидактивированный Sigmacell® 20 (получение G)
b. Дистиллированная вода
c. 100 мМ цианоборогидрид натрия
d. Гемоглобин человека и миоглобин сердца лошади (поставляемые фирмой Sigma Chemical Co.
e. Буферы:
i. 20 мМ бикарбонат натрия, pH 9,5
ii. 50 мМ этаноламин, pH 9,5
iii. 100 мМ М-Трис-буфер (pH 8,0), содержащий 0,5 М хлорид натрия
iv. 100 мМ ацетатнатриевый буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
v. 20 мМ MES-буфер, pH 5,0.
2. Порядок выполнения
50 мг миоглобина или гемоглобина, растворенного в 9 мл бикарбоната натрия (pH 9,5), добавляют к 1 мл альдегидактивированного Sigmacell® 20 (пример G). Полученную суспензию перемешивали путем вращения в течение ночи при комнатной температуре, а образовавшийся осадок удаляют путем центрифугирования. Осадок после центрифугирования промывают 10 мл воды. После добавления 9 мл 50 мМ этаноламина (pH 9,5) смесь непрерывно перемешивают путем вращения при комнатной температуре в течение одного часа. Образовавшийся осадок отделяют путем центрифугирования и последовательно промывают 10 мл ацетатного буфера, 10 мл Трис-буфера и 10 мл MES-буфера. После добавления 20 мг водного раствора 100 мМ цианоборогидрида натрия, смесь инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре и при непрерывном вращении, а затем инкубируют в течение ночи при 4oC. После чего дериватизированный носитель пять раз промывают 10 мл аликвотами дистиллированной воды и дважды промывают 10 мл аликвотами MES-буфера.
I. Ковалентное связывание альдегида HRPO с гемоглобином или миоглобином, иммобилизованными на альдегидактивированном Sigmacell® 20
1. Материалы:
a. Sigmacell® 20, дериватизированный гемоглобином или миоглобином (получение H)
b. Дистиллированная вода
c. 100 мМ цианоборогидрид натрия
d. Буферы:
i. 100 мм Трис-буфер (pH 8,0), содержащий 0,5 М NaCl
ii. 100 мМ ацетатнатриевый буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
iii. 20 мМ MES-буфер с pH 5,0.
e. Альдегидактивированная HRPO (пример D).
2. Порядок выполнения
20 мг обессоленного альдегида HRPO (пример), растворенного в 2 мл MES-буфера (pH 5,0), добавляют к 1 г Sigmacell® 20, дериватизированного гемоглобином или миоглобином (пример H) и полученную суспензию перемешивают при вращении в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем инкубируют в течение ночи при температуре 4oC. Носитель отделяют путем центрифугирования и дважды промывают 10 мл аликвотами дистиллированной воды. После добавления 20 мл 100 мМ цианоборогидрида натрия суспензию инкубируют в течение 60 часов при температуре 4oC. Образовавшийся осадок последовательно (дважды) промывают дистиллированной водой, ацетатным буфером, Трис-буфером и MES-буфером.
J. Ковалентное связывание гемоглобина с изготавливаемым промышленностью Eupergit® C (гранулы акриловой кислоты)
1. Материалы
a. Оксиранакриловые гранулы ( Eupergit® C от фирмы Sigma Chemical Co.)
b. Гемоглобин человека (тип IV от фирмы Sigma Chemical Co.)
c. Буферы и растворы:
i. 1.0 М калийфосфатный буфер (pH 7,5), содержащий 0,1% азид натрия (мас./об.)
ii. 1,0 М NaCl
iii. 5% (об./об.) меркаптоэтанол, доведенный до pH 8,0 путем добавления 0,5 M NaOH
iv. 100 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,4.
v. 500 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,4
vi. 3,5 М тиоцианат натрия
vii. Фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) (0,01 М фосфат натрия (pH 7,2), содержащий 0,15 М NaCl))
d. Дистиллированная вода.
2. Порядок выполнения
Гемоглобин (125 мг) растворяют в 5 мл 1,0 М фосфатного буфера (pH 7,5), содержащего азид натрия и добавляют к 1 г Eupergit® C. Полученную смесь инкубируют в течение 72 часов при комнатной температуре, перемешивая при этом. Носитель три раза промывают 1,0 М NaCl и пять раз дистиллированной водой. Затем носитель смешивают с 2,5 мл меркаптоэтанола, предварительно доведенного до pH 8,8 и полученную суспензию выдерживают в течение ночи при комнатной температуре. Продукт в форме гранул 10 раз промывают дистиллированной водой, а затем помещают в небольшую воронку из спеченного стекла и последовательно промывают 0,5 М калийфосфатным буфером (50 мл), pH 7,5; 0,1 М калийфосфатным буфером с pH 7,5 (50 мл), 3,5 М тиоцианатом натрия (50 мл) и, наконец, 50 мл большого объема фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) (0,01 М фосфат натрия, имеющий pH 7,2 и содержащий 0,15 М хлорид натрия). Дериватизированные гранулы обрабатывают 0,1%-ным (об./об.) глутаральдегидом путем вращения в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем в течение ночи при температуре 4oC, после чего промывают дистиллированной водой.
K. Ковалентное связывание альдегида HRPO (пример D) с Eupergit® C, дериватизированным гемоглобином (получение J)
1. Материалы:
a. Альдегид HRPO (пример D)
b. Eupergit® C, (дериватизированный гемоглобином (пример J)
c. 100 мМ цианоборогидрида натрия
d. 1,0 М NaCl
e. Дистиллированная вода.
2. Порядок выполнения
30 мг альдегида HRPO (пример D) в 3 мл ME-буфера смешивают с 1 г Eupergit® C (пример J), дериватизированного гемоглобином. Полученную суспензию инкубируют в течение 16 часов при температуре 4oC, а затем в течение 4 часов при комнатной температуре. Для удаления несвязанных материалов из носителя применяют три цикла промывок, каждое из которых проводят дистиллированной водой и 1,0 М NaCl. Затем твердый носитель инкубировали с 5 мл 100 мМ цианоборогидрида в течение 60 часов при температуре 4oC. После этого окончательно промывают дистиллированной водой и влажную суспензию хранят при температуре 4oC вплоть до ее использования.
Ковалентное связывание казеин-HRPO с полимерным диальдегидом
1. Материалы:
a. 25 мг конъюгата [каппа-казеин-HRPO], полученного гидразидным способом (пример B) и растворенного в 2 мл 100 мМ боратного буфера (pH 9,0)
b. Полимерный диальдегид (поставляемый фирмой Sigma Chemical Co.)
c. Буферы:
i. 100 мМ этаноламин, pH 9,5
ii. 100 мМ натрийборатный буфер с pH 9,0, содержащий 0,5 М NaCl
iii. 100 мМ натрийацетатный буфер с pH 4,0, содержащий 0,5 М NaCl
iv. 50 мМ MES-буфер, pH 6,0
d. 100 мМ формальдегид
e. 100 мМ цианоборогидрид натрия.
2. Порядок выполнения
2 мл конъюгата [каппа-казеин-HRPO] полученного способом, описанным в примере B за исключением того, что обработку формальдегидом не проводят. Полученный раствор смешивают с 3 мл MES-буфера и эту смесь добавляют к 1 г полимерного диальдегида. Затем суспензию перемешивают путем вращения при комнатной температуре в течение 6 часов и инкубируют в течение ночи при температуре 4oC. После этого к суспензии добавляют 200 мкл 100 мМ формальдегида и смесь инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. Полученную смолу удаляют путем центрифугирования, промывают водой и повторно суспендируют в 3 мл 100 мМ этаноламина с pH 8,5. После 2-часового инкубирования с вращением при комнатной температуре смолу последовательно промывают ацетатным буфером, боратным буфером и водой. Затем твердый носитель инкубируют с 5 мл 100 мМ цианоборогидрида в течение ночи при температуре 4oC. После этого окончательно промывают дистиллированной водой и влажную суспензию хранят при температуре 4oC вплоть до ее использования.
M. Связывание HRPO-меченного (альдегидный способ) цельного казеина или каппа-казеина с Eupergit® C (акриловые шарики)
1. Материалы:
a. Оксиранакриловые шарики ( Eupergit® C поставляемый фирмой Sigma Chemical Co.)
b. Цельный бычий казеин или каппа-казеин (поставляемые фирмой Sigma Chemical Co.
c. Буферы и растворы:
i. 100 мМ бикарбонат натрия (pH 8,5), содержащий 0,5 М NaCl
ii. 100 мМ натрийацетатный буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
iii. 100 мМ Трис-буфер (pH 8,0), содержащий 0,5 М NaCl
iv. 20 мМ MES-буфер, pH 5,0.
v. 5%-ный (об./об.) меркаптоэтанол в воде
vi. 200 мМ борогидрид натрия в воде.
d. Дистиллированная вода.
2. Порядок выполнения
a. Ковалентное связывание казеина или каппа-казеина с Eupergit® C
2 мл раствора, содержащего цельный казеин или цельный каппа-казеин (10 мг/мл) в 100 мМ буферном растворе бикарбоната натрия (pH 8,5) и содержащего 0,5 М NaCl, добавляют к 1 мл Eupergit® C в виде гранул, суспендированных в воде. Полученную смесь инкубируют, вращая в течение 48 часов при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и последовательно промывают 9 мл аликвотами ацетатного буфера и Трис-буфера, а затем дважды промывают 9 мл аликвотами ME-буфера. После добавления 10 мл 5%-ного меркаптоэтанола смесь инкубируют при перемешивании путем вращения в течение ночи при комнатной температуре. Носитель, дериватизированный казеином, отделяют центрифугированием и 4 раза промывают 9 мл MES-буфера.
b. Мечение казеина, иммобилизованного на Eupergit® C с использованием HRPO
3 мл HRPO, активированной альдегидом (пример D), добавляют к казеин дериватизированному Eupergit® C из вышеописанной стадии (A) и полученную смесь инкубируют, перемешивая путем вращения в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем в течение 60 часов при температуре 4oC. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и промывают двумя 10 мл аликвотами воды. После добавления к осадку водного раствора борогидрида натрия (5 мл) суспензию инкубируют в течение 6 часов при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отделяют путем центрифугирования и последовательно промывают 9 мл аликвотами ацетата, Трис, Ацетата, Трис и MES-буфера.
N. Ковалентное связывание пероксидазы хрена, активированной миоглобином с полимерным диальдегидом
1. Материалы:
a. 30 мг миоглобина сердца лошади, растворенного в 2 мл 20 мМ бикарбонат натриевого буфера с pH 9,5
b. Полимерный диальдегид (диальдегид целлюлозы, поставляемый фирмой Sigma Chemical Co.
c. Буферы:
i. 50 мМ этаноламин, pH 9,5
ii. 100 мМ борат натрия (pH 9,0), содержащий 0,5 М NaCl
iii. 100 мМ натрийацетатный буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
iv. 50 мМ ME-буфер, pH 6,0
v. 100 мМ Трис-буфер (pH 8,0), содержащий 0,5 М NaCl
vi. 100 мМ формальдегид
vii. 100 мМ цианоборогидрид натрия в воде.
2. Порядок выполнения
a. Ковалентное связывание миоглобина с полимерным диальдегидом
2 мл раствора миоглобина смешивают с 1 мл суспензии полимерного диальдегида и эту суспензию перемешивают, вращая в течение ночи при комнатной температуре. Полученную смолу отделяют путем центрифугирования и дважды промывают 10 мл аликвотами воды. После добавления 9 мл этаноламинового раствора, суспензию инкубируют, вращая в течение одного часа при комнатной температуре. Затем смолу выделяют путем центрифугирования и последовательно промывают 10 мл аликвотами ацетата, Трис и MES-буфера. После этого добавляют 20 мл цианоборогидрида натрия. Полученную суспензию инкубируют в течение ночи при температуре 4oC. Полимерный диальдегид, дериватизированный миоглобином, пять раз промывают 10 мл аликвотами воды и дважды промывают MES-буфером.
b. Мечение миоглобин-дериватизированных акриловых шариков с использованием альдегида HRPO (применение D)
К смоле приливают 2 мл обессоленного альдегида HRPO (пример D), и полученную суспензию инкубируют с вращением в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем в течение ночи при температуре 4oC. Полученную смолу выделяют путем центрифугирования, дважды промывают 10-миллилитровыми аликвотами воды, суспендируют в 20 мл цианоборогидрида натрия и инкубируют в течение 60 часов при температуре 4oC. Полученную смесь центрифугируют и полученную смолу дважды промывают 10-миллилитровыми аликвотами воды, а затем последовательно (дважды) промывают четырьмя 10-миллилитровыми аликвотами ацетата /NaCl и Трис/-NaCl-буфера. Полученную смолу промывают 10 миллилитрами MES-буфера и хранят при температуре 4oC вплоть до ее использования.
O. Получение HRPO-меченного хитина и его использование для анализа на присутствие хитиназы
1. Материалы:
a. Хитин, активированный бромцианом (пример A)
b. HRPO (Тип II от фирмы Sigma Chemical Co., 78 единиц/мг)
c. Хитиназа (EC 32114, выделенная из Streptomyces grisius и закупаемая фирмой Sigma Chemical Co.
d. Буферы:
i. 500 мМ Трис/MES-буферы, pH 5,4
ii. Связующий буфер, 100 мМ бикарбонат натрия, содержащий 0,5 М NaCl
iii. 100 мМ натрийацетатный буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
iv. 100 мМ натрийборатный буфер (pH 8,0), содержащий 0,5 М NaCl
v. 1,0 М Трис-буфер, pH 8,0
e. Аналитическая ABTS-смесь: 40 мкл 25 мг/мл ABTS (2,2'-Азино-ди[3-этилбензтиазолинсульфоновой кислоты, диаммониевая соль]: 10 мккл 1%-ного (об. /об.) пероксида водорода; и 950 мкл воды.
2. Порядок выполнения:
a. Получение хитина, дериватизированного пероксидазой хрена обыкновенного
500 мг бромцианактивированного хитина (пример A) суспендируют в 5 мл связующего буфера, а затем добавляют 5 мг HRPO и полученную суспензию непрерывно перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Твердый материал промывают дистиллированной водой и связующим буфером. После добавления к носителю 3 мл 1,0 М Трис-буфера (pH 8,0) суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 часов, а затем три раза последовательно промывают ацетатным и боратным буферами и, наконец, водой.
b. Анализ на присутствие хитиназы
50 мг хитина, меченного HRPO, суспендируют в 200 мкл MES/Трис-буфера. После добавления 50 мкл раствора хитиназы (50 единиц/мл) смесь инкубируют в течение 4 часов при температуре 37oC. Реакционную смесь центрифугируют для осаждения хитина, а 10-мкл аликвоту супернатанта смешивают со 100 мкл аналитической ABTS-смеси. Катализуемое хитиназой высвобождение HRPO, связанное с хитином, детектируют появлением зеленой окраски раствора.
P. Получение бромцианактивированного [сефароза-казеина] или альдегида каппа-казеина-HRPO
1. Материалы:
a. Бромциан активированная сефароза (пример A)
b. 10 мг/мл казеина или каппа-казеина в связующем буфере (0,1 М бикарбонат натрия, содержащий 0,5 М NaCl)
c. Буферы и растворы:
i. 50 мМ этаноламин, pH 9,5
ii. 100 мМ борат натрия (pH 9,0), содержащий 0,5 М NaCl
iii. 100 мл ацетатнатриевый буфер (pH 4,0), содержащий 0,5 М NaCl
iv. 20 мМ MES-буфер, pH 5,0
v. 100 мМ Трис-буфер, pH 8,5, содержащий 0,5 М NaCl
vi. 100 мМ борогидрид натрия в воде
d. Альдегид HRPO (пример D)
2. Порядок выполнения
2 мл раствора казеина или каппа-казеина добавляют к 1 мл сефарозы, активированной бромцианом и полученную суспензию инкубируют с вращением в течение 2 часов при комнатной температуре. После добавления 7 мл раствора этаноламина смесь инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре, затем центрифугируют и последовательно промывают 9 мл аликвотами ацетатного буфера и Трис-буфера, содержащих хлорид натрия, после чего два раза промывают 9 мл MES-буфера.
Затем добавляют 3 мл обессоленного альдегида HRPO (пример D) и смесь перемешивают, вращая в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего инкубируют в течение ночи при температуре 4oC, центрифугируют и образовавшуюся смолу дважды промывают 10 мл воды. Затем эту смолу суспендируют с 10 мл борогидрида натрия и полученную смесь инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре и затем центрифугируют эту смолу, последовательно промывают ацетатным буфером, содержащим 0,5 М NaCl (9 мл). Трис-буфером, содержащим 0,5 М NaCl (9 мл), ацетатным буфером, содержащим 0,5 М NaCl (9 мл) и, наконец, Трис-буфером, содержащим 0,5 М NaCl (9 мл). Полученную смолу промывают 9 мл MES-буфера и хранят в MES-буфере при температуре 4oC до ее использования.
Q. Ковалентное связывание миоглобина и альбумина бычьей сыворотки с шариками, покрытыми тонко распыленным акриловым покрытием ( Eupergit® C) и последующее ковалентное мечение с использованием пероксидазы хрена (альдегидный метод)
Стадия 1: Ковалентное связывание миоглобина и альбумина бычьей сыворотки с шариками, покрытыми акриловым покрытием ( Eupergit® С)
1. Материалы:
a. Оксиранакриловые шарики ( Eupergit® C, 150 μн, поставляемые фирмой Sigma Chemical Co.)
b. Миоглобин сердца лошади (тип IV) или альбумин бычьей сыворотки (от фирмы Sigma Chemical Co.)
c. Буферы и растворы:
i. 1,0 М калийфосфатный буфер, имеющий pH 7,5 и содержащий 0,1%-ный (мас./об.) азид натрия
ii. 1,0 М NaCl
iii. 5% (об./об.) меркаптоэтанол, доведенный до pH 8 0,5 н гидроксидом натрия
iv. 100 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,5
v. 500 мМ калийфосфатный буфер, pH 7,5
vi. 3,5 М фиоцианат натрия
vii. Фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) (0,01 М фосфат натрия pH 7,2 и 0,15 М NaCl)
d. Дистиллированная вода.
2. Порядок выполнения
1 г оксиранакриловых шариков растирают вручную в ступке до получения мелкозернистого порошка. Миоглобин или альбумин бычьей сыворотки (125 мг) растворяют в 5 мл 1,0 М фосфатного буфера (pH 7,5), содержащего азид натрия и добавляют к 1 г мелкоизмельченного продукта ( Eupergit® С). Полученную смесь инкубируют без перемешивания в течение 72 часов при комнатной температуре и центрифугируя носитель три раза промывают 1,0 М NaCl и пять раз 20 мл дистиллированной воды. Затем носитель смешивают с 2,5 мл меркаптоэтанола, предварительно доведенного до pH 8,0 и эту суспензию оставляют на ночь при комнатной температуре. После этого шарики промывают 10 раз дистиллированной водой с использованием центрифугирования, а затем последовательно путем центрифугирования промывают 0,5 М калийфосфатным буфером с pH 7,5 (50 мл), 0,1 М калийфосфатным буфером с pH 7,5 (50 мл), 3,5 М тиоцианатом натрия (50 мл) и окончательно промывают большим количеством фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) (0,1 М фосфат натрия (pH 7,2), содержащий 0,15 М хлорид натрия).
Стадия 2: Ковалентное мечение с использованием пероксидазы хрена обыкновенного (альдегидный метод)
Для мечения шариков с акриловым покрытием из вышеописанной стадии 1, дериватизированных миоглобином или альбумином в соответствии со способом, описанным в примере F, используют альдегид пероксидазы хрена обыкновенного (пример D).
R. Связывание миоглобин-дериватизированного Sigmacell® -20 с пероксидазой хрена с использованием глутаральдегида
1. Материалы:
a. Миоглобин, ковалентно связанный с бромцианактивированным Sigmacell® 20 (пример E).
b. 0,5 М MES-буфер, pH 5,0
c. 1%-ный (об./об.) глутальдегид в воде
d. HRPO-гидразид (от фирмы Sigma Chemical Co., 200 единиц/мг)
e. 100 мМ формальдегид
f. 100 мМ цианоборогидрид натрия
g. 0,5 М NaCl
2. Порядок выполнения
1 мл раствора глутаральдегида добавляют к 1 г Sigmacell® 20 сопряженного с миоглобином и полученную суспензию размешивают, вращая при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем промывают водой. К промытой смоле добавляют 5 мг HRPO-гидразида в 2 мл 100 мл мМ MES-буфера и полученную суспензию перемешивают, вращая в течение 4 часов при комнатной температуре. После добавления 200 мкл 100 мМ формальдегидного раствора смесь инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Полученную смолу промывают водой, суспендируют в 5 мл 100 мМ цианоборогидрида натрия и инкубируют в течение ночи при температуре 4oC. Затем эту смолу промывают дистиллированной водой и 0,5 М NaCl, после чего хранят в виде влажной пасты вплоть до использования.
Получение раствора гваяковой смолы и листов из гваяковой смолы
1. Раствор, содержащий гваяковую смолу и гидроксипропилцеллюлозу (т.е. гваяковый реактив)
150 г порошкообразной гваяковой смолы растворяют в 660 мл нагретого и перемешанного этанола. К полученному раствору добавляют 1330 мл дистиллированной воды, и образовавшуюся суспензию охлаждают до комнатной температуры. Через 2 часа супернатант декантируют, а остаточную суспензию отстаивают.
250 мл 10%-ного (мас./мас.), раствора гидроксипропилцеллюлозы в этаноле смешивают с дополнительным количеством этанола (250 мл) и полученный раствор добавляют к гваяковой суспензии. Затем смесь перемешивают до полного растворения остатка гваяковой смолы.
2. Листы из гваяковой смолы
1 мл вышеописанного раствора гваяковой смолы наносят пипеткой на полиэтиленовую сторону листа (10 дюйм х 10 дюйм = 254 см х 254 см) пластины из Mylar/полиэтилена (7 милов Mylar/3 мл полиэтилена). Раствор гваяковой смолы распыляют по поверхности листов с помощью стандартного лабораторного прутка из скрученной проволоки, а затем позволяют подсохнуть при комнатной температуре.
T. Получение суспензии пербората натрия (т.е. натрийперборатного реактива)
20 г тонкоизмельченного твердого пербората натрия смешивают с достаточным объемом 10%-ного (по массе) раствора гидроксипропилцеллюлозы в безводном спирте для получения одного литра суспензии.
II. Эксперименты:
Эксперимент I
Этот эксперимент предусматривает отделение пероксидазы хрена обыкновенного (HRPO) от [сефароза-казеин-HRPO] и [сефароза-каппа-казеин-HRPO] с помощью аспарагиновой протеазы, выделяемой культурой Candida albicans.
A. Материалы: (сефароза, активированная бромцианом) (метод связывания HRPO с альдегидом)
1. Бромцианактивированная сефароза 4B (пример A) сначала дериватизированная ковалентно связанным казеином или каппа-казеином (пример P), а затем меченная с использованием альдегида HRPO (пример D)
2. Выращенная и размноженная в жидкой культуральной среде культура Candida albicans (ATCC 28366), продуцирующая аспарагиновую протеазу как описано в Journal of General Microbiology (1983) 129: 431-438.
3. Листы, покрытые гваяковой смолой (пример S)
4. Буферы и растворы:
a. 20 мМ пероксид водорода
b. 500 мМ MES-буфер с pH 6,0
B. Порядок выполнения
10 мг (сырого веса) конъюгата сефароза-казеин-HRPO (или эквивалента каппа-казеина) суспендируют в 300 мкл культуры Candida albicans, содержащей активную секретированную аспарагиновую протеазу, или в 300 мкл той же самой культуры Candida albicans, нагретой до кипения в течение 20 минут для инактивации аспарагиновой протеазы. Полученную смесь подвергают вращению в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем суспендируют центрифугируют для осаждения твердого конъюгата и клеток Candida albicans.
80 мкл прозрачного супернатанта смешивают с 10 мкл пероксида водорода и 10 мкл MES-буфера. 20 мкл каждого из этих растворов наносят на поверхность листов, покрытых гваяковой смолой и наблюдают образование синей окраски (см. табл. 1).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска проявляется на той части листа, покрытого гваяковой смолой, на которую нанесли супернатант конъюгата [сефароза-протеин-HRPO], обработанного культурой Candida albicans. На площади, на которую добавляли супернатант конъюгата [сефароза-протеин-HRPO], обработанного прокипяченной культурой, образование окраски не наблюдалось (см. табл. 2).
Интерпретация:
Активная аспарагиновая протеаза, секретированная в среду культивирования клетками культуры Candida albicans, гидролизовала сефарозу, связанную с казеином или каппа-казеином, высвобождая тем самым растворимую активную пероксидазу хрена обыкновенного. Центрифугирование осаждало сефарозу, связанную с HRPO, оставляя лишь аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO в растворе. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы пероксидом водорода, продуцируя тем самым появление синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы.
Кипячение культуры инактивирует аспарагиновую протеазу, секретируемую в среду культивирования клетками Candida albicans. Поэтому сефароза, связанная с казеином или каппа-казеином, не гидролизовалась, и растворимая активная пероксидаза хрена обыкновенного не отделялась от носителя. Центрифугирование осаждало сефарозу, связанную с HRPO, не оставляя в растворе аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой. Отделение HRPO от носителя являлось ни чем иным, как просто лишь результатом неспецифического высвобождения HRPO под действием солей или других компонентов, присутствующих в среде культивирования.
Эксперимент II
Данный эксперимент предусматривает отделение пероксидазы хрена обыкновенного от конъюгатов [ Eupergit® C (акриловые гранулы)-казеин-HRPO] и конъюгатов [ Eupergit® C (акриловые гранулы)-каппа-казеин-HRPO] посредством аспарагиновой протеазы, выделяемой культурой Candida albicans:
A. Материалы: Eupergit® C (активированные акриловые гранулы (HRPO-альдегидный метод связывания).
1. Оксиранакриловые гранулы Eupergit® C, обработанные казеином или каппа-казеином (пример M), а затем меченная HRPO-альдегидом (пример D)
2. Выращенная и размноженная в жидкой культуральной среде культура Candida albicans (ATCC 28366), продуцирующая аспарагиновую протеазу как описано в Journal of General Microbiology (1983), 129:431:438.
3. Листы, покрытые гваяковой смолой (пример S)
4. Буферы и растворы:
a. 20 мМ пероксид водорода
b. 500 мМ MES-буфер с pH 6,0
B. Порядок выполнения
10 мг (сырого веса) конъюгата [ Eupergit® C-Казеин-HRPO] (эквивалент каппа-казеин суспендируют в 300 мкл культуры Candida albicans, содержащей активную секретированную аспарагиновую протеазу или 300 мкл той же самой культуры Candida albicans, кипевшей в течение 20 минут, инактивировать таким образом аспарагиновую протеазу. Затем смесь перемешивают путем вращения в течение 15 минут при комнатной температуре и полученную суспензию центрифугируют для осаждения твердого конъюгата и клеток Candida albicans.
80 мкл прозрачного супернатанта смешивают с 10 мкл раствора пероксида водорода и 10 мкл MES-буфера. 20 мкл каждого из этих растворов наносят на поверхность листа, покрытого гваяковой смолой, и этот лист оценивают на образование синей окраски (см. табл. 3).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на той площади листа, покрытого гваяковой смолой, на которую добавляли супернатант конъюгата [ Eupergit® C-протеин-HRPO], обработанного культурой Candida albicans. На площади, на которую добавляли супернатант конъюгата [ Eupergit® C-протеин-HRPO], обработанного нагретой до температуры кипения культурой, образование окраски не наблюдалось (табл. 4).
S. Интерпретация:
Активная аспарагиновая протеаза, выделяемая в культуральной среде клетками Candida albicans гидролизовала Eupergit® C, связанный с казеином или каппа-казеином, высвобождая тем самым растворимую активную пероксидазу хрена обыкновенного. Центрифугирование осаждало Eupergit® C, связанный с HRPO, оставляя лишь аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO в растворе. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность детектировать аспарагиновую протеазу.
Нагревание культуры инактивирует аспарагиновую протеазу, секретируемую в культуральной среде посредством клеток Candida albicans. Поэтому Eupergit® C, связанный с казеином или каппа-казеином, не гидролизовался, а растворимая HRPO не отделялась от носителя. Центрифугирование осаждало 
C, связанный с HRPO, оставляя в растворе лишь аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой. Отделение пероксидазы хрена от носителя не являлось просто лишь результатом неспецифического отделения HRPO под действием солей или других компонентов, присутствующих в среде культивирования.
Эксперимент III
Данный эксперимент предусматривает отделение пероксидазы хрена обыкновенного от [сефароза-гемоглобин-HRPO] или [сефароза-миоглобин-HRPO] под действием пепсина и аспарагиновой протеазы, выделяемой Aspergillus saitoi
A. Материалы: (Сефароза, активированная бромцианом) (альдегидный метод связывания HRPO)
1. Бромцианактивированная сефароза 4B (пример A), сначала дериватизированная ковалентно связанным гемоглобином или миоглобином (пример E), а затем меченная HRPO-альдегидом (пример D и F). Конъюгат, обработанный в течение ночи 100 мМ цианоборогидридом натрия при комнатной температуре и перед использованием промытый 0,5 М хлоридом натрия.
2. Растворы для анализа:
a) изготавливаемая промышленностью аспарагиновая протеаза (тип XIII) от A-pergillus saitoi (30 мг/мл, 0,6 единиц/мг);
b) пепсин (1 мг/мл, 2900 единиц/мг) и
c) альбумин бычьей сыворотки (BSA) (2 мг/мл в воде) (все эти компоненты поставлялись фирмой Sigma Chemical Co.)
3. Бумага, пропитанная гваяковой смолой, в форме микроскопических препаратов (Hemoccult®)., изготавливаемых промышленностью (от фирмы Smittkline Diagnostics).
4. Буферы и растворы:
a. 0,2%-ный (об. /об.) пероксид водорода в 200 мМ фосфатном буфере, pH 7,0
b. 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,0
B. Порядок выполнения
40 мг (сырого веса) конъюгата [сефароза-гемоглобин-HRPO] (или сефароза-миоглобин-HRPO) суспендируют в 75 мкл ацетатного буфера с pH 4,0, а затем добавляют 25 мкл аналитического раствора. Полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. На микроскопический препарат, покрытый гваяковой смолой, наносят 5 мкл супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида (см. табл. 5).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска наблюдалась на той части листа, пропитанного гваяковой смолой, на которую добавляли образцы супернатанта, содержащие аспарагиновую протеазу от Aspergillus saitoi или пепсин. Часть листа, на которую добавляли аликвоты супернатанта, содержащие лишь один BSA (2 мг/мл) или буфер, был виден очень слабый синий оттенок (см. табл. 6).
D. Интерпретация:
Активная аспарагиновая протеаза от Aspergillus saitoi и пепсин, аспарагиновая протеаза, выделенная из желудка свиньи, гидролизовала сефарозу, связанную с гемоглобином или миоглобином, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало сефарозу, связанную с HRPO, оставляя в растворе лишь ферментом солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность детектировать активную аспарагиновую протеазу, происходящую от Aspergillus saitoi или пепсина свиньи.
Ни BSA, ни буфер не обладают активностью аспарагиновой протеазы. Поэтому сефароза, связанная с гемоглобином или миоглобином, не гидролизовалась, и растворимая активная HRPO не отделялась от носителя. Центрифугирование осаждало сефарозу, связанную с HRPO, не оставляя аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO в растворе. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой.
Эксперимент IV
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от [сефароза-казеин-HRPO] или [сефароза-каппа-казеин-HRPO] под действием пепсина и аспарагиновой протеазы, происходящей от Aspergillus saitoi.
A. Материалы: (сефароза, активированная бромцианом) (метод связывания HRPO и гидразида)
1. Бромцианактивированная сефароза 4B (пример A), оставленная для реакции с [каппа-казеин-HRPO] или казеин-HRPO (гидразидный метод) (пример B и C)
2. Растворы для анализа:
a) изготавливаемая промышленностью аспарагиновая протеаза, происходящая от Aspergillus saitoi (30 мг/мл, 0,6 единиц/мг);
b) пепсин (1 мг/мл, 2900 единиц/мг); и
c) альбумин бычьей сыворотки (BSA) (2 мг/мл в воде) (все эти ферменты поставлялись фирмой Sigma Chemical Co.)
3. Бумага, пропитанная гваяковой смолой, в виде микроскопических препаратов, изготавливаемых промышленностью (Hemoccult®).
4. Буферы и растворы:
a. 0,02% (об./об.) пероксид водорода в 200 мМ фосфатном буфере, pH 7,0.
b. 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,0
B. Порядок выполнения:
40 мг (сырого веса) конъюгата [сефароза-казеин-HRPO] или конъюгата [сефароза-каппа-казеин-HRPO] суспендируют в 75 мкл ацетатного буфера с pH 4,0, а затем добавляют 25 мкл раствора для анализа. Полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. К микроскопическому препарату, покрытому гваяковой смолой, добавляют 5 мкл супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода (см. табл. 7).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска наблюдалась на той части листа, покрытого гваяковой смолой, на которую добавляли образцы супернатанта, содержащие аспарагиновую протеазу, происходящую от Aspergillus saitoi или пепсин. На площади, на которую добавляли аликвоты супернатанта, содержащие лишь BSA (2,0 мг/мл) или буфер, обнаруживалась лишь очень слабая окраска (табл. 8).
D. Интерпретация:
Активная аспарагиновая протеаза от Aspergillus saitoi и свиной пепсин гидролизовали сефарозу, связанную с казеином или каппа-казеином, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало сефарозу, связанную с HRPO, оставляя в растворе лишь ферментом солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы или пепсина.
Ни BSA, ни буфер, не обладают активностью аспарагиновой протеазы. Поэтому сефароза, связанная с казеином или каппа-казеином, не была гидролизована, а растворимая активная HRPO не отделялась от носителя. Центрифугирование осаждало сефарозу, связанную с HRPO, не оставляя аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO в растворе. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой.
Эксперимент V
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от конъюгата [хитин-каппа-казеин-HRPO] под действием пепсина и аспарагиновой протеазы, происходящей от Aspergillus saitoi.
A. Материалы: (хитин, активированный бромцианом) (метод связывания HRPO и гидразида)
1. Хитин, активированный бромцианом (пример A) и оставленный для реакции с [каппа-казеин-HRPO] (гидразидный метод) (пример B и C)
2. Аналитические растворы:
a) изготавливаемая промышленностью аспарагиновая
протеаза, происходящая от Aspergillus saitoi (30 мг/мл, 0,6 единиц/мг);
b) пепсин (1 мг/мл, 2900 единиц/мг); и
c) альбумин бычьей сыворотки (BSA) (2 мг/мл в воде) (все эти препараты поставлялись фирмой Sigma Chemical Co.)
3. Бумага, пропитанная гваяковой смолой, в виде микроскопических препаратов Hemoccult®, изготавливаемых промышленностью (от фирмы Smitkline Diagnostics).
4. Буферы и растворы:
a. 0,02% (об./об.) пероксид водорода в 200 мМ фосфатном буфере, pH 7,0
b. 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,0.
B. Порядок выполнения
40 мг (сырого веса) конъюгата [хитин-каппа-казеин-HRPO] суспендируют в 75 мкл ацетатного буфера, имеющего pH 4,0, а затем добавляют 25 мкл аналитического раствора. Полученную суспензию инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. На микроскопический препарат с гваяковой смолой добавляли 5 мкл супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода (см. табл. 9).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на той площади листа, пропитанного гваяковой смолой, на которую добавляли образцы супернатанта, содержащие аспарагиновую протеазу, происходящую от Aspergillus saitoi или пепсин. На площади, на которую добавляли аликвоты супернатанта, содержащие лишь BSA (2,0 мг/мл) или буфер, была обнаружена едва заметная синяя окраска (см. табл. 10).
D. Интерпретация
Активная аспарагиновая протеаза, происходящая от Aspergillus saitoi и свиной пепсин, гидролизовали Sigmacell® 20, связанный с гемоглобином или миоглобином, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, оставляя в растворе лишь ферментом солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы или пепсина.
Ни BSA, ни буфер не обладали активностью аспарагиновой протеазы. Поэтому Sigmacell® 20, связанный с гемоглобином или миоглобином, не был гидролизован, а растворимая активная HRPO не была отделена от носителя. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, не оставляя в растворе аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой.
Эксперимент VI
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от конъюгата / Sigmacell® 20-гемоглобин-HRPO/ или / Sigmacell® 20-миоглобин-HRPO/ под действием пепсина и аспарагиновой протеазы, происходящей от Aspergillus saitoi
A. Материалы: (бромциан активированный Sigmacell®20 ) (альдегидиый метод связывания HRPO)
1. Бромциан активированный Sigmacell®20 (пример A), сначала дериватизированный ковалентно связанным гемоглобином или миоглобином (пример E), а затем меченный HRPO-альдегидом (пример D-F). Конъюгат был обработан в течение ночи 100 мМ цианоборогидридом натрия при комнатной температуре и перед использованием промыт 0,5 М хлоридом натрия.
2. Аналитические растворы:
a) изготавливаемая промышленностью аспарагиновая протеаза, происходящая от Aspergillus saitoi (30 мг/мл, 0,6 единиц/мг);
b) пепсин (1 мг/мл, 2900 единиц/мг); и
c) альбумин бычьей сыворотки (BSA) (2 мг/мл в воде) (все эти препараты поставлялись фирмой Sigma Chemical Co.)
3. Бумага, пропитанная гваяковой смолой, в форме микроскопических препаратов Hemoccult® изготавливаемых промышленностью.
4. Буферы и растворы:
a. 0,02% (об./об.) пероксид водорода в 200 мМ фосфатном буфере, pH 7,0
b. 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,0
B. Порядок выполнения 40 мг (сырого веса) конъюгата [ Sigmacell®20- гемоглобин-HRPO] или конъюгата [ Sigmacell®20 -миоглобин/HRPO] суспендируют в 75 мкл ацетатного буфера, имеющего pH 4,0, а затем добавляют 25 мкл аналитического раствора. Полученную суспензию инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. К микроскопическому препарату с гваяковой смолой добавляют 5 мкл супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода (см. табл. 11).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на площади листа, покрытого гваяковой смолой, на которую добавляли образцы супернатанта, содержащие аспарагиновую протеазу, происходящую от Aspergillus saitoi или пепсин. На площади, на которую после BSA (2,0 мг/мл) или буфера добавляли аликвоты супернатанта, была заметна лишь очень слабая окраска (см. табл. 12).
D. Интерпретация:
Активная аспарагиновая протеаза от Aspergillus saitoi и свиной пепсин гидролизовали Sigmacell® 20, связанный с гемоглобином или миоглобином, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, оставляя в растворе лишь ферментом солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы или пепсина.
Ни BSA, ни буфер не обладают активностью аспарагиновой протеазы. Поэтому Sigmacell® 20, связанный с гемоглобином или миоглобином, не был гидролизован, а растворимая активная HRPO не отделялась от носителя. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с пероксидазой хрена, не оставляя аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO в растворе. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой.
Эксперимент VII
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от конъюгата [ Sigmacell® 20-каппа-казеин-HRPO] посредством пепсина и аспарагиновой протеазы, происходящей от Aspergillus saitoi
A. Материалы: ( Sigmacell® 20, активированный бромцианом) (метод связывания HRPO и гидразида)
1. Бромцианактивированный Sigmacell® 20 (пример A), оставленный для реакции с каппа-казеин-HRPO (гидразидный метод, пример B и C)
2. Аналитические растворы:
a) изготавливаемая промышленностью аспарагиновая протеаза, происходящая от Aspergillus saitoi (30 мг/мл, 0,6 единиц/мг);
b) пепсин (1 мг/ал, 2900 единиц/мл); и
c) альбумин бычьей сыворотки (BSA) (2 мг/мл в воде) (все эти препараты поставлялись фирмой Sigma Chemical Co.)
3. Бумага, пропитанная гваяковой смолой, в форме микроскопических препаратов Hemoccult® изготавливаемых промышленностью
4. Буферы и растворы:
a. 0,02% (об./об.) пероксид водорода в 200 мМ фосфатном буфере, pH 7,0.
b. 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,0
B. Порядок выполнения
40 мг (сырого веса) конъюгата Sigmacell® 20-каппа-казеин-HRPO суспендируют в 75 мкл ацетатного буфера, имеющего pH 4,0, а затем добавляют 25 мкл аналитического раствора. Полученную суспензию инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. На препарат с гваяковой смолой наносят 5 мкл супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода (см. табл. 13).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на той площади листа, покрытого гваяковой смолой, на которую добавляли образцы супернатанта, содержащие аспарагиновую протеазу, происходящую от Aspergillus saitoi или пепсин. На площади, на которую после BSA (2,0 мг/мл) или буфера добавляли аликвоты супернатанта, была заметна лишь очень слабая окраска (см. табл. 14).
D. Интерпретация
Активная аспарагиновая протеаза от Aspergillus saitoi и свиной пепсин гидролизовали Sigmacell® 20, связанный с каппа-казеином, высвобождая тем самым растворимую активную пероксидазу хрена. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, оставляя в растворе лишь ферментом солюбилизированную HRPO. Растворимая пероксидаза хрена катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым появление синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы или пепсина.
Ни BSA, ни буфер не обладают активностью аспарагиновой протеазы. Поэтому Sigmacell® 20, связанный с каппа-казеином, не был гидролизован, а растворимая активная HRPO не отделялась от носителя. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, не оставляя в растворе аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой.
Эксперимент VIII
Данный эксперимент предусматривает высвобождение пероксидазы хрена обыкновенного из [ Sigmacell® 20-каппа-казеин-HRPO] (гидразидный метод) или [ Sigmacell® 20-миоглобин]гемоглобин-HRPO (альдегидный метод) посредством аспарагиновой протеазы, происходящей от Aspergillus saitoi или пепсина.
A. Материалы: ( Sigmacell® 20, активированный бромцианом)
1. Sigmacell® 20, активированных бромцианом (пример A), дериватизируют каппа-казеином или пероксидазой хрена (гидразидный метод) (пример B). Sigmacell® 20, активированный бромцианом, поочередно дериватизируют гемоглобином или миоглобином (пример E), а затем связывают с HRPO-альдегидом (пример D)
2. Аналитические растворы:
a. изготавливаемая промышленностью аспарагиновая протеаза, происходящая от Aspergillus saitoi (30 мг/мл, 0,6 ед./мг);
b. пепсин (1 мг/мл, 2900 единиц/мг); и
c. альбумин бычьей сыворотки (BSA) (2 мг/мл в воде) (все эти препараты поставлялись фирмой Sigma Chemical Co.).
3. Бумага, пропитанная гваяковой смолой, в форме микроскопических препаратов Hemoccult® изготавливаемых промышленностью.
4. Буферы и растворы:
a. 0,02%-ный (об./об.) пероксид водорода в 200 мМ фосфатном буфере, pH 7,0
b. 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,0
B. Порядок выполнения
40 мг (сырого веса) конъюгата [ Sigmacell® 20-каппа-казеин-HRPO] суспендируют в 75 мкл ацетатного буфера, pH 4,0, а затем добавляют 25 мкл аналитического раствора. Полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. На препарат с гваяковой смолой наносят 5 мкл супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода (см. табл. 15).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска наблюдалась на той площади листа, пропитанного гваяковой смолой, на которую добавляли образцы супернатанта, содержащие аспарагиновую протеазу от Aspergillus saitoi или пепсин. На той же площади, на которую добавляли аликвоты супернатанта, содержащие BSA (2,0 мг/мл) или буфер, была видна лишь очень слабая окраска (см. табл. 16).
D. Интерпретация:
Активная аспарагиновая протеаза от Aspergillus saitoi и свиной пепсин гидролизовали Sigmacell® 20, связанный с каппа-казеином, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, оставляя в растворе лишь ферментом солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым появление синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы или пепсина.
Ни BSA, ни буфер не обладают активностью аспарагиновой протеазы. Поэтому Sigmacell® 20, связанный с каппа-казеином, не был гидролизован, а растворимая активная пероксидаза хрена не была отделена от носителя. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, не оставляя в растворе аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой.
Эксперимент IX
Данный эксперимент предусматривает высвобождение HRPO из конъюгата [ 
20-гемоглобин-HRPO] или [ Sigmacell® 20-гемоглобин-HRPO] посредством аспарагиновой протеазы, выделяемой культурой Candida albicans
A. Материалы: ( Sigmacell® 20, активированный альдегидом) (HRPO-альдегидный метод связывания)
1. Альдегид-активированиый Sigmacell® 20 (пример G), который сначала дериватизировали ковалентно связанную гемоглобином или миоглобином (пример H), а затем метили HRPO-альдегидом (пример D и F)
2. Выращенная и размноженная в жидкой культуральной среде культура Candida albicans (ATCC 28366), продуцирующая аспарагиновую протеазу способом, описанным в Journal of General Microbiology (1983) 129:431-438.
3. Листы, покрытые гваяковой смолой (пример S)
4. Буферы и растворы:
a. 20 мМ пероксид водорода
b. 500 мМ MES-буфер, pH 6,0.
B. Порядок выполнения:
10 мг (сырого веса) конъюгата [ Sigmacell® 20-протеин-HRPO] суспендируют в 300 мкл культуры Candida albicans содержащей секретированную аспарагиновую протеазу или в 300 мкл той же самой культуры Candida albicans, кипевшей в течение 20 минут для инактивации аспарагиновой протеазы. Полученную смесь перемешивают путем вращения в течение 15 минут при комнатной температуре, после чего образовавшуюся суспензию центрифугируют для осаждения твердого конъюгата и клеток Candida albicans.
80 мкл прозрачного супернатанта смешивают с 10 мкл раствора пероксида водорода и 10 мкл MES-буфера. 20 мкл каждого из этих растворов наносят на поверхность листа, покрытого гваяковой смолой, и наблюдают за образованием синей окраски (см. табл. 17).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на той площади листа, покрытого гваяковой смолой, на которую добавляли конъюгат [сефароза-протеин-HRPO], обработанный культурой Candida albicans. На площади, на которую добавляли конъюгат [сефароза-протеин-HRPO] , обработанный нагретой до кипения культурой, появления окраски не наблюдалось (см. табл. 18).
D. Интерпретация:
Аспарагиновая протеаза, секретированная в культуральную среду с помощью клеток Candida albicans, гидролизовала Sigmacell® 20, связанный с белком, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало сефарозу, связанную с HRPO, оставляя в растворе лишь аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы.
Нагревание до кипения культуры инактивировало аспарагиновую протеазу, секретированную в среду культивирования клетками Candida albicans. Поэтому Sigmacell® 20, связанный с белком, не был гидролизован, а растворимая активная HRPO не высвобождалась от носителя. Центрифугирование осаждало Sigmacell® 20, связанный с HRPO, не оставляя в растворе аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой. Отделение HRPO от указанного носителя не являлось просто лишь результатом отделения HRPO под действием солей или других компонентов, присутствующих в культуральной среде.
Эксперимент X
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от конъюгата /полимерный диальдегид-каппа-казеин-HRPO/ посредством пепсина и аспарагиновой протеазы, происходящей от Aspergillus saitoi.
A. Материалы: (Полимерный диальдегид) (HRPO-гидразидный метод связывания)
1. Изготавливаемый промышленностью полимерный диальдегид от фирмы Sigma Chemical Co. подвергаемый реакции с каппа-казеин-HRPO (гидразидный метод) (пример B и L).
2. Аналитические растворы:
a) изготавливаемая промышленностью аспарагиновая протеаза, происходящая от Aspergillus saitoi (30 мг/мл, 0,6 ед./мг)
b) пепсин (1 мг/мл, 2900 единиц/мг); и
c) альбумин бычьей сыворотки (BSA) (2 мг/мл в воде) (все эти продукты поставлялись фирмой Sigma Chemical Co.)
3. Бумага, пропитанная гваяковой смолой, в виде микроскопических препаратов Hemoccult®, изготавливаемых промышленностью
4. Буферы и растворы:
a. 0,02%-ный (об. /об.) пероксид водорода в 200 мМ фосфатном буфере pH 7,0
b. 100 мМ ацетатный буфер, pH 4,0
B. Порядок выполнения:
40 мг (сырого веса) конъюгата [полимерный диальдегид-каппа-казеин-HRPO] суспендируют в 75 мкл ацетатного буфера, имеющего pH 4,0, а затем добавляют 25 мкл аналитического раствора. Полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, после чего центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. На препарат с гваяковой смолой наносят 5 мкл супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода (см. табл. 19).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на той площади листа, пропитанного гваяковой смолой, на которую добавляли образцы супернатанта, содержащие аспарагиновую протеазу от Aspergillus saitoi или пепсин. На площади, на которую после BSA (2,0 мг/мл) или буфера добавляли аликвоты супернатанта, была видна лишь очень слабая окраска (см. табл. 20).
D. Интерпретация
Активная аспарагиновая протеаза от Aspergillus saitoi и свиной пепсин гидролизовали полимерный диальдегид, связанный с каппа-казеином, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало полимерный диальдегид, связанный с HRPO, оставляя в растворе лишь ферментом солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность детектировать аспарагиновую протеазу или пепсин.
Ни BSA, ни буфер не обладают активностью аспарагиновой протеазы. Поэтому полимерный диальдегид, связанный с каппа-казеином, не гидролизуется, а растворимая активная HRPO не высвобождается от носителя. Центрифугирование осаждало полимерный диальдегид, связанный с HRPO, не оставляя в растворе аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой.
Эксперимент XI
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от конъюгата [полимерный диальдегид-миоглобин-HRPO] посредством аспарагиновой протеазы.
A. Материалы: (полимерный диальдегид) (HRPO-альдегидный метод связывания)
1. Изготавливаемый промышленностью полимерный диальдегид от фирмы Sigma Chemical Co., прореагировавший с миоглобином (пример N), а затем с HRPO-альдегидом (пример N).
2. Выращенная и размноженная в жидкой культуральной среде культура Sigma Chemical Co. (ATCC 28366), продуцирующая аспарагиновую протеазу способом, описанным в Journal of General Microbiology, (1983), 129:431-438.
3. Листы, пропитанные гваяковой смолой (пример).
4. Буферы и растворы:
1. 20 мМ пероксид водорода
2. 500 мМ MES-буфер, pH 6,0
B. Порядок выполнения:
10 мг (сырого веса) конъюгата [полимерный диальдегид-миоглобин-HRPO] суспендируют в 300 мкл культуры Candida albicans, содержащей секретированную аспарагиновую протеазу, или в 300 микролитров той же самой культуры Candida albicans, кипевшей в течение 20 минут для инактивации аспарагиновой протеазы. Полученную смесь размешивают путем вращения в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем образовавшуюся суспензию центрифугируют для осаждения твердого конъюгата и клеток Candida albicans.
80 мкл прозрачного супернатанта смешивают с 10 мкл раствора пероксида водорода и 10 мкл MES-буфера. 20 мкл каждого из этих растворов наносят на поверхность листа, пропитанного гваяковой смолой, и наблюдают за образованием синей окраски (см. табл. 21).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на той площади листа, покрытого гваяковой смолой, на которую добавляли конъюгат [полимерный диальдегид-миоглобин-HRPO] , обработанный культурой Candida albicans. На площади, на которую добавляли диальдегид-миоглобин-HRPO, обработанный нагретой до кипения культурой, видимая окраска отсутствовала (см. табл. 22).
D. Интерпретация
Активная аспарагиновая протеаза, секретированная в культуральную среду клетками Candida albicans, гидролизовала полимерный диальдегид, связанный с миоглобином, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало полимерный диальдегид, связанный с пероксидазой хрена, оставляя в растворе лишь аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, продуцируя тем самым образование синей окраски. Поэтому образование синей окраски на листах, покрытых гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный способ детектирования аспарагиновой протеазы.
Нагревание культуры инактивировало аспарагиновую протеазу, секретированную в культуральную среду клетками Candida albicans. Поэтому полимерный диальдегид, связанный с миоглобином, не был гидролизован, а растворимая активная HRPO не была отделена от носителя. Центрифугирование осаждало полимерный диальдегид, связанный с HRPO, не оставляя в растворе аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Катализации окисления гваяковой смолы под действием пероксида водорода не происходило, а образовавшаяся синяя окраска была едва обнаруживаемой. Отделение пероксидазы хрена от указанного носителя не являлось просто лишь результатом неспецифеческого выделения HRPO под действием солей или других компонентов, присутствующих в культуральной среде.
Эксперимент XII
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от конъюгата [сефароза 6MB-каппа-казеин-HRPO] с помощью образцов вагинальных выделений:
1. Нормальное вагинальное выделение
2. Нормальные вагинальные выделения с добавление культуры Candida albicans
3. Вагинальные выделения, взятые у женщин с клинически диагностированным вульвовагинальным кандидозом.
A. Материалы: (Изготавливаемая промышленностью сефароза 6MB, активированная бромцианом) (HRPO-гидразидный метод связывания)
1. Конъюгат [сефароза 6MB-каппа-казеин-HRPO] (пример C)
2. Образцы вагинальных выделений, полученные на стандартных тампонах Dacron.
Данные образцы хранят замороженными вплоть до момента их использования. Затем образцы оттаивают и центрифугируют в специальных пробирках для экстракции неразбавленных вагинальных выделений из тампона. Все образцы от каждого тампона анализируют. Если это необходимо, к образцу добавляют дистиллированную воду с получением конечного объема 75 мкл.
К образцам вагинальных выделений женщины, не имеющей клинического диагноза вульвовагинального кандидоза, добавляют 25 мкл культуры Candida albicans (см., например, Эксперимент I).
3. Фильтровальная бумага, пропитанная гваяковой смолой (изготавливаемые промышленностью аналитические препараты Hemoccult®.
4. Буферы и растворы:
a. 6 мМ пероксид водорода
b. 250 мМ глицилглициновый буфер, pH 3,0
B. Порядок выполнения
30 мг (сырого веса) конъюгата [сефароза-каппа-казеин-HRPO] суспендируют в 75 мкл обработанных или необработанных вагинальных выделениях. Полученные суспензии инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем центрифугируют для осаждения твердого конъюгата и другого дебриса.
На бумагу, пропитанную гваяковой смолой, наносят 5 мкл прозрачного супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода и наблюдают за образованием синей окраски (см. табл. 23).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на площади бумаги, пропитанной гваяковой смолой, на которую добавляли супернатант вагинальных выделений, взятые у женщины, инфецированной вульвовагинальным кандидозом. На площади бумаги, пропитанной гваяковой смолой, на которую добавляли супернатант вагинальных выделений у женщины из контрольной группы окраска отсутствовала. Наиболее темная синяя окраска также образовывалась на площади бумаги, пропитанной гваяковой смолой, на которую добавляли супернатант вагинальных выделений нормальной женщины с добавлением среды культивирования Candida albicans (см. табл. 24).
D. Интерпретация
Вагинальные выделения женщины с клинически диагностированным вульвовагинальным кандидозом содержит аспарагиновую протеазу, которая гидролизует конъюгат [сефароза 6MB-каппа-казеин] (pH 3,0) в течение 15 минут при комнатной температуре, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало сефарозу 6MB, связанную с HRPO, оставляя в растворе лишь высвобожденную солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление изготавливаемых промышленностью препаратов Hemoccult®, продуцируя тем самым появление синей окраски. Поэтому образование синей окраски на препаратах Hemoccult® дает возможность осуществлять быстрый и удобный способ детекции, происходящей от Candida, аспарагиновой протеазы в вагинальных выделениях, а следовательно, и вульвовагинального кандидоза.
Вагинальные выделения нормальной женщины, не страдающей вульвовагинальным кандидозом, не содержат аспарагиновой протеазы, а поэтому в испытаниях при pH 3,0 в течение 15 минут при комнатной температуре конъюгат сефароза 6MB-каппа-казеин не гидролизовался, и растворимая активная HRPO не высвобождалась. После осаждения конъюгата сефароза 6MB-HRPO путем центрифугирования в растворе оставалась связанная солюбилизированная HRPO. При отсутствии HRPO-катализатора окисления коммерческих препаратов Hemoccult® не происходило, и синяя окраска не наблюдалась. Поэтому отсутствие образования синей окраски на препаратах Hemoccult® позволяет получить быстрый и удобный метод обследования нормальных женщин на отсутствие у них выделяемой Candida аспарагиновой протеазы в вагинальных выделениях, а следовательно, на отсутствие у них вульвовагинального кандидоза.
И, наконец, при добавлении среды от культуры Candida albicans к вагинальным выделениям нормальной женщины, не страдающей вульвовагинальным кандидозом, происходил гидролиз конъюгата [сефароза 6MB-каппа-казеин] при pH 3,0, в течение 15 минут при комнатной температуре, и высвобождалась растворимая активная HRPO. При осаждении конъюгата сефароза 6MB-HRPO путем центрифугирования в раствор высвобождалась солюбилизированная HRPO. Эта растворимая HRPO катализировала окисление коммерческих препаратов Hemoccult® пероксидом водорода, и наблюдалась синяя окраска. Поэтому образование синей окраски на препаратах Hemoccult® свидетельствует о том, что аспарагиновая протеаза, высвобожденная в культуральную среду клетками Candida albicans, может быть быстро и эффективно обнаружена, даже если эта среда добавлена к вагинальным выделениям нормальных женщин.
Эксперимент XIII
Данный эксперимент предусматривает отделение HRPO от конъюгата [ Espergit® C-миоглобин-HRPO] и [ Sigmacell® 20-миоглобин-HRPO] с помощью образцов вагинальных выделений.
1. Нормальные вагинальные выделения
2. Вагинальные выделения женщин с клинически диагностируемым вульвовагинальным кандидозом.
A. Материалы: (бромцианактивированный Sigmacell® 20-миоглобин-HRPO; пример A и I) и ( Espergit® C-миоглобин-HRPO; Пример Q) (HRPO-альдегидный метод связывания)
1. Мелко измельченные оксиранакриловые гранулы, связанные с миоглобин-HRPO-альдегидом (пример Q)
2. Sigmacell® 20, активированный бромцианом (пример A) и связанный с миоглобин-HRPO-альдегидом (пример I).
3. Образцы вагинальных выделений, полученные на стандартных тампонах Dacron. Эти образцы хранят замороженными вплоть до момента их использования. Затем образцы оттаивают и центрифугируют в специальных пробирках для экстракции неразбавленных вагинальных выделений из тампона. Все образцы от каждого тампона анализируют.
4. Фильтровальная бумага, пропитанная гваяковой смолой (изготавливаемые промышленностью препараты Hemoccult® для анализа)
5. Буферы и растворы:
a. 6 мМ пероксид водорода
b. 250 мМ глицилглициновый буфер с pH 3,0
c. 1,0 М ацетатный буфер, pH 4,0.
B. Порядок выполнения:
20 мг (сырого веса) конъюгата Espergit® -миоглобин-HRPO] суспендируют в неразбавленном вагинальном выделении и 10 мкл 1 М ацетатного буфера. Полученные суспензии инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем центрифугируют для осаждения твердого конъюгата и другого дебриса.
На бумагу, пропитанную гваяковой смолой, наносят 5 мкл прозрачного супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода и наблюдают за образованием окраски.
20 мг (сырого веса) конъюгата Sigmacell® 20-миоглобин-HRPO суспендируют в неразбавленном вагинальном выделении и 10 мкл 250 мМ ацетатного буфера. Полученные суспензии инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем центрифугируют для осаждения твердого конъюгата и другого дебриса.
На бумагу, пропитанную гваяковой смолой, наносят 5 мкл прозрачного супернатанта, а затем 5 мкл раствора пероксида водорода и наблюдают за образованием синей окраски (см. табл. 25).
C. Результаты:
Темно-синяя окраска образовывалась на площади листа, пропитанного гваяковой смолой, на которую добавляли вагинальные выделения женщин, инфицированных вульвовагинальным кандидозом. На той площади листа, пропитанного гваяковой смолой, на которую добавляли вагинальные выделения женщин из контрольной группы, окраска не образовывалась (см. табл. 26).
D. Интерпретация:
Активная аспарагиновая протеаза, секретированная в вагинальных выделениях женщин с клинически диагностированным кандидозом с помощью клеток Candida albicans гидролизовала белок, связанный с Sigmacell® 20, и белок, связанный с Espergit®, высвобождая тем самым растворимую активную HRPO. Центрифугирование осаждало HRPO, связанную с полимером, оставляя в растворе лишь аспарагиновой протеазой солюбилизированную HRPO. Растворимая HRPO катализовала окисление гваяковой смолы под действием пероксида водорода, приводя тем самым к образованию синей окраски. Поэтому образование синей окраски на бумаге, пропитанной гваяковой смолой, дает возможность осуществлять удобный и эффективный способ детектирования активной аспарагиновой протеазы в вагинальных выделениях и, следовательно, вульвовагинального кандидоза.
Активная аспарагиновая протеаза не обнаруживалась в вагинальных выделениях женщин контрольной группы, то есть женщин, не имеющих клинически диагностированного кандидоза. Поэтому в случае образцов вагинальных выделений женщин контрольной группы связанный с полимером белок не гидролизуется, и растворимая активная HRPO не отделяется от носителя. После осаждения HRPO, связанной с полимером путем центрифугирования, в растворе не оставалось аспарагиновой протеазой солюбилизированной HRPO. При отсутствии HRPO, супернатант от контрольных образцов не катализирует окисление гваяковой смолы с помощью пероксида водорода и не продуцирует синюю окраску. Поэтому отсутствие образования синей окраски на пропитанной гваяковой смолой бумаге является удобным методом для идентификации женщин, не инфицированных вульвовагинальным кандидозом.
Эксперимент XIV
Данный эксперимент предусматривает дифференциацию различной гидролитической активности некоторых микробных протеаз с использованием конъюгата Sigmacell® -миоглобин-HRPO.
A. Материалы:
1. [ Sigmacell® -миоглобин-HRPO] (пример E и F).
2. Культура Candida albicans (ATCC 28866), продуцирующая аспарагиновую протеазу.
3. Культура Trichomonas vaginalis (ATCC 3001).
4. Суспензия клеток Mobbluncus curtisii (ATCC 35241) в физиологическом растворе.
5. Буферы и растворы:
a. 0,02%-ный раствор пероксида водорода
b. 300 мМ калийфосфатный буфер с pH 7,5
c. 100 мМ ацетатнатриевый буфер с pH 4,0.
6. Бумага, пропитанная гваяковой смолой (изготавливаемые промышленностью препараты Hemoccult® ).
B. Порядок выполнения:
20 мг субстрата [ Sigmacell® -миоглобин-HRPO] суспендируют в 75 мкл соответствующего буфера (см. табл. 27), а затем добавляют 25 мкл смеси клеточной культуры/суспензии. Полученную реакционную смесь инкубируют в течение 10-30 минут, после чего образец центрифугируют для удаления твердофазного конъюгированного субстрата и клеточного дебриса. На препараты, пропитанные гваяковой смолой, наносят 5 мкл супернгтанта реакционной смеси, а затем проявляют 5 мкл раствора пероксида водорода. Реакционные условия и стадии проявления окраски приведены в табл. 27.
C. Результаты:
При добавлении к препаратам с гваяковой смолой реакционного супернатанта из пробирок, инкубированных с буфером при pH 4,0 или pH 7,5 в течение 30 минут, проявленного пероксидом водорода, окраски не наблюдалось. Аналогичный результат (т.е. отсутствие окраски) был получен с нагретыми до кипения культурами Candida albicans (pH 4,0 и 7,5), Trichomonas vaginalis (pH 4,0 и 7,5) или Mobiluncus curtisii (pH 4,0 и 7,5). Культура Candida albicans продуцировала ярко-синюю окраску после 10-минутного инкубирования при pH 4,0, но не продуцировала окраски при pH 7,5 даже после 30-минутного инкубирования. Trichomonas vaginalis продуцировала ярко-синюю окраску после 30-минутного инкубирования при pH 7,5, однако после 30-минутного инкубирования при pH 4,0 наблюдалась едва заметная окраска. Культура Mobiluncus curtisii после 30-минутного инкубирования, не продуцировала синей окраски ни при 4,0 ни при 7,5 (см. табл. 28).
I. Интерпретация
После 30-минутного инкубирования при комнатной температуре с использованием 300 мМ фосфатного буфера при pH 7,5 или 100 мМ ацетатного буфера при pH 4,0, HRPO не отделялась от твердого носителя. Аналогично нагретые до кипения суспензии Candida albicans, Trichomonas vaginalis или Mobiluncus curtisii не высвобождали HRPO при pH 7,5 или 4,0 после 30-минутного инкубирования при комнатной температуре. Однако при использовании культуры Candida albicans HRPO отделялась от твердого носителя при pH 4,0 после 10-минутного инкубирования, но при pH 7,5, даже после 30-минутного инкубирования, высвобождения HRPO не наблюдалось. Полученные результаты соответствуют pH-профилю, установленному для аспарагиновой протеазы Candida albicans, которая является активной при низких pH и малоактивной или вовсе неактивной при высоких pH. И наоборот, при использовании культуры T. vaginalis HRPO легко отделяется от твердого носителя при pH 7,4 после 30-минутного инкубирования, но при pH 4,0 высвобождаются едва обнаружимые количества HRPO. Этот результат также соответствует известному pH-профилю, полученному для тиоловых протеаз T. vaginalis (т.е. являющихся активными при высоких pH, но малоактивными, или совсем неактивными при низких pH). И, наконец, Mobiluncus curtisii, для которой нет данных относительно секции протеаз, не высвобождала HRPO ни при pH 4,0, ни при pH 7,5 даже после 30-минутного инкубирования.
Таким образом, проведение тестов при различных pH-условиях позволяет дифференцировать три микроорганизма; Candida albicans, который вызывает образование окраски при 10-минутном инкубировании при комнатной температуре при pH 4,0; Trichomonas vaginalis, который вызывает образование окраски через 30 минут при pH 7,5; и Mobiluncus curtisii, который не вызывает образование окраски при 30-минутном инкубировании ни при pH 7,5, ни при pH 4,0.
Эксперимент XV
В данном эксперименте рассматривается активность различных протеаз и их ингибиторов на субстрате [ Espergit® C-миоглобин-HRPO]
A. Материалы:
1. Распыленный [ Espergit® C-миоглобин-HRPO] (пример Q).
2. Изготавливаемая промышленностью аспарагиновая протеаза от фирмы Sigma Chemical Co. (Тип XIII, выделяемая Aspergillus saitoi 0,6 единиц/мг активности; 40 мг/мл).
3. Трипсин (сериновая протеаза) от бычьей поджелудочной железы (2900 единиц/мг активности), поставляемый фирмой U.S. Biochemicals 2 мг/мл.
4. Папаин (тиоловая протеаза) из млечного сока папайи (12 единиц/мг активности) (2 мг/мл), поставляемый фирмой Sigma Chemicals Co.
5. Культура Candida albicans (ATCC 28366), продуцирующая аспарагиновую протеазу.
6. Гидрохлорид тозилхлорометилкетолизина (TLCK) (50 мМ в этаноле) (от фирмы Sigma Chemicals Co.)
7. Пепстатин A (2 мг/мл) от микробного источника, поставляемый фирмой Sigma Chemicals Co. (этаноловый раствор).
8. Буферы и растворы:
a. Калийфосфатный буфер pH 7,0, 200 мМ.
b. Калийфосфатный буфер pH 7,4, 100 мМ.
c. Ацетатнатриевый буфер pH 4,0, 100 мМ.
d. 0,02%-раствор пероксида водорода.
e. Абсолютный этанол.
9. Бумага, пропитанная гваяковой смолой (изготавливаемые промышленностью препараты Hemoccult®).
B. Порядок выполнения
Этот анализ состоит из двух частей. В первой части предусматривается определение активности различных протеаз с использованием субстрата [ Espergit® C-миоглобин-HRPO]. Ферменты и контроль (ферменты, подвергнутые кипячению в течение 15 минут) инкубируют с 20 мг субстрата и буферами (количества указаны в табл. 29) в течение 15 минут до осуществления анализа.
Во второй части, ферменты предварительно инкубируют с их соответствующими ингибиторами и подходящими буферами в течение 15 минут. Затем их добавляют к субстрату и инкубируют еще 15 минут при комнатной температуре.
В обоих случаях, реакционную смесь центрифугируют для удаления твердофазного конъюгата. Супернатант (5 мкл) добавляют к Hemoccult® -препаратам и проявляют 5 мкл пероксида водорода.
C. Результаты
1. Часть I: При добавлении к гваяковым препаратам с проявлением гидроксидом водорода, реакция супернатантов из пробирок, содержащих лишь один буфер при pH 4,0 или при pH 7,5, продуцировала лишь самую слабую визуальную окраску. Аналогичные результаты наблюдались при реакции супернатантов из пробирок, содержащих нагретые до кипения трипсин при pH 7,4, культуру Candida при pH 4,0 и при pH 7,4. Яркая синяя окраска образовывалась с использованием трипсина при pH 7,4, Candida при pH 4,0 и папаина при pH 7,0, не подвергнутые нагреванию до температуры кипения.
2. Часть II: TLCK, ингибитор протеазы, способный ингибировать как сериновую, так и тиоловую протеазы, ингибировал образование окраски, продуцируемой трипсином (сериновой протеазой) и папаином (тиоловой протеазой). Пепстатин, известный ингибитор аспарагиновых протеаз, ингибировал образование окраски, продуцируемой аспарагиновой протеазой Candida albicans (см. табл. 30).
D. Интерпретация
Трипсин (сериновая протеаза) гидролизовал твердофазный субстрат при pH 7,4, высвобождая растворимую HRPO, которая катализирует образование синей окраски на проявленных гваяковых препаратах. Аналогичные результаты наблюдались для аспарагиновой протеазы Candida albicans при pH 4,0 и папаина (тиоловой протеазы) при pH 7,0. Нагревание предотвращало высвобождение HRPO под действием каждого из указанных ферментов. Следовательно, каждый из трех ферментов различных типов обладает способностью к гидролитическому отщеплению растворимой HRPO от носителя при соответствующих реакционных условиях. Ни буферы, ни термоинактивированные ферменты не высвобождали растворимую HRPO, что свидетельствует о том, что высвобождение HRPO не является просто неспецифическим высвобождением, индуцируемым солями и т.п. в культуральную среду или инкубационную смесь.
TLCK, ингибитор протеазы, способный ингибировать как сериновую, так и тиоловую протеазы, ингибировал образование окраски, продуцируемой трипсином (сериновой протеазой) и папаином (тиоловой протеазой). Пепстатин, известный ингибитор аспарагиновых протеаз, ингибировал образование окраски, продуцируемое аспарагиновой протеазой Candida albicans. Следовательно, специфичность обнаружения гидролазы может быть достигнута путем проведения инкубирования в присутствии известных ингибиторов специфических ферментов или ингибиторов специфических классов ферментов.
Вышеприведенное описание представлено в целях иллюстрации. При этом каждому специалисту ясно, что рабочие условия, материалы, стадии процедур и другие параметры описанных способов и испытательных устройств могут быть модифицированы или заменены, не выходя за рамки существа и объема изобретения.
Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, касается обнаружения гидролитически активного фермента, в частности аспарагиновой протеазы в образце или препарате. Образец или препарат контактирует с твердым носителем, на котором иммобилизован фермент-репортер (т.е. сигналгенерирующий фермент) таким образом, что под действием ферментативно активной гидролазы, если таковая присутствует в образце, этот фермент-репортер отделяется от твердого носителя. После контакта с твердым носителем, образец взаимодействует с индикатором. Индикатор представляет собой любое химическое вещество, которое способно подвергаться детектируемому изменению, обычно изменению окраски под действием фермента-репортера. Детектируемое изменение индикатора указывает на присутствие в образце ферментативно активной гидролазы, что может свидетельствовать о наличии конкретного патогена или патологического состояния, например, кандидоза. Устройство для осуществления способа включает приемник образуемый частично первой и второй противоположными стенками, обращенными друг к другу внутренними сторонами с зазором. Стенки изготовлены из светопроницаемого материала. На внутренней поверхности стенок иммобилизован на твердом носителе фермент-репортер и индикатор, способный к детектируемому изменению под действием фермента-репортера. В приемнике выполнено отверстие для ввода образца. Изобретение обеспечивает простоту выполнения анализа, является быстрым и экономичным в применении. 2 с. и 3 з.п.ф-лы, 2 ил., 30 табл.
| Жердев А.В., Дзанжиев Б.Б | |||
| Метод определения протеолитической активности с использованием конъюгата бычьего сывороточного альбумина с пероксидазой | |||
| Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии | |||
| - М.: Медицина, N 1, 1988, с.51-54 | |||
| US 4066509 A, 03.01.1978 | |||
| УСТРОЙСТВО для ФОРМИРОВАНИЯ ЖИДКОМЕТАЛЛИЧЕСКИХ | 0 |
|
SU269362A1 |
