СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АЦЕТАЛЬДЕГИДА В СПИРТОСОДЕРЖАЩИХ РАСТВОРАХ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/14 

Изобретение относится к области пищевой, в частности спиртовой и ликеро-водочной промышленности, и фармацевтической промышленности и может быть использовано для качественного и количественного определения ацетальдегида, а также при контроле качества водки, спирта, спирта, используемого для медицинских целей, спиртосодержащих отгонов ликеро-водочных изделий в условиях испытательных лабораторий.

Известен способ определения альдегидов (ГОСТ 5363-93 Водка. Правила приемки и методы анализа. Раздел 4. Методы анализа), основанный на реакции присутствующей в водке суммы альдегидов, с фуксинсернистым реактивом I с образованием окрашенных продуктов. Одновременно проводится реакция с типовым раствором, содержащим определенное допустимое ГОСТом количество ацетальдегида. Визуально или с помощью фотоэлектроколориметра сравнивается окраска, образовавшаяся в исследуемом растворе, с окраской типового раствора. Если окраска в исследуемом объекте не интенсивнее, чем в типовом, считается, что содержание альдегидов в пересчете на уксусный альдегид (ацетальдегид) не превышает содержание такового в растворе. Таким образом, описанный метод не позволяет количественно определить истинное содержание альдегидов. За рубежом проводят определение каждой индивидуальной токсичной примеси в заявляемых объектах. По указанной методике определяются все присутствующие альдегиды суммарно и делается пересчет на ацетальдегид. Третьим недостатком является то, что в результате реакции окраска мало интенсивна и неустойчива во времени, что может привести к ошибкам. К тому же, для проведения анализа по указанной методике требуются типовые растворы и фуксинсернистый реактив I, которые имеют право изготавливать лишь в одной лаборатории России в Московском опытном заводе ВНИИПБТ.

Другой способ определения альдегидов, также основанный на реакции с фуксинсернистой кислотой (ФС 42-3072-94 "Спирт этиловый 95%. Изменение N 1 от 20 ноября 1995 года). В отличие от предыдущего, в этом документе описывается способ приготовления основного реактива - фуксинсернистой кислоты, но другие недостатки сохраняются. В частности, концентрация ацетальдегида не определяется, а критерием доброкачественности спирта является величина оптической плотности образовавшихся окрашенных продуктов альдегидов с фуксинсернистой кислотой, измеренная с помощью фотоэлектроколориметра при длине волны 536 нм в кювете с толщиной слоя 50 мм относительно воды, которая не должна превышать 0,250. Вторым недостатком также является то, что определяется сумма альдегидов, а не основной токсичный альдегид - ацетальдегид.

Известен еще один способ определения массовой концентрации ацетальдегидов в водке, использующийся как альтернативный (ГОСТ 5363-93. Раздел 5. Фотоколориметрические методы определения примесей в водках), основанный на фотоколориметрическом измерении оптической плотности используемого раствора по концентрированной серной кислоте. В отличие от предыдущих способов позволяет рассчитать массовую концентрацию ацетальдегидов по величине оптической плотности, но определить индивидуально ацетальдегид невозможно. К тому же метод отличается низкой воспроизводимостью.

Наиболее близким к предлагаемому авторами методу является газохроматографический способ определения ацетальдегида (ГОСТ 30536-97. Водка и спирт этиловый. Газохроматографический метод определения содержания микропримесей). Метод основан на применении газовой хроматографии. Для выполнения анализа водки согласно указанному ГОСТу требуется газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором. Микропримеси разделяют путем распределения компонентов между неподвижной (стационарной) и подвижной (газ-носитель) фазами. Разделившиеся компоненты идентифицируют путем сравнения их времен удержания (время, через которое они выходят из колонки после разделения) с временами удерживания стандартных веществ и определяют количественно по величине или площади пиков на хроматограмме. Расхождение между каждым результатом измерений и средним арифметическим значением не должно превышать 15% среднего значения при доверительной вероятности P = 0,95.

Этому способу не присущи недостатки предыдущих, однако, в указанном ГОСТе предлагается два варианта методик в зависимости от того, какой колонкой оснащен газовый хроматограф:
Если газовый хроматограф оснащен насадочной колонкой, то на ней нельзя качественно и количественно определить ацетальдегид.

Если газовый хроматограф снабжен капиллярной колонкой типа HP-FFAP (США) 50 м х 0,32 мм х 0,52 мкм или другой с аналогичными техническими показателями, обеспечивающими аналогичное разделение, то проводится качественный и количественный анализ токсичных примесей, одной из которых является ацетальдегид.

Общим недостатком всех вышеперечисленных методов является невозможность количественного определения концентрации ацетальдегида в растворах. Исключением является газохроматографический способ, однако, и он имеет недостаток - не каждая лаборатория имеет газовый хроматограф, снабженный капиллярной колонкой типа HP - FFAP (США) 50 м х 0,32 мм х 0,52 мкм или другой с аналогичными техническими показателями, обеспечивающими аналогичное разделение.

Изобретением решается проблема идентификации и количественного определения ацетальдегида без использования газового хроматографа с капиллярной колонкой.

Положительный результат достигается применением высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ основан на распределении веществ между неподвижной фазой (жидкость, химически связанная с сорбентом в колонке) и неподвижной фазой (жидкость, поступающая в колонку под давлением). Предварительно получают производные альдегидов с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) - гидразоны и вводят их в колонку хроматографа серии "Милихром", где избыток реагентов и продукты реакции разделяются при хроматографировании в изократическом режиме. Детектирование полученного производного (2,4-денитрофенилгидразона ацетальдегида) и других компонентов реакционной смеси проводится спектрофотометрическим методом при длинах волн 320 и 360 нм. Идентификацию ацетальдегида проводят по времени удерживания и величине спектрального соотношения, равному отношению оптических плотностей гидразона ацетальдегида при 320 и 360 нм в максимуме пика на хроматограмме, сравнивая эти данные с результатами хроматографирования стандартного ацетальдегида.

Массовую концентрацию ацетальдегида в диапазоне 0,5 - 30 мг/дм рассчитывают по градуировочным уравнениям, выражающим зависимость концентрации от площади пика соответствующего гидразона, после предварительной градуировки прибора по растворам ацетальдегида с точно известной концентрацией.

Отличительным признаком предложенного способа является использование жидкостного хроматографа, снабженной колонкой, заполненной обращенно-фазным сорбентом, и хроматографирование предварительно полученного производного ацетальдегида - гидразона, вещества, имеющего большую систему сопряженных двойных связей, что повышает чувствительность спектрофотометрического детектора к ацетальдегиду.

Предлагаемый способ поясняется чертежом, на котором изображена хроматограмма, полученная в результате анализа пробы. 1 (большой пик) - избыток 2,4-ДНФГ; 2 - пик гидразона формальдегида, который содержится как примесь в растворе 2,4-ДНФГ; 3 - пик гидразона ацетальдегида.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом и включает следующие этапы:
1. Подготовка реактивов.

2. Приготовление градуированных растворов.

3. Градуировки прибора (хроматографа).

4. Подготовка пробы к анализу.

5. Анализ. Расчет результатов.

1. Подготовка растворителей и реактивов.

1.1. Очистка 2,4-динитрофенилгидразона. 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ) очищают от примесей методом перекристаллизации из раствора в этиловом спирте. Для этого 2,4-динитрофенилгидразон растворяют в нагретом примерно до 60^oC этиловом спирте до получения насыщенного раствора, раствор фильтруют. Осаждение 2,4-динитрофенилгидразина из насыщенного раствора ведут быстро при перемешивании, постепенно охлаждая его до комнатной температуры. Процедура осаждения должна производиться в течение не более 1,5 часов. Осадок, выпавший после охлаждения спиртового раствора, должен быть мелкокристаллическим. Его отделяют фильтрованием, промывают несколькими порциями охлажденного до 4-10^oC этилового спирта и высушивают в вакуумном эксикаторе до постоянного веса. Контроль чистоты проводят хроматографическим методом, для чего из перекристаллизованного 2,4-динитрофенилгидразона готовят раствор по п. 1.3, вводят в хроматограф 2 мкл этого раствора и хроматографируют по п. 4.2. На хроматограмме должны отсутствовать пики, соответствующие пикам ДНФ - производных ацетальдегида и формальдегида. В случае наличия этих пиков проводят повторную перекристализацию 2,4-ДНФГ. Перекристализованный 2,4-ДНФГ хранят в эксикаторе.

1.2. Фосфатный буферный раствор с pH 6,5; 1 моль/л. 22,8 г двузамещенного фосфорнокислого калия растворяют в 30-50 см³ дистиллированной воды, добавляют концентрированную ортофосфорную кислоту по каплям до pH 6,5 (установление pH раствора проводят с помощью pH-метра), переносят раствор в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Хранят в холодильнике.

1.3. Раствор 2,4-динитрофенил гидразина в ацетонитриле, 1 мг/мл. В стеклянную пробирку с прошлифованной пробкой берут навеску 10,0 ± 0,2 мг 2,4-динитрофенилгидразина, перекристаллизованного по п. 1.1, и растворяют в таком объеме аценитрила, чтобы концентрация 2,4-денитрофенилгидразина составила 1 мг/мл. Хранят в холодильнике, вдали от растворов альдегидов.

1.4. Элюент для хроматографии. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 50 мл ацетонитрила, 20-30 мл дистиллированной воды, 2 мл фосфатного буферного раствора по п. 1.2 и доводят до метки дистиллированной водой. Хранят в посуде с плотно закрывающейся пробкой. Перед использованием дегазируют элюент путем пропускания гелия через раствор или другими доступными способами.

1.5. Раствор ортофосфорной кислоты, (1:7). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 30-40 мл дистиллированной воды, осторожно приливают мерным цилиндром 12,5 мл ортофосфорной кислоты (85%), перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.

2. Приготовление градуировочных растворов.

Для приготовления аттестованных растворов в качестве растворителя используют 40% раствор этилового спирта "Люкс". Предварительно рассчитывают объем крепкого спирта по формуле:
V_х = C_х·V_смеси/C_исх, (1)
где V_х - объем крепкого спирта,
C_х - требуемая концентрация, (40%),
V_смеси - объем 40% спирта,
C_исх - исходная концентрация спирта.

Цилиндром отмеривают рассчитанный объем спирта, помещают его в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой.

2.1. Раствор ацетальдегида для градуировки 0,1% (раствор А). Готовят водный раствор ацетальдегида с концентрацией около 1 мг/мл, для чего 0,13 мг ацетальдегида растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. При необходимости (низкое качество исходного альдегида, длительное хранение приготовленного раствора) определяют концентрацию ацетальдегида в растворе химическим методом по методике, приведенной на чертеже. Раствор хранят в холодильнике плотно закрытым и используют в течение 1 месяца.

2.2. Рабочий раствор ацетальдегида для градуировки, 0,1% (раствор Б 0,1 мг/л). 2,5 мл раствора А переносят в мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 25 мл, готовят аттестованные растворы N 1 - 3 с концентрацией ацетальдегида, близкой к предполагаемой в анализируемых растворах. Разбавление раствора Б проводят с помощью 40% этилового спирта "Люкс" согласно таблице 1. Аттестованные растворы хранят в холодильнике в течение недели.

3. Градуировка хроматографа.

3.1. Градуировочную характеристику устанавливают по трем сериям аттестованных смесей для градуировки, приготовленных по пп 2.1 - 2.3. Для каждой серии проводят "холостой" опыт, для чего вместо аттестованной смеси для градуировки берут смесь, состоящую из равных частей ацетонитрила и воды, источником 2,4-денитрофенилгидразина ацетальдегида в которой является только прибавленный в реакции 2,4-денитрофенилгидразин. Также для каждой серии требуется проведение "контрольного" опыта, где вместо аттестованной смеси берется 40% раствор этилового, источником 2,4-динитрофенилгидразона ацетальдегида является этиловый спирт и 2,4-динитрофенилгидразин.

3.2. Для каждой аттестованной смеси в серии, для "холостого" и "контрольного" опытов проводят определения по пп 4 - 4.2, используя детекцию при длинах волн 320 и 360 нм.

3.3. Рассчитывают площади пиков на хроматограммах, используя обрабатывающую программу "Мультихром".

3.4. Расчетным путем по методу добавок определяют концентрацию ацетальдегида в 40% этиловом спирте, используемом для приготовления аттестованных растворов в качестве растворителя, для этого:
1) из среднего значения трех параллельных определений площадей пиков "контрольного" опыта вычитают среднее значение трех параллельных определений площадей пиков "холостого" опыта и получают разницу, которая соответствует концентрации ацетальдегида в 40% этаноле (S_контр)
2) рассчитывают средние значения площадей пиков каждого аттестованного раствора (N 1 - 3) и вычитают из них среднее значение площади пика "контрольного" опыта. Разница соответствует концентрации ацетальдегида, привнесенной добавкой исходного раствора Б (S_доб.1, S_доб.2, S_доб.3);
3) рассчитывают концентрацию ацетальдегида в 40% спирте в мг/л или в мг/л в пересчете на безводный этанол трижды по каждому аттестованному раствору (N 1 - 3), используя формулу:
C_х/C_доб = S_контр/S_доб (2),
где C_х - концентрация ацетальдегида в 40% спирте мг/л,
C_доб - концентрация ацетальдегида в аттестованных растворах, привнесенная добавкой соответствующего объема раствора Б,
S_контр - площадь соответствующая концентрации ацетальдегида в 40% спирте,
S_доб - среднее значение площадей, соответствующее концентрации добавленного ацетальдегида в аттестованных растворах N 1 - 3;
4) окончательным результатом считают среднее значение концентрации, рассчитанной по каждому из трех аттестованных растворов ацетальдегида.

3.5. Экспериментальные данные обрабатывают по методу наименьших квадратов вручную или с помощью обрабатывающей программы "Мультихром". При градуировке используют абсолютные значения концентрации ацетальдегида в аттестованных растворах, которые складываются из рассчитанного значения концентрации ацетальдегида в 40% C_х спирте плюс концентрация ацетальдегида C_доб, привнесенная добавкой раствора Б. Рассчитывают уравнение градуировочной зависимости в виде:
C_i = A + B·S,
где S_i - площадь пика 2,4-динитрофенилгидразон-альдегида, D_х с;
C_i - концентрация соответствующего альдегида в аттестованной смеси, мг/л;
A и B - коэффициенты регрессии.

Рассчитывают коэффициент корреляции (r). В случае, если коэффициент корреляции r меньше 0,98, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, их устраняют и повторяют эксперимент.

4. Подготовка объектов к анализу.

Анализируемые объекты должны иметь температуру 20-25^o. Если это условие не соблюдается, их помещают в термостат в плотно закрывающейся посуде на 10-15 мин, чтобы достичь требуемой температуры. Спирт и другие объекты, имеющие концентрацию свыше 40%, предварительно разбавляют до 40% дистиллированной водой, расчеты проводят по формуле 1.

4.1. Реакция образования гидразона.

2,4-динитрофенилгидразин, использующийся для градуировки прибора и для последующего проведения анализов, должен иметь одну и ту же степень очистки от гидразонов (использовать одну и ту же серию вещества!). Качество раствора 2,4-динитрофенилгидразина проверяют периодически путем проведения "холостого" опыта, в котором вместо анализируемого объекта берут тот же объем смеси ацетонитрил-вода (1:1). Площади пиков "холостого" опыта при периодической проверке и при градуировке должны различаться между собой и не более чем на 10%.

4.2. Методика проведения реакции образования гидразона ацетальдегида.

2,0 мл анализируемого объекта переносят в пробирку с притертой пробкой, прибавляют по 0,4 мл раствора 2,4-ДНФГ, приготовленного по п. 1.3, и ортофосфорной кислоты (1:7), пробирку закрывают, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Проба должна быть введена в колонку хроматографа в течение последующих 20 мин. Перед хроматографированием пробу фильтруют через металлический фильтр с диаметром пор 0,5 мкм непосредственно в пробирку автосамплера, отбрасывая первые 0,3 - 0,5 мл фильтра. После фильтрования каждой пробы фильтр промывают дистиллированной водой и высушивают, прокачивая через него воздух. Для количественного определения проводят параллельно два опыта.

5. Анализ.

5.1. Условия проведения хроматографического анализа.

Запись хроматограмм при градуировке прибора и при исследовании объектов проводят в следующих условиях.

Элюент: раствор, приготовленный по п. 1.5.

Объем образца: 10 мкл.

Расход элюента: 150 мкл/мин.

Детектор: 320 и 360 нм, 0,34 с.

Температура термостата колонки 35^o.

Время анализа 8 мин.

Эффективность колонки не ниже 3000 теоретических тарелок.

5.2. Последовательность выполнения операций.

5.2.1. Перед анализом проб для уточнения времени удерживания и спектрального соотношения R пика гидразона ацетальдегида хроматографируют один из трех аттестованных растворов.

5.2.2. Контролируют качество раствора 2,4-ДНФГ путем постановки и хроматографирования "холостого" опыта по пп 4.1 и 4.2.

5.2.3. Хроматографируют две пробы, подготовленные по п. 4.2.

5.2.4. Идентификацию пика ацетальдегида на хроматограмме анализируемой пробы проводят сравнением с хроматограммой аттестованного раствора по двум параметрам: времени удерживания и величине спектрального соотношения. Рассчитывают величину спектрального соотношения (R), зарегистрированного при двух длинах волн детектора
R = D₃₂₀/D₃₆₀,
где D₃₂₀ и D₃₆₀ - оптические плотности при длинах волн 320 и 360 нм.

Отличия от пика ацетальдегида по времени удерживания не должны превышать ± 3% и по спектральному соотношению R не более ± 10%. Если соблюдаются эти условия, результат идентификации считается положительным.

Пример 1. 0,1 мл уксусного альдегида растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл. Раствор содержат с учетом плотности уксусного альдегида (0,78 г/мл) 0,078 г/мл уксусного альдегида (раствор А). Из раствора А готовим раствор Б, а затем аттестованные растворы N 1 - 3, согласно таблице 1. Концентрация растворов ацетальдегида в аттестованных растворах будет следующей: раствор N 1 - 1,248 мг/л, раствор N 2 - 3,12 мг/л, раствор N 3 - 6,24 мг/л или 3,12 мг/л, 7,8 мг/л, 15,6 мг/л соответственно в пересчете на безводный спирт.

Хроматографируют аттестованные растворы N 1 - 3, холостой и контрольный растворы. Рассчитывают площади пиков ацетальдегидов на каждой хроматограмме. Вышеописанные операции повторяют три раза. Результаты приводятся в таблице 2.

Рассчитывают концентрацию ацетальдегида в 40% спирте, используемом для приготовления аттестованных растворов.

Рассчитывают абсолютные значения концентрации ацетальдегида в аттестованных растворах N 1 - 3:
N 1 3,12 + 0,678 = 3,798 (мг/л)
N 2 7,8 + 0,678 = 8,478 (мг/л)
N 3 15,6 + 0,678 = 16,278 (мг/л)
При градуировке используют эти данные, уравнение градуировочной зависимости будет иметь вид:
C_i = -0,74 + 2,37S_i
Коэффициент корреляции 0,9998.

Для установления точности способа анализируют три модельных раствора ацетальдегида в 40% спирте. Результаты анализа статистически обрабатывают и представляются в таблице 3. Средние ошибки количественного определения ацетальдегида не превышают 6,5%.

Пример 2. Определяют массовую концентрацию ацетальдегида в водке и спирте. Сравнивают время удерживания, спектральное соотношение и пять параллельных определений двух водок и спирта:
время удерживания стандартного раствора ацетальдегида - 5,13;
спектральное соотношение D₃₂₀/D₃₆₀ = 0,303;
определено ацетальдегида - 3,036 мг/л б.с.

Результаты определения массовой концентрации ацетальдегида в водке и спирте приводятся в таблице 4.

Авторами разработан способ количественного определения ацетальдегида в водке и спирте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Разработанная методика является высокочувствительной, специфичной, достаточно точной, на пробоподготовку расходуется 20 - 25 мин, на хроматографирование 7 мин.

Изобретение может быть использовано для контроля качества водки, спирта, спирта, предназначенного для медицинских целей, спиртосодержащих отгонов ликеро-водочных изделий в условиях испытательных лабораторий. Предварительно получают производные альдегидов с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) - гидразоны и вводят их в колонку хроматографа. Детектирование полученного производного (2,4-динитрофенилгидразона ацетальдегида) и других компонентов реакционной смеси проводится спектрофотометрическим методом при длинах волн 320 и 360 нм. Идентификацию ацетальдегида проводят по времени удерживания и величине спектрального соотношения, сравнивая эти данные с результатами хроматографирования стандартного ацетальдегида. Массовую концентрацию ацетальдегида в диапазоне 0,5 - 30 мг/л рассчитывают по градуировочным уравнениям, выражающим зависимость концентрации от площади пика соответствующего гидразона, после предварительной градуировки прибора по растворам ацетальдегида с точно известной концентрацией. Использование жидкостного хроматографа, снабженного колонкой, заполненной обращенно-фазным сорбентом, и хроматографирование предварительно полученного производного ацетальдегида - гидразона повышает чувствительность спектрофотометрического детектора к ацетальдегиду и позволяет количественно определить ацетальдегид. 1 ил., 4 табл.

Способ идентификации и определения массовой концентрации ацетальдегида в спиртосодержащих растворах в диапазоне концентраций 0,5 - 30 мг/л в пересчете на безводный спирт с погрешностью ± 6,5% хроматографическим методом, отличающийся тем, что используется вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенными фазами с использованием спектрофотометрического детектора после проведения реакции образования гидразона ацетальдегида с 2,4-динитрофенилгидразином.