БИОПРЕПАРАТ-АКТИВАТОР КОМПОСТИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА И РАЗЛОЖЕНИЯ СТЕРНИ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И КОНСОРЦИУМ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА-АКТИВАТОРА КОМПОСТИРОВАНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА И РАЗЛОЖЕНИЯ СТЕРНИ Российский патент 2001 года по МПК C05F11/08 C05F3/00 C12N1/20 C12P39/00 

Настоящее изобретение относится к биотехнологической промышленности и сельскохозяйственной микробиологии и касается получения препаратов для повышения почвенного плодородия и переработки растительного материала и, в частности, касается получения консорциума бактерий и препарата, получаемого на его основе.

Широко известны микроорганизмы, используемые для переработки растительных материалов. Так, выделенная Е.И.Квасниковым культура молочно-кислых бактерий Lactobas. plantarum АН-11/16 и используемая при силосовании зеленой массы кукурузы, ускоряла созревание силоса (1). Применение сумчатых грибов Lophodermium pinasti и Lophodermium macrosporum ускоряло процесс компостирования отработанной хвои (2). При получении компоста на основе птичьего помета, торфа, опилок, навоза крупного рогатого скота использовали в качестве инокулята суспензии бактерий Klebsiella, Pseudomonas putida, Bacillus (3).

Известны способы компостирования и препараты для компостирования, которые включают приготовление компостных смесей (препаратов) с внесением различного рода заквасок, состоящих из смеси микроорганизмов неопределенного состава (4): например, компостируемая смесь, состоящая из органических отходов, птичьего помета, торфа, прогревалась до плюс 40^oC, при этом создавались условия для развития микрофлоры, вносимой из соседнего, эксплуатируемого (по-видимому, активно "бродящего") ферментера; в другом случае, при компостировании отходов волокноотделения при переработке хлопчатника, с целью превращения его в гумусоподобный материал, температуру компостируемой массы повышают до плюс 56 - 65^oC, что происходит за счет роста популяции спонтанной микрофлоры, например, термофильных грибов, актиномицетов, бактерий, при этом отмечается гибель патогенных микроорганизмов (5).

Наиболее близким является использование культуры Lactobac. plantarum АН-11/16, но недостатком является ограниченный спектр применения, а именно - использование его только при силосовании растительного материала.

Целью настоящего изобретения является устранение этого недостатка и получение микроорганизма, пригодного для применения не только для компостирования растительного материала, но и для получения почвоулучшающего препарата, применяемого, например, для разложения растительных пожнивных остатков - стерни в поле после уборки злаковых, хлопчатника, а также других сельскохозяйственных культур.

Получен консорциум молочно-кислых бактерий, позволяющий исключить упомянутый недостаток и получить препарат более широкого спектра действия, а именно: - компостировать растительный материал с целью получения компостной массы для последующего использования в качестве почвоулучшающего субстрата (сорная трава, растительные остатки, бытовые углерод-содержащие отходы и т. д. ); - разлагать пожнивные остатки, стерню, оставшиеся на поле после уборки хлопчатника, кукурузы, зерновых и других сельскохозяйственных культур непосредственно в поле для ускорения разложения растительных остатков, обогащения почвы продуктами биоконверсии стерни, повышения плодородия почвы, уничтожения семян сорняков после уборки урожая.

Консорциум выделен из образцов почв (серозема), отобранных на территории, прилегающей к молокоперерабатывающему предприятию (пригород Андижана, Узбекистан).

Для выделения молочно-кислых бактерий применяли прямой высев из отобранных образцов почвы с последующим получением накопительной культуры вначале на жидких средах (гидролизованная молочная среда со спиртом), а затем - агаризованная среда с мелом.

Ступенчатую аналитическую селекцию вели по принципу отбора термофильных, высокопродуктивных и активных продуцентов молочной кислоты в сочетании с высоким уровнем синтеза цитокининов.

Морфологию колоний культур - составляющих консорциума - описывали по микроскопированию глубинных колоний: чашки Петри с 2-х суточной культурой консорциума (не более 100 колоний на 1 чашке), заливали питательной средой (высота слоя 3 - 5 мм), расплавленной и охлажденной до плюс 45 - 43^oC, культивирование вели еще 48 часов.

Колонии молочно-кислых бактерий по морфологии локонообразные и звездчатые: с выростами по периферии, плотным центром.

Консорциум представляет собой естественное неделимое сообщество.

Высев моноколониальных изолятов на молочную среду, изучение их кислотообразующей активности, отношение к углеводам по способности образовывать их, обосновали определение видового состава консорциума.

Основная физиологическая особенность консорциума, имеющая практическое значение - это продуцирование биологически активных веществ.

Все культуры консорциума - термофилы, с границами хорошего роста и высокой активности в пределах 35 - 45^oC при оптимуме плюс 39±1^oC. Lactobacillus acidophillus. Растут при плюс 50^oC; не растут при плюс 20^oC, никогда не растут при плюс 15^oC. Сбраживают: целлобиозу, лактозу, мальтозу, галактозу, мелибиозу, салицин, сахарозу, трегалозу; не сбраживают: рамнозу, маннит, сорбит; слабо сбраживают: раффинозу. Оптимальная температура роста плюс 39±1^oC.

Lactobacillus plantarum - мелкие палочки, расположенные по одиночке, парами, очень редко - цепочки по 3 - 4 клетки. Грамположительны, спор, капсул не образуют. В мясо-пептонном бульоне дает слабое помутнение, исчезающее к 48 часу роста; образуют плотный, белый, труднорастворимый осадок. На твердых питательных средах мелкие, круглые, каплевидные колонии с ровными краями, беловато-кремового цвета.

Поверхность колоний гладкая, блестящая. Растут на капустно-меловом агаре с образованием зон просветления вокруг колоний. Сбраживает: сахарозу, глюкозу, галактозу, целлобиозу, слабо ферментирует лактозу, маннит.

Streptococcus thermophilus - растет при плюс 50^oC, не растет при плюс 10, 13, 16^oC; сбраживает мальтозу, раффинозу, сахарозу, лактозу; слабо ферментирует глюкозу; не сбраживает маннит, сорбит. Оптимальная температура роста плюс 39±1^oC.

Подобный консорциум не описан в литературе и выделен как природный, неразделимый, впервые.

Доминирующим компонентом консорциума являются палочки; количество их составляет 60 - 70%. Варьирование соотношения бактерий - компонентов консорциума зависит, главным образом, от состава питательной среды. При повышении концентрации азотистых соединений и понижения концентрации углеводов доминирующим компонентом могут стать молочно-кислые стрептококки, до 70% и выше.

Основными свойствами консорциума являются высокая гидролитическая активность, антибиотическая активность в отношении фитопатогенных грибов Helminthosporium sativum, Verticillum dahliae, Fusarium lini, Fusarium oxysporum, высокая цитокининная активность.

Целлюлозную активность определяли по методике, принятой в ферментной промышленности (6); цитокининную активность - по биотесту, выражая ее в %% к контролю; антибиотическую активность - по минимальной подавляющей концентрации, сопоставляемой с диаметром зоны подавления роста испытуемого гриба - патогена.

Целлюлозная активность составляла - 1,3 - 4,2 мг
Цитокининная активность составляла - 120 - 142%%
Антибиотическая активность составляла 4 - 11 мм в диаметре (зона подавления роста фитопатогена) при разведении в 1000 раз.

Фосфатазная активность определялась по трансформации нерастворимых соединений фосфора (зона просветления среды на чашках Петри при внесении в среду трикальцийфосфата, нуклеоната натрия, фторапатита), зона просветления составляла 4 - 7 мм при внесении в среду нуклеоната натрия и 3 - 8 мм при внесении в среду трикальций фосфата.

Консорциуму присвоен номер 384 - 5КС, консорциум хранится в музее культур микроорганизмов в АОЗТ "Биофлора" под коллекционным номером В-04. Консорциум сохраняет свои свойства при хранении в лиофилизированном состоянии (сушка с использованием сахарозо-желатиновой защитной среды), температура хранения - не выше минус 4^oC.

Полученный консорциум позволяет исключить недостатки препарата, получаемого на основе штамма Lactobac. plantarum АН-11-16 и получать препарат более широкого спектра действия, а именно, компостировать растительный материал с целью получения компостной массы для последующего использования в качестве почвоулучшающего препарата и, кроме того, разлагать пожнивные остатки, стерню, остающиеся после урожая сельскохозяйственных культур, таких, например, как кукуруза, хлопчатник, подсолнечник, непосредственно в поле.

Полученная культура может быть использована самостоятельно, как препарат для компостирования или разложения стерни.

Пример 1.

В 1 литр стерильного обрата вносят витаминные добавки в виде водного стерильного раствора витаминов PP, B₁₂, парааминобензойной кислоты, рибофлавина, B₆ суммарной концентрацией 60 мг/1000 мл обрата. Инокулируют лиофилизированной культурой консорциума молочно-кислых бактерий 384-5КС, состоящего из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, инкубируют в анаэробных условиях при температуре плюс 39±2^oC в течение 18 часов до достижения pH 3,6; плотность микробной популяции достигала 4,5 · 10¹¹ клеток/мл.

Полученную бактериальную культуру в 100 раз разбавляли водопроводной водой и полученной суспензией опрыскивали стерню после уборки яровой пшеницы из расчета 1000 мл суспензии на 100 м² поля; стерню запахивали, оставляли на зиму. Весной проводили анализ почвы и сравнивали с анализом пробы, взятой на необработанном участке поля. Результаты показали, что на обработанном участке в почве содержится в 1,4 раза выше углерода, в 2,1 раза выше численность сапрофитной микрофлоры, в 3,3 раза ниже численность грибной микрофлоры, а содержание фосфора (в пересчете на P₂O₅) более чем в 6 раз превышает содержание его в почве на необработанной части поля, что позволило не применять на обработанной части поля фосфорные минеральные удобрения. Остатки стерни представляли собой тонкие мацерированные частицы волокнистой структуры, в то время как на необработанной части поля стерня практически не видоизменилась.

На основе данной культуры - консорциума бактерий, состоящего из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus, которому присвоен номер 384-5КС (коллекционный N В-04), была разработана рецептура биопрепарата, который предложено применять как для компостирования растительного материала, так и для разложения стерни, т.е. непосредственно в поле.

Для получения препарата в жидкую культуру консорциума 384-5КС, выраженную на 10%-ном стерильном обрате с витаминными добавками при температуре плюс 40^oC в течение 18-24 часов в анаэробных условиях до достижения плотности популяции 10¹¹-10¹² клеток/мл, и имеющую целлюлозную активность не менее 1,3-4,0 мг, вносят 3 - 5 объемов водопроводной воды, а затем сухие водоросли (или их альгинаты) в количестве 0,3 - 3,5%, поверхностно-активное вещество (лапрол, пропил Б-400) в количестве 0,001%, карбамид в количестве 0,7 - 7,0%, фосфорнокислый калий в количестве 0,0005-0,030%, фосфорную кислоту, микроэлементы Zn, Mg, Mn, Mo, Co, Cu, B, в виде комплексонатов на основе глицина или, например, ОЭДФ в равных количествах при суммарной концентрации 0,0001-0,003%, стабилизаторы (консерванты) бензоат Na, пропионат Ca, аскорбиновую кислоту - суммарной концентрацией 0,001 - 0,01%, объем препарата доводят до расчетного водопроводной водой, тщательно перемешивают.

Полученный препарат используют для обработок.

Пример 2.

К 20 мл жидкой культуры консорциума, бактерий 384-5КС, выращенной на 10%-ном стерильном обрате при плюс 40^oC в анаэробных условиях в течение 24 часов, добавляли 80 мл водопроводной воды, 0,3 г альгинатов морских водорослей, 0,7% карбамида, 10 мг двузамещенного фосфата K, 5 мл раствора смеси микроэлементов, содержащего 54 мг микроэлементов Zn, Mg, Mn, Mo, Cu, Co, B, в форме комплексонатов ОЭДФ, смесь пропионата Ca и бензоата Na (в равных количествах) - всего 4 мг, аскорбиновую кислоту 20 мг, пропинол Б-400 в количестве 0,3 мл.

Полученный препаратом в разбавлении 1: 100 обработали 500 мг сорной травы, скопившейся после прополки посевов столовой свеклы и моркови. Обработку проводили опрыскиванием с помощью опрыскивателя "Квазар", с последующим перемешиванием обработанной массы, уплотнением ее; поверхность обработанной массы укрывали черной полиэтиленовой пленкой. Через 5 суток обработанная масса оседала, а температура на глубине 12 - 15 см повышалась до 52 - 57^oC. Через 15 суток отбирали пробу ферментированной массы. Она представляла собой мацерированные волокна травы, имела зеленовато-бурую краску, приятный специфический запах. Полученный компост был проанализирован на содержание некоторых групп микроорганизмов, этот же анализ был проведен с образцами травы, не обработанной препаратом, но также укрытой черной пленкой. В компостированной (обработанной) траве обнаружены лишь единичные колонии грибов при высеве на среду Чапека, а в образцах необработанной травы обнаружено 7 · 10² - 1 · 10³ клеток грибов/г; образцы необработанной травы имели вид темной, с неприятным запахом массы, что подтверждает наличие аммонификаторов.

Пример 3
Компостированную массу травы, полученную в примере 2, вносили в качестве подкормки при выращивании клубники. Подкормку проводили при появлении первой завязи из расчета 300 - 500 г компостной массы вокруг каждой "розетки" на опытном участке. Контролем служили растения, подкормку которых компостной массой не проводили. Отмечено резкое снижение числа ягод, пораженных серой гнилью (в контроле, т.е. без подкормки компостной массой, число пораженных ягод составляло 85%, в то время, как на кустах, обработанных, т.е. с подкормкой, число пораженных ягод составило всего 11%); отмечена прибавка урожая ягод - 19 ц/га, в то время как урожай ягод без подкормки компостной массой составил 15,5 ц/га, таким образом, прибавка урожая составила 3,5 ц/га или 22%.

Пример 4.

20 мл препарата, полученного в примере 2, разводили водопроводной водой в соотношении 1:50. Полученный раствор проверяли на отношение к возбудителям некоторых, наиболее распространенных болезней растений. Проверку проводили на чашках Петри, методом колодца.

Были получены следующие результаты (см. табл. 1).

Таким образом, установлено, что препарат обладает способностью подавлять рост некоторых возбудителей растений, т.е. оказывает оздоравливающий эффект на почву и на растения, препятствуя инфицированию их.

Пример N 5.

10 мл препарата, полученного в примере 2, разбавляли водопроводной водой до 10 литров. Полученным раствором обрабатывали площадку (100 м²) поля после уборки кукурузы, для чего раствор разбрызгивали, а обработанную площадь запахивали, масса пожнивных остатков на 1 м² достигала до 3,7 кг. В пробе почвы, отобранной перед обработкой препаратом, определяли численность сапрофитной микрофлоры, а также актиномицетов, грибов, анаэробных бактерий, разлагающих клетчатку. Повторную пробу отбирали весной, после таяния снега и проводили эти же определения. Такой же анализ проводили с образцом почвы, отобранным с необработанного участка поля. Результаты приведены в таблице 2.

Таким образом, получен новый консорциум молочно-кислых бактерий с оригинальными свойствами, что позволило разработать препарат - активатор компостирования растительного материала и разложения стерни, который дополнительно обладает способностью улучшать состав почвенной микрофлоры, обладает фунгицидными свойствами; состав препарата обеспечивает его экологическую чистоту и безопасность, т.к. все компоненты, входящие в его состав, в процессе действия препарата полностью потребляются, участвуя в процессах, происходящих при компостировании растительного материала, или участвуя в процессах разложения стерни, являясь компонентами питания микроорганизмов почвы, участвующих в этом процессе.

Использованная литература
1. Е. И. Квасников, О.А. Нестеренко "Молочно-кислые бактерии и пути их использования. М., "Наука", 1977 г., с. 322.

2. Авторское свидетельство, СССР, N 962279, опубл. 30.09.82 г.

3. Патент РФ N 2057103. (Бюллетень изобретений N 9, 1996 г., с. 214).

4. Патент РФ N 2028998. (Бюллетень изобретений N 5, 20.02, 1995 г.).

5. Патент РФ N 2025470. (Бюллетень изобретений N 24, 30.12.1994 г.).

6. Сэги Й. "Методы почвенной микробиологии". М., 1983 г., с. 239 - 242.

Изобретение относится к биотехнологии, сельскохозяйственной микробиологии и касается биоконверсии растительных отходов. Консорциум бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 384-5КС хранится в коллекции микроорганизмов акционерного общества закрытого типа "Биофлора" под номером В-04. На основе консорциума разработана рецептура препарата для компостирования растительного материала и разложения стерни. Препарат содержит консорциум вышеуказанных бактерий, выращенных на жидкой питательной среде в количестве 25 - 30%, карбамид 0,7 - 7,0%, сухие водоросли или их альгинаты 0,5 - 3,5%, двузамещенный фосфорнокислый калий 0,0005 - 0,03%, микроэлементы В, Zn, Mg, Mn, Mo, Cu, Co в виде комплексонатов в равных количествах при суммарной концентрации 0,0001 - 0,003%, поверхностно-активное вещество 0,001 - 0,05%, стабилизаторы - бензоат натрия, пропионат кальция, аскорбиновую кислоту в равных количествах 0,001 - 0,01%. Препарат улучшает состав почвенной микрофлоры, обладает фунгицидными свойствами. Состав препарата обеспечивает его экологическую чистоту и безопасность. Препарат пригоден для использования в качестве компонента при составлении почвоулучшающих композиций. 3 с. и 8 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Консорциум бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 384-5КС (АОЗТ "Биофлора" В-04) для получения биопрепарата - активатора компостирования растительного материала и разложения стерни. 2. Способ получения биопрепарата - активатора компостирования растительного материала и разложения стерни, отличающийся тем, что консорциум бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 384-5КС (АОЗТ "Биофлора" В-04) культивируют на обрате, содержащем стартовые витаминные добавки в виде водного раствора смеси витаминов: парааминобензойной кислоты, тиамина, аскорбиновой кислоты, рибофлавина в суммарной концентрации 0,005 - 0,06%. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что полученную культуральную жидкость разбавляют водой и вносят водоросли или альгинаты, поверхностно-активное вещество, карбамид, фосфорную кислоту, микроэлементы Zn, Mg, Mn, Mo, Cu, Co, B в виде комплексонатов и стабилизаторы. 4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что в культуральную жидкость вносят водоросли или альгинаты в количестве 0,5 - 3,5%, карбамид 0,7 - 7%, фосфорнокислый калий 0,0005 - 0,03%, микроэлементы в суммарном количестве 0,0001 - 0,003% в виде комплексонатов. 5. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что в качестве стабилизаторов используют пропионат кальция, бензоат натрия и аскорбиновую кислоту. 6. Биопрепарат-активатор компостирования растительного материала и разложения стерни, содержащий молочнокислые бактерии, отличающийся тем, что молочнокислые бактерии он содержит в виде консорциума бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus 384-5КС (АОЗТ "Биофлора", В-04) и дополнительно содержит сухие водоросли или альгинаты, карбамид, фосфорнокислый калий, фосфорную кислоту, микроэлементы Zn, Mg, Mn, Mo, Cu, Co, B, стабилизаторы: пропионат кальция, аскорбиновую кислоту и бензоат натрия, поверхностно-активное вещество и воду. 7. Биопрепарат по п. 6, отличающийся тем, что водоросли он содержит в виде сухих морских водорослей или альгинатов в количестве 0,5 - 3,5%. 8. Биопрепарат по п.6, отличающийся тем, что карбамид он содержит в количестве 0,7 - 7%, фосфорнокислый калий 0,0005 - 0,03%. 9. Биопрепарат по п.6, отличающийся тем, что микроэлементы он содержит в суммарном количестве 0,0001 - 0,003% в виде комплексонатов Zn, Mg, Mn, Mo, Cu, Co, B, получаемых, например, на основе глицина или оксиэтилендиаминфосфата. 10. Биопрепарат по п.6, отличающийся тем, что стабилизаторы-пропионат кальция и бензоат натрия, аскорбиновую кислоту он содержит в количествах, суммарно равных 0,001 - 0,01%, а в качестве поверхностно-активных веществ содержит лапрол или пропинол В-400 в количестве 0,001 - 0,05%. 11. Биопрепарат по п.3, отличающийся тем, что воду он содержит в количестве, равном 2,5 - 5 объемам к объему консорциума молочнокислых бактерий, используемых в качестве основы биопрепарата.