БИОПРЕПАРАТ-ПРОБИОТИК, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ШТАММ STREPTOCOCCUS FAECIUM ТЕ-17 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА-ПРОБИОТИКА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/46 

Изобретение относится к животноводству и ветеринарии, может быть использовано в биотехнологии, промышленном и фермерском способе выращивания с/х животных для оздоровления молодняка, получения дополнительного привеса животных.

Известно, что некоторые молочнокислые бактерии подавляют рост и развитие патогенной и условно патогенной микрофлоры кишечника животных и птицы. Так, штамм бактерий Streptococcus faecium M-3185 используют для борьбы с дисбактериозом с/х животных [1].

Известны биопрепараты на основе молочнокислых бактерий, используемые в животноводстве. Так, например, известен препарат на основе Lactobacillus acidophilus для профилактики кишечных заболеваний молодняка с/х животных [2] .

Известен биопрепарат на основе молочнокислых бактерий Streptococcus и Lactobacillus-галлиферм, подавляющий развитие условно-патогенной и гнилостной микрофлоры кишечника животных [3].

Известна также питательная среда для выращивания штамма Streptococcus faecium СТФ-1/56 при получении пробиотика, содержащая молочную сыворотку, морскую воду как источник микроэлементов Zn, Mg, Fe, Cu, Mn, Со, глюкозу, однозамещенный фосфорнокислый калий, хлористый аммоний и воду водопроводную [4].

Однако препараты на основе вышеуказанных штаммов не получили широкого применения; во-первых, используемые штаммы имеют невысокую продуктивность, во-вторых, предлагаемая технология требует исключительно высоких энергозатрат, так как форма препаратов сухая, с использованием сублимационной или распылительной сушки.

Из кишечника цыпленка были выделены изоляты, содержащие молочнокислые бактерии, которые после ступенчатой селекции продуктивных вариантов были идентифицированы как Streptococcus faecium [5].

Для выделения молочнокислых бактерий применяли прямой высев из образцов, накопительные культуры на жидких средах со спиртом, последующий высев на агаризованные среды с мелом.

1. Культурально-морфологические особенности.

Streptococcus faecium относится к роду Streptococcus Rosenbach. Представляет собой кокки размером 0.8-1.0 мкм, расположенные короткими цепочками, группами или попарно, спор не образуют, неподвижны, окраска по Грамму - положительная. На агаризованных питательных средах образуют блестящие плотные диски правильной формы с ровными краями диаметром 1-2 мм. При выращивании на жидкой питательной среде через 12-24 часа образуют однородную муть, оседающую на 2-3 сутки.

2. Физиологические свойства.

Факультативный анаэроб, грамположительный, сбраживает маннозу, галактозу, арабинозу, трегалозу, мальтозу, глюкозу, лактозу, салицин, рибозу, целлобиозу, амигдалин, фруктозу, декстрин, маннит; не сбраживает сахарозу, раффинозу, дульцит, инулин, инозит, сорбит, сорбозу, ксилозу. Не содержит цитохром дыхательного пути, каталазоотрицательный, не восстанавливает нитраты, образует аммиак из аргинина, не разжижает желатин, сквашивает и слабо пептонизирует молоко, восстанавливает молоко с лакмусом и растет на среде, содержащей 40% желчи, 6,5% хлористого натрия, 4% таурохолата. Образует молочную кислоту 0,1-0,15% на 7-9 сутки ферментации.

Особенностью штамма Streptococcus faecium ТЕ-17 является высокая удельная скорость роста, гомоферментативное молочнокислое брожение, антагонизм по отношению к некоторым патогенным и условно патогенным микроорганизмам: Ps aeruginosa, Str. aureus, Вас. mesentericus, Salmonella typhimurium, E. coli, Mycobacterium. smegmatis, Klebsiella pneumonia.

Устойчив к антибиотикам: тетрациклину, ампициллину, левомицину, пенициллину, эритромицину.

Условия хранения штамма: лиофизированная культура, выращенная на среде, содержащей 20% дрожжевого автолизата, 3,0% глюкозы, сухой обрат (или молочная-подтворожная) сыворотка - 10%, вода - до 1 литра. Хранение в ампулах или флаконах при температуре не выше минус 2^oС.

Сравнительная оценка продуктивности штамма Streptococcus faecium ТЕ-17 представлена в таблице 1.

Штамм хранится в коллекции микроорганизмов ЗАО "БИОФЛОРА", коллекционный В-07.

Выявленные свойства штамма дают основание использовать его для получения биопрепарата для животноводства в качестве пробиотика с лечебно-профилактическими свойствами.

Пример 1. Для получения 1 л жидкой культуры штамма Streptococcus faecium ТЕ-17 (коллекция ЗАО "Биофлора В-07") с целью получения биопрепарата готовили жидкую питательную среду: В 1 л молочной сыворотки вносили 200 г дрожжевого автолизата, 3,0 г глюкозы, среду стерилизовали 20 минут при 0,5 кгс/см². В охлажденную стерильную воду вносили витаминные добавки в виде стерильного раствора витаминов: тиамина, парааминобензойной кислоты, рибофлавина, аскорбиновой кислоты в равных количествах суммарно 0,1 г/л среды, рН среды 6,5. Среду инокулировали приготовленной посевной культурой Streptococcus faecium ТЕ-17 (коллекция ЗАО "Биофлора В-07") из расчета 10% инокулюма, т. е. 100 мл. Ферментацию проводили при 41^oС. На 6 часу ферментации стерильно, при слабом перемешивании вносили 2 л спиртового раствора непредельных жирных кислот концентрацией 0,005 М. Выращивание проводили в течение 18 часов, рН полученной жидкой культуры 3,8, число КОЕ 2•10¹⁰мл^-1. Полученную жидкую культуру использовали для получения биопрепарата.

Пример 2. Жидкую культуру, полученную, как описано в примере 1, разбавляли водопроводной водой в соотношении 1:2 и вносили, при перемешивании, 20 г альгинатов фукуса и 20 мл жидкой культуры Bacillus mucilaginosus (6) c вязкостью 43•10³ пуаз, карбамид из расчета 10 г/л и микроэлементы в виде глицинатов Zn, Mg, Mn, Fe, Cu, В, Se, из расчета 10 мг/л, стабилизаторы пропионат кальция, бензоат натрия, аскорбиновую кислоту в количестве 100 мг/л суммарно. После перемешивания доводили рН препарата до значения 3,5 добавлением молочной кислоты. Полученный препарат использовали для дальнейших опытов.

Пример 3. Исследовали сохранность жизнеспособных клеток в препарате в процессе длительного хранения при температуре 7±2^oС. Полученные результаты представлены в таблице. 2
Пример 4. Биопрепарат, полученный, как описано в примере 2, вносили в корм бройлерам в количестве 3,0 и 1,5 мл на 1 кг корма в течение всего периода откорма цыплят. Результаты опыта представлены в таблице 3.

Пример 5. Биопрепарат, полученный, как описано в примере 2, вносили в корм цыплятам с признаками диареи в дозе 3 и 1,5 мл на 1 кг корма в течение всего периода откорма цыплят. Вели наблюдения в течение 7 дней. Результаты опыта представлены в таблице 4.

Пример 6. Биопрепарат, полученный, как описано в примере 2, вносили в корм поросят с признаками диареи в дозе 3 и 1,5 мл на 1 кг корма в течение всего периода откорма поросят. Вели наблюдения в течение 14 дней. Результаты опыта представлены в таблице 5.

Таким образом, применение заявляемого биопрепарата позволяет получить прибавку в весе (массе) птицы 11-15%, при этом заявляемый препарат подавляет рост патогенной микрофлоры, оказывая оздоравливющий эффект.

Пример 7. Биопрепарат, полученный, как описано в примере 2, вносили в корм поросятам в количестве 1,5 мл на 1 кг корма в течение 1 месяца. Результаты опыта представлены в таблице 6.

Источники информации
1. Патент РФ 2152433, опубл. 10.07.2000 г.

2. Л.Ф. Абызова, М.С. Полонская, В.В. Леонович. Сборник трудов ВНИИБактпрепарат, вып. 1. М., 1973 г., с. 97-105.

3. Наставление по применению галлиферма в ветеринарии. М., 1990 г.

4. Патент РФ 2086647, опубл. 10.08.97 г.

5. Определитель бактерий Берджи. М., 1987 г.

6. Патент РФ 2081867, опубл. 20.06.97 г.

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии, может быть использовано для выращивания с/х животных, оздоровления молодняка. Штамм Streptococcus faecium ТЕ-17 хранится в коллекции ЗАО "Биофлора" под В-07. Штамм обладает высокой продуктивностью и способностью подавлять патогенную микрофлору. При получении пробиотика для культивирования штамма питательную среду обогащают дрожжевым автолизатом, водным раствором витаминов и непредельными жирными кислотами - предшественниками простагландинов. В результате получен пробиотик, представляющий собой жидкую культуру S. faecium ТЕ-17, биополимеры, карбамид, микроэлементы, стабилизатор, молочную кислоту и воду водопроводную в установленном содержании компонентов. Использование пробиотика позволяет получать прибавку в весе птицы, при этом подавляется рост патогенной микрофлоры, оказывая оздоравливающий эффект. 3 с.п.ф-лы, 6 табл.

1. Штамм Streptococcus faecium ТЕ-17 (коллекция ЗАО “БИОФЛОРА” № В-07) для получения биопрепарата-пробиотика с лечебно-профилактическими свойствами для животных и птицы.2. Способ получения пробиотика для животных и птицы, предусматривающий получение жидкой культуры Streptococcus faecium культивированием микроорганизма до заданного содержания микробных клеток на питательной среде, содержащей молочную сыворотку, глюкозу, отличающийся тем, что культивируют штамм Streptococcus faecium ТЕ-17 (коллекция ЗАО “БИОФЛОРА” № В-07) на питательной среде, дополнительно содержащей дрожжевой автолизат в количестве 18-25% от молочной сыворотки, витаминную добавку в виде водного раствора витаминов: парааминобензойной кислоты, тиамина, аскорбиновой кислоты, рибофлавина суммарной концентрацией 0,005-0,06% от молочной сыворотки, и непредельные жирные кислоты - предшественники простагландинов в количестве 10^-5-10^-6 М.3. Пробиотик для животных и птицы, содержащий жидкую культуру Streptococcus faecium ТЕ-17 (коллекция ЗАО “БИОФЛОРА” № В-07), полученную по п.2, биополимеры в виде водорослей или их альгинатов и жидкой культуры Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987, содержащей синтезируемый ею полисахарид в количестве суммарно 3-10%, карбамид, микроэлементы Zn, Mg, Mn, Fe, Cu, В, Se, в виде комплексонатов на основе глицина или оксиэтилидендифосфоновой кислоты (ОЭДФ), стабилизатор в виде смеси пропионата кальция, бензоата натрия и аскорбиновой кислоты, молочную кислоту и воду водопроводную при следующем содержании компонентов, мас.%:

Жидкая культура Streptococcus

faecium ТЕ-17 (коллекция ЗАО

“БИОФЛОРА” № В-07) по п.2 50

Биополимеры 3-10

Карбамид 0,2-2,0

Микроэлементы 0,0001-0,003

Стабилизатор 0,001-0,01

Молочная кислота (в количестве, необходимом

и достаточном для доведения

величины рН препарата до 3,5-4,2)

Вода водопроводная Остальное