ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2001 года по МПК A61K31/409 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к фотосенсибилизаторам для фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных опухолей и других патологических новообразований.

Метод ФДТ основан на использовании препаратов-фотосенсибилизаторов (ФС), которые при введении в организм накапливаются преимущественно в опухоли. В настоящее время в клинической практике применяются ФС на основе сложных смесей производных гематопорфирина, например FOTOFRIN-II [1]. При световом, например, лазерном облучении патологического участка накопленный в опухоли препарат, взаимодействуя с тканевым кислородом, катализирует образование цитотоксического агента - синглетного кислорода, разрушающего опухолевые клетки.

Известен также ФС для ФДТ на основе сульфированного фталоцианина алюминия (Pc^SAl) [2]. При использовании этого препарата под действием светового облучения возможен как фотодинамический процесс по второму механизму - непосредственное взаимодействие препарата с тканевым кислородом с образованием цитотоксического агента - синглетного кислорода, так и фотодинамический процесс по первому механизму - взаимодействие препарата с экзогенными восстановителями (например, аскорбатом натрия) с образованием цитотоксических агентов - свободных радикалов. При этом кислород участвует в фотодинамическом процессе как восстановитель аскорбата натрия. Этот препарат является наиболее близким аналогом к предлагаемому (прототип).

Недостатком вышеописанных ФС является то, что эффект их фотодинамического воздействия кислородозависим, то есть концентрация образующихся цитотоксических агентов прямо (в случае второго механизма) или косвенно (в случае первого механизма) связана с концентрацией внутритканевого кислорода. В то же время все опухоли характеризуются значительной гипоксией, то есть из-за неразвитости сосудистой системы опухоли и повышенного давления тканей на сосуды, а также высокой вероятности разрушения сосудов на начальных этапах ФДТ давление кислорода в опухоли существенно ниже по сравнению со здоровыми тканями. Это затрудняет лечение опухолей больших размеров, приводит к необходимости использовать большие дозы вводимого в организм препарата и большую длительность терапевтической процедуры, что вдобавок вызывает значительные побочные эффекты. В целом все это приводит к невысокой эффективности ФДТ.

В предлагаемом изобретении решается задача создания кислородонезависимых ФС, обеспечивающих при оптическом облучении продуцирование цитотоксических агентов для эффективной ФДТ глубоких опухолевых тканей в условиях гипоксии.

Указанная задача решается тем, что в качестве ФС для ФДТ предлагаются водорастворимые производные тетраазапорфириновых комплексов титанила общей формулы R_nLTiO, где L - лиганд, представляющий собой производное тетраазапорфирина, выбранное из группы, включающей фталоцианин (Pc), нафталоцианин (Nc), тетрапиразинопорфиразин;
R - придающий растворимость в воде гидрофильный заместитель, например HO₃S-, NaO₃S, HO₂C, (HO)₂(O)P-, (HO)₂(O)PCH₂-,

n - число заместителей, может принимать значения в интервале 3-10.

Для придания растворимости в водных средах заявляемые комплексы содержат в молекуле гидрофильные группы - анионные (сульфо-, карбокси-, фосфонатные) и катионные (в основном аммонийные, например, пиридиниометильные), которые вводятся известными для фталоцианинов методами, например [3]. Сульфогруппы вводятся прямым сульфированием комплексов концентрированной серной кислотой, олеумом или хлорсульфоновой кислотой в зависимости от их реакционной способности; карбоксигруппы образуются путем гидролиза имеющихся в комплексе заместителей (например, цианогрупп); катионные группы образуются в результате взаимодействия имеющихся в молекуле функциональных заместителей (например, хлорметильных групп), например с пиридином, тиомочевиной, триарилфосфинами.

Ниже приведены примеры синтеза заявляемых ФС.

Пример 1. Октакис(пиридиниометил)фталоцианин титанила октахлорид (pym- PcTiO)
1.1. Октакис(хлорметил)фталоцианин титанила. К смеси 20 г безводного хлористого алюминия и 8 мл триэтиламина при комнатной температуре прибавляли 12 мл симм-дихлордиметилового эфира и затем -1.0 г фталоцианина титанила [4] , температуру повышали до 90^oC и нагревали при этой температуре при перемешивании в течение 2.5 ч. Реакционную массу охлаждали и выливали в смесь 50 мл конц. соляной кислоты и 50 г льда, тщательно перемешивали, суспензию фильтровали, осадок промывали последовательно конц. соляной кислотой, водой, горячим этиловым спиртом, высушивали под вакуумом. Получили 1.32 г октакис(хлорметил)фталоцианина титанила, который использовали далее без дополнительной очистки.

1.2. Октакис(пиридиниометил)фталоцианин титанила октахлорид. Смесь 0.75 г свежеприготовленного окта(хлорметил)фталоцианина титанила и 20 мл пиридина кипятили в течение 30 минут, осадок отфильтровывали, промывали ацетоном. После высушивания в вакуумном шкафу получили 1.15 г октакис(пиридиниометил)фталоцианина титанила октахлорида (92%). Этот комплекс, а также другие комплексы с катионными заместителями крайне гигроскопичны, вследствие чего удовлетворительные элементные анализы для них получены не были. ПМР(D₂O), δ, м.д.: 6.20 (16 ), 8.54 (48 H_Ar); /H_Ar= 1:3. ЭСП (H₂O), λ_макс, нм (ε · 10⁴): 695 (7.9).

Пример 2. 2,9,16,23-Тетракис(сульфофенокси)фталоцианин титанила тетранатриевая соль
2.1. 2,9,16,23-Тетрафеноксифталоцианин дихлортитана. Смесь 0.66 г 4-феноксифталонитрила [5] и 0.11 мл четыреххлористого титана нагревали 10 мин при 120^oC и 1 ч при 210 - 220^oC, плав измельчали, промывали горячим спиртом до обесцвечивания фильтрата, высушивали и после переосаждения из ДМФА водой хроматографировали на окиси алюминия бензолом. Получили 0.24 г (32%) 2,9,16,23- тетрафеноксифталоцианина дихлортитана. Найдено, %: N 11.59. C₅₆H₃₂Cl₂N₈O₄Ti. Вычислено, %: N 11.21.

2.2. 2,9,16,23-Тетракис(сульфофенокси)фталоцианин титанила тетранатриевая соль. В 50 мл конц. серной кислоты растворяли при комнатной температуре 0.15 г 2,9,16,23-тетрафеноксифталоцианина дихлортитана, через 24 часа раствор выливали на 200 г смеси льда с водой, продукт высаливали насыщенным раствором хлорида натрия, отфильтровывали, промывали насыщенным раствором хлорида натрия до pH 6 - 7 и затем 80% спиртом для удаления следов хлорида натрия. После высушивания получили 0.11 г (58%) тетранатриевой соли 2,9,16,23-тетракис(сульфофенокси)фталоцианин титанила. По данным элементного анализа число сульфогрупп равно 3.5. Найдено, %: S 8.55. C₅₆H₃₂N₈Na_3.5O_15.5S_3.5Ti. Вычислено, %: S 8.62. ЭСП (H₂O), λ_макс, нм: 705 пл, 655.

Пример 3. Гептакис(пиридиниометил)-1.2-нафталоцианин титанила гептахлорид
3.1. 1,2-Нафталоцианин титанила. Смесь 1.42 г 1,2-дицианонафталина [6] и раствора тетрабутоксититана, полученного из 0.3 мл четыреххлористого титана и 3 мл бутанола, нагревают при 220-225^oC, плав измельчают, промывают горячими бутанолом, этанолом, ацетоном, переосаждают из концентрированной серной кислоты и получают 0.98 г (63%) 1,2-нафталоцианина титанила. Найдено, %: N 14.07. C₄₈H₂₄N₈OTi. Вычислено, %: N 14.43.

3.2. Гептакис(хлорметил)-1,2-нафталоцианин титанила. В смесь 5 г хлористого алюминия и 2 мл триэтиламина при комнатной температуре вносят 3 мл симмдихлордиметилового эфира и 0.25 г 1,2-нафталоцианина титанила, температуру повышают до 90^oC и нагревают при этой температуре в течение 2.5 ч. После охлаждения реакционную массу вносят в смесь 15 мл конц. соляной кислоты и 50 г льда, тщательно перемешивают, осадок отфильтровывают, промывают конц. соляной кислотой, водой, горячим спиртом и после высушивания получают 0.34 г (94%) гептакис(хлорметил)-1,2-нафталоцианина титанила. Найдено, %: Cl 22.76. C₅₅H₃₁Cl₇N₈OTi. Вычислено, %: Cl 22.24.

3.3. Гептакис(пиридиниометил)-1,2-нафталоцианин титанила гептахлорид. Суспензию 0.15 мг гептакис(хлорметил)-1,2- нафталоцианина титанила в 5 мл пиридина кипятят в течение 1 ч, осадок отфильтровывают, промывают ацетоном, высушивают и получают 0.13 г (60%) гептакис(пиридиниометил)-1,2-0 нафталоцианина титанила гептахлорида. ЭСП (H₂O), λ_макс, нм: 717.

Пример 4. Тетрасульфо-1.2-нафталоцианин титанила тетранатриевая соль
4.1. Тетрасулъфо-1,2-нафталоцианин титанила. К суспензии 0.16 г 1,2-нафталоцианина титанила в 5 мл трихлорбензола прикапывают 0.54 мл хлорсульфоновой кислоты и кипятят 3 ч, после чего осадок отфильтровывают горячим, промывают горячим бензолом, ацетоном, высушивают и получают 0.210 г (93%) сырого тетрасульфо-1,2-нафталоцианина титанила.

4.2. Тетрасульфо-1,2-нафталоцианин титанила тетранатриевая соль. Суспензию 0.20 г сырого тетрасульфо-1,2-нафталоцианина титанила и 45 мл 2% спиртовой гидроокиси натрия перемешивают 1 ч, осадок отфильтровывают, промывают этанолом, высушивают и с количественным выходом получают тетранатриевую соль тетрасульфо- 1,2-нафталоцианина титанила. По данным элементного анализа число сульфогрупп равно 3.5. Найдено, %: S 9.83. C₄₈H_20.5N₈Na_3.5O_11.5S_3.5Ti. Вычислено, %: S 9.90. Найдено, %: S 9.83. C₄₈H_20.5N₈Na_3.5O_11.5S_3.5Ti. Вычислено, %: S 9.90. ЭСП (H₂O), λ_макс, нм: 703.

Пример 5. Октакис(сульфофенил)тетрапиразинопорфиразин титанила октанатриевая соль
5.1. Октафенилтетрапиразинопорфиразин титанила. Раствор тетрабутоксититана, полученный из 2 мл бутанола и 0.17 мл четыреххлористого титана, и 1.41 г 1,2-дициано-4,5-дифенилпиразина [7] нагревают при 230^oC в течение 3 ч, плав промывают горячим бутанолом и этанолом до бесцветных фильтратов, остаток переосаждают из серной кислоты и получают 0.44 г (25 %) октафенилтетрапиразинопорфиразина титанила.

5.2. Октакис(сульфофенил)тетрапиразинопорфиразин титанила. К смеси 0.12 г октафенилтетрапиразинопорфиразина титанила в 1 мл трихлорбензола прикапывают 0.07 мл хлорсульфоновой кислоты, смесь перемешивают при кипении 0.5 ч, охлаждают до 100^oC, разбавляют 20 мл горячего толуола, осадок отфильтровывают и высушивают. Получают 0.186 г (~ 100%) хорошо растворимого в воде и спирте октакис(сульфофенил)пиразинопорфиразина титанила. Найдено, %: S 13.02. C₇₂H₄₀N₁₆O₂₅S₈Ti Вычислено, %: S 13.99.

5.3. Октакис(сульфофенил)тетрапиразинопорфиразин титанила октанатриевая соль.

К раствору 0.093 г окта(сульфофенил)пиразинопорфиразина титанила в 2 мл этанола приливают раствор 0.020 г гидроокиси натрия в 3 мл воды, осадок отфильтровывают, промывают этанолом, высушивают и получают 0.100 г (98%) октакис(сульфофенил)пиразинопорфиразина титанила октанатриевой соли. Найдено, %: N 10.80; S 12.31. C₇₂H₃₂N₁₆Na₈O₂₅S₈Ti. Вычислено, %: N 11.15; S 12.76. ЭСП (H₂O), λ_макс, нм: 750 пл, 660 пл. 635.

Пример 6. Октакис(пиридиниометилфенил)тетрапиразинопорфиразин титанила октахлорид
6.1. Октактакис(хлорметилфенил)тетрапиразинопорфиразин титанила. В смесь 5 г хлористого алюминия и 2 мл триэтиламина при комнатной температуре вносят 3 мл симмдихлордиметилового эфира и 0.25 г октафенилтетрапиразинопорфиразина титанила, температуру повышают до 90^oC и нагревают при этой температуре в течение 2.5 ч. После охлаждения реакционную массу вносят в смесь 15 мл конц. соляной кислоты и 50 г льда, тщательно перемешивают, осадок отфильтровывают, промывают конц. соляной кислотой, водой, горячим спиртом до бесцветных фильтратов и высушивают. Получают 0.31 г (94%) октакис(хлорметилфенил)тетрапиразинопорфиразина титанила. Найдено, %: Cl 18.04. C₈₀H₄₈Cl₈N₁₆OTi. Вычислено, %: Cl 17.94.

6.2. Октакис(пиридиниометилфенил)тетрапиразинопорфиразин титанила октахлорид. Суспензию 100 мг октакис(хлорметилфенил)тетрапиразинопорфиразина титанила в 5 мл пиридина кипятили в течение 1 ч, осадок отфильтровывали, промывали ацетоном, высушивали и получили 1.35 г (96%) октакис(пиридиниометилфенил)тетрапиразинопорфиразина титанила октахлорида. ЭСП (H₂O), λ_макс, нм: 740 пл, 680.

Пример 7. Октакис(дигидроксифосфинилметил)фталоцианин титанила
7.1. Октакис(диэтоксифосфинилметил)фталоцианин титанила. Добавляли 0.5 мл триэтилфосфита к 100 мг октакис(хлорметил)фталоцианина титанила и смесь нагревали при 150^oC в течение 3 ч, летучие продукты удаляли в вакууме, остаток дважды переосаждали из смеси бензола и хлороформа гексаном и получили 108 мг (59 %) октакис(диэтоксифосфинилметил)фталоцианин титанила. ЭСП (H₂O, pH > 7, λ_макс, нм: 700.

7.2. Октакис(дигидроксифосфинилметил)фталоцианин титанила. Смесь 50 мг октакис(диэтоксифосфинилметил)фталоцианина титанила, 1 мл этанола и 1 мл концентрированной бромистоводородной кислоты нагревали в течение часа, отгоняя при этом спирт и кислоту. Остаток промывали водой и переосаждали из разбавленного водного раствора гидроокиси натрия соляной кислотой. Продукт промывали водой, спиртом, высушивали и получили 17 мг (46%) октакис(дигидроксифосфинилметил)фталоцианин титанила. ЭСП (H₂O, pH > 7), λ_макс, нм: 728.

Проведенные исследования показали, что коэффициент экстинкции предлагаемых препаратов превышает 5 · 10⁴ л/(моль · см) в спектральном диапазоне 690-860 нм. Поглощение несенсибилизированных тканей в этом диапазоне существенно ниже.

Испытания в условиях ФДТ
Проведено 5 групп опытов на белых беспородных мышах-самцах весом около 25 г с перевивной карциномой Эрлиха на правой лапе.

В первой группе для проведения ФДТ использовался стандартный препарат "Фотосенс" на основе сульфированного фталоцианина алюминия в дозе 1 мг/кг веса тела мыши.

Во второй группе использовался препарат "Фотосенс" в дозе 1 мг/кг веса тела мыши, с принудительным моделированием гипоксии перевязыванием правой лапы. Препарат вводился за 1 час и за 24 часа до ФДТ.

В третьей группе для проведения ФДТ использовался октакис(пиридиниометил)фталоцианин титанила октахлорид (pym- PcTiO) в дозе 1 мг/кг веса тела мыши.

В четвертой группе для проведения ФДТ использовался pym-PcTiO в дозе 1 мг/кг веса тела мыши, с принудительным моделированием гипоксии перевязыванием правой лапы. Препарат вводился за 1 час и за 24 часа до ФДТ.

Пятая группа - контрольная.

Препарат вводился животным системно (внутривенно) и местно. После этого через каждые шесть часов проводили измерения характеристик поглощения и флюоресценции (спектр, интенсивность) препаратов в тканях животных, определяя флюоресцентным методом концентрацию накопившихся в опухоли препаратов и контраст их накопления в опухоли по сравнению со здоровыми тканями. Через 24 часа после введения достигалась терапевтическая концентрация препарата в опухоли и проводилась ФДТ с использованием перестраиваемого лазера на красителе, возбуждаемого лазером на парах меди. Мощность лазера на красителе составляла 100 мВт, площадь облучаемой поверхности опухоли 0.5 см², плотность мощности 200 мВт/см², доза облучения около 120 Дж/см², длина волны излучения составляла 671 нм при облучении животных первой и второй групп и 696 нм - при облучении животных третьей и четвертой групп.

Перед процедурой и во время ФДТ спектроскопическим способом контролировались также оксигенация тканей и крови в сосудах.

Накопление препаратов в опухолевых тканях превышает их накопление в здоровых тканях в 2-5 раза.

Результаты ФДТ контролировались по патоморфологическим признакам.

Результаты морфологического анализа тканей опухоли после ФДТ в зависимости от способа введения pym-PcTiO приведены в табл. 1.

Морфометрические результаты терапии с pym-PcTiO при системном введении, с ограничением кислорода (сравнение с "Фотосенсом") даны в табл. 2.

Глубина некроза составляла 5-7 мм у животных первой группы, 7-9 мм - у животных третьей и четвертой групп.

Исследования показали высокую эффективность ФДТ с использованием предлагаемых фотосенсибилизаторов на основе водорастворимых производных тетраазапорфириновых комплексов титанила, в том числе и на экспериментальных животных с принудительным моделированием гипоксии опухолей.

В серии с pym-PcTiO, облученной через 24 часа после введения, встречаются случаи практически полного исчезновения опухоли, где остатки опухолевой ткани подавлены молодой грануляционной тканью.

В серии с pym-PcTiO, облученной через 1 час после введения, встречаются случаи практически полного инкапсулирования опухоли, при этом в сериях с "Фотосенсом" подобных явлений не наблюдается. Анализ на токсичность показал, что предлагаемые препараты малоопасны для развития острого отравления.

Таким образом, предлагаемые водорастворимые производные тетраазапорфириновых комплексов титанила являются высокоэффективными препаратами-фотосенсибилизаторами с многофакторным воздействием на опухоль.

Источники информации, принятые во внимание при подготовке описания:
[1] R. Bonnett, Chem. Soc. Rev., 1995., vol. 24., p. 19.

[2] В. В. Соколов, Е.Ф. Странадко, Н.Н. Жаркова, Р.И. Якубовская, Е.В. Филоненко, Т.А. Астраханкина. Вопросы онкологии, 41, с. 134-138, 1995.

[3] Phthalocyanine compounds. Eds. F.H. Moser and A.L. Thomas, Reinhold Publ. Corp., New York, 1963.

[4] B.P. Block., E.G. Meloni. Inorg. Chem., 1965, vol. 4, p. 111.

[5] V.M. Derkacheva., E.A. Luk'yanets. Zh. Obshch. Khim., 1980, vol. 50, p. 2313.

[6] E.F. Bradbrook, R.P. Linstead. J.Chem.Soc., 1936, 1739.

[7] H. W. Rothkopf. , D. Wohrie., R. Muller., G. Kosmehl. Chem. Ber., 1975, vol. 108, p. 875.

Фотосенсибилизатор представляет собой водорастворимое производное тетраазапорфириновых комплексов титанила общей формулы R_nLТiO, где L - лиганд, представляющий собой производное тетраазапорфирина, выбранное из группы, включающей фталоцианин, нафталоцианин, тетрапиразинопорфиразин, R - придающий растворимость в воде гидрофильный заместитель, n = 3 - 10, число заместителей. Новые фотосенсибилизаторы обнаруживают высокую эффективность, оказывая многофакторное воздействие на глубокие опухолевые ткани и другие патологические новообразования в условиях гипоксии. 2 табл.

Фотосенсибилизатор для фотодинамической терапии злокачественных новообразований, отличающийся тем, что он представляет собой водорастворимое производное тетраазапорфириновых комплексов титанила общей формулы
R_nLTiO,
где L - лиганд, представляющий собой производное тетраазапорфирина, выбранное из группы, включающей фталоцианин, нафталоцианин, тетрапиразинопорфиразин;
R - придающий растворимость в воде гидрофильный заместитель, например HO₃S-, NaO₃S, HO₂C, NaO₂C, (HO)₂(O)P-, (HO)₂(O)PCH₂-,


n = 3 - 10, число заместителей.