СПОСОБЫ И НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ МЕТОДАМИ ПЦР И РНК-ПЦР Российский патент 2001 года по МПК C12N15/10 A61K39/12 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансфузиологии, гематологии и эпидемиологии, и может применяться для прямого генотестирования и генодиагностики с целью выявления носителей инфекционных агентов (бактерий и вирусов) или определения деталей структуры генов (генотипирования), имеющего медицинское или иное значение.

Генодиагностические методы исследования обладают высокой чувствительностью и специфичностью, а также возможностью автоматизации их исполнения.

Известен способ подготовки биологического материала для ДНК-ПЦР амплификационной диагностики путем лизиса биологического материала, многократной экстракции водонасыщенным фенолом или смесью фенол-хлороформ и осаждения ДНК этанолом в присутствии ацетата натрия (Мазин А.В. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990, с. 13-14; Chomczynski P., Sacchi N. Analytical Biochemistry 1987, v.162, p. 156-159).

Известен также способ выделения вирусной ДНК из сыворотки крови путем лизиса биологического материала 6М NaI и N-лаурилсаркозинатом и осаждения ДНК изопропанолом (Masaki Ishizawa et al. Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucleic Acids Research 1991, vol. l9, N 20, p. 5792.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ подготовки биологического материала для ПЦР-генамплификационной диагностики путем лизиса биопробы и осаждения изопропанолом вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК (патент RU 21348771, 01.12.98).

Данный метод не позволяет полностью исключить потери исходных ДНК и РНК и концентрировать в достаточной мере бактерии и вирусы.

Впервые предлагается сочетанное использование универсальной технологии подготовки проб биоматериала для ПЦР-генотестирования методом однопробирочного выделения ДНК и РНК с предварительным концентрированием вирусов и бактерий и удалением балластных веществ и ингибиторов вместе с надосадочной отбрасываемой фракцией после центрифугирования, что позволяет повысить специфичность и чувствительность этой методики. Для минимизации рибонуклеазного разрушения определяемой РНК предлагается исключить присутствие РНК в воде или в водном буфере, как это имеет место во всех известных методах выделения РНК.

Поставленная цель достигается тем, что бактерии, клетки или вирусы освобождают от балластных веществ еще до лизиса, получают их осадок, лизируют этот осадок клеток и вирусов, затем осаждают из лизата изопропанолом все ДНК и РНК, содержавшиеся в биопробе. Полученный осадок суммы ДНК и РНК обрабатывают обратной транскриптазой в буфере, содержащем трифосфаты и антисмысловые праймеры к определяемым РНК. При этом без изоляции РНК поучают смесь всех содержащихся в биопробе ДНК и ДНК-копий (кДНК) ПЦР-тестируемых РНК, которая далее вводится в ПЦР-анализы.

Предложенный метод получения суммы ДНК и кДНК биопробы без изоляции РНК применим для сухих осадков, полученных при спиртовом осаждении в любом методе изоляции РНК и ДНК, в частности, после упомянутой фенольной депротеинизации (см. также пример 7). Более того, предлагаемая технология получения суммы ДНК и кДНК биопробы позволяет не только обнаруживать РНК-геномы вирусов, но и многократно повысить чувствительность обнаружения бактериальных возбудителей, обычно определяемых с помощью более простой ПЦР на ДНК. Это возможно при использовании в качестве мишени РНК, присутствующей в клетке в виде большого числа копий, например, рибосомальной РНК. Пример 7 демонстрирует такое повышение чувствительности на 2-3 порядка при генодиагностике сифилиса.

Для лизиса клеток и вирусов в нашем первоначальном варианте предлагаемой технологии приготовления проб для ПЦР-анализа (патент RU 21348771, 01.12.98, набор реагентов по ТУ 9398-423-47621883-00) предлагалась инкубация биоматериала при 60^oC в растворе, имеющем состав: 26 мМ трис-HCl pH 8,0, до 13 мМ ЭДТА, 6 М йодистый натрий, 0,5% N-лаурилсаркозинат натрия и 20 мкг/мл гликоген. Однако лизирующий раствор в качестве высокоионного спирторастворимого денатурирующего агента может содержать как йодистый натрий (70-90% по массе) так и гуанидинтиоцианат (50-75% по массе), хелатирующий агент (ЭДТА) до 20 мМ, детергент как ионный (N-лаурилсаркозинат натрия до 0,5%) или неионный (тритон X-100 до 1%). Концентрация буфера трис-HCl может быть до 50 мМ, а величина pH в пределах 6,8-7,5 является оптимальной как для ДНК, так и для РНК. Соосадителями определяемых ДНК и РНК могут быть гликоген до 100 мкг/мл и РНК-носитель до 10 мкг/мл). Применение в качестве денатурирующего агента гуанидинтиоцианата наиболее благоприятно при анализе вирусных и клеточных РНК. Выход РНК при этом сопоставим с более трудоемким обычным методом фенольной депротеинизации с высаживанием, а в случае использования иодида натрия выход РНК несколько ниже, что показано далее на примере детекции рибосомальной РНК бледной трепонемы (пример 7). В качестве осадителя ДНК и РНК используется изопропанол, а для промывки осадка - легко удаляемый высушиванием ацетон, содержащий немного воды - до 10% по объему. Последнее обеспечивает лучшее удаление из осадка ДНК и РНК плохо растворимых в чистом ацетоне ЭДТА и детергентов из состава лизирующего раствора.

Приготовленные таким образом препараты суммарной ДНК и кДНК пригодны для всех ПЦР-анализов, практически значимых в настоящее время: обнаружения инфекционных агентов (вирусов и бактерий) и выявления деталей структуры генов (точечных нуклеотидных замен, определяющих типы антигенов лейкоцитов и тромбоцитов, субтипы вирусов; хромосомных транслокаций при онкодиагностике и других деталей). Естественно, вполне возможным является ПЦР-анализ ДНК и РНК (в виде кДНК) нескольких возбудителей в одной пробе и ПЦР-контроль эффективности выделения РНК и обратной транскрипции с использованием РНК- или ДНК-маркеров, специально вводимых в пробу до выделения или содержащихся в присутствующих в биоматериале клетках организма-хозяина (P.Simmonds. Materials of WHO SoGAT 9^th meeting. Rome, 1999, p. 2).

Для проведения непосредственно ПЦР формируют реакционную смесь путем смешения препарата ДНК с другими компонентами, обеспечивающими амплификацию участка генома. Последние во всех современных генамплификационных системах (таких как системы серии Amplicor фирмы Roche, серии Inno-LiPA фирмы Innogenetic-Abbot, и в ряде других тест-систем) скомбинированы в двух или более реагентах для ПЦР. Состав этих реагентов определяется возможностью их хранения, удобством исполнения анализа и исключением нежелательных взаимодействий до начала ПЦР. В предлагаемом нами способе такими реагентами являются (1) двукратный буфер с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ), общий для всех ПЦР-анализов, и (2) амплификационный реагент, специфичный для каждого типа анализов, содержащий дезоксинуклеозид-трифосфаты, праймеры, фрагмент ДНК внутреннего стандарта (когда это необходимо), ЭДТА (для нейтрализации части ионов магния из состава 2хБФ, когда это необходимо), лидирующий краситель для электрофоретического анализа продуктов ПЦР и, возможно, другие компоненты. Реакционная смесь для однократной ПЦР или для каждого из двух раундов амплификации при двукратной (гнездовой) ПЦР формируется путем смешения 2хБФ, амплификационного реагента и препарата суммарной ДНК из биопробы.

Преимуществами предлагаемой схемы формирования реакционной смеси для ПЦР являются:
1) минимально возможное число реагентов для ПЦР (два), один из которых, кроме того, является универсальным для всех анализов;
2) возможность повышения специфичности ПЦР с помощью "горячего старта" - начала амплификации строго при высоких температурах, достигаемого как с помощью расплавляемой перегородки типа "AmpliWax" фирмы Perkin Elmer Cetus (в данном случае эта перегородка разделяет амплификационный реагент и смесь 2хБФ с препаратом ДНК), так и с помощью термоактивируемой ДНК-полимеразы типа AmpliTaq Gold фирмы Perkin Elmer Cetus или аналогичной в составе 2хБФ;
3) стабильность универсального реагента 2хБФ, который хранится в течение пяти месяцев и более при комнатной температуре, а также выдерживает многократные заморозки и оттаивания;
4) возможность стабилизации также и амплификационных реагентов, достигаемой двумя способами: (а) введением в их состав консерванта азида натрия, широко используемого в системах серии Amplicor фирмы Roche, либо других подходящих консервантов, и (б) высушиванием этих реагентов в пробирках для ПЦР в присутствии загустителей-фиксаторов (трегалозы, глицерина) и созданием тем самым аналогов "сухих" ПЦР-систем, упрощенных в сравнении с описанными в литературе (C.Wolffet al. Single tube nested PCR with room-temperature stable reagents. - PCR Methods and Applications, 1995, v. 4, p. 376-379) присутствием фермента Taq-полимеразы в жидком реагенте 2хБФ, а не в сухой смеси.

Следует отметить, что приведенный ниже пример 6 показывает, что предлагаемые реагенты для ПЦР-анализа по крайней мере ДНК (как буфер 2хБФ, так и амплификационные реагенты) на самом деле стабильны при комнатной температуре и в замороженном виде в течение пяти месяцев и более даже без указанных консервантов и специальных мер. Это вполне может сильно упростить практическое использование и транспортировку тест-систем ПЦР, включая их пересылку по почте. Было также замечено, что многократные заморозки и оттаивания могут ухудшить качество амплификационных реагентов, но не буфера 2хБФ.

В качестве ДНК внутреннего стандарта, входящей в состав амплификационных реагентов, в данной универсальной технологии предлагается использовать конструкции, полученные путем замены не менее чем 30-звенного фрагмента последовательности между праймерами ПЦР или между внутренними праймерами при двукратной гнездовой ПЦР на более длинный. Такая замена позволяет применять для раздельной детекции в одной смеси продуктов ПЦР на фрагменте генома возбудителя и на внутреннем стандарте как гель-электрофорез, так и гибридизационный анализ любого типа. Внутренний стандарт может представлять собой как продукт ПЦР, так и конструкцию типа клона в составе любого вектора.

Предлагаемый способ ПЦР-генотестирования в целом осуществляется следующим образом.

Биологический материал типа малоконцентрированной суспензии клеток в слабосолевом буфере (плазма крови, моча, ликвор, суспензия лейкоцитов или клеток соскоба в физиологическом растворе) вносят в пробирку типа "Эппендорф" в объеме до 1,5 мл и проводят освобождение клеток от балластных веществ центрифугированием в течение 5 минут при 14000 об/мин, удаляют надосадочный слой, оставляя над осадком 2-3 мкл жидкости. Для аналогичного концентрирования вирусов проводят ультрацентрифугирование в соответствующей пробирке при ускорении не менее 30000 g и аккуратно удаляют жидкую фазу, оставляя над осадком до 100 мкл придонного слоя. Осадок клеток или суспензию объемом до 100 мкл смешивают с 300 мкл лизирующего раствора и инкубируют смесь 15 минут при 60^oC. В случае цельной крови вначале проводят отделение эритроцитов осмотическим лизисом и получают осадок лейкоцитов или же сразу смешивают до 100 мкл крови или гематокрита с 300 мкл лизирующего раствора, поскольку выделение суммы ДНК и РНК из таких биопроб возможно для однопробирочного метода (патент RU 21348771, ТУ 9398-423-47621883-00).

Полученный лизат, как правило, прозрачен, но если это не так, то его центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин и затем удаляют собравшуюся на поверхности взвесь или плотный слой. К прозрачному лизату для осаждения суммы ДНК и РНК добавляют 400 мкл осадителя (изопропанола), смесь выдерживают 10 минут при комнатной температуре и центрифугируют 10 минут при 14000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, оставляя слой 2-3 мкл, и промывают осадок НК, а также стенки пробирки, 400 мкл промывателя (смеси ацетона и воды 9:1) по объему. Далее осадок центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость, оставляя 2-3 мкл, и высушивают осадок на воздухе. При необходимости осадок НК с остатками промывателя можно хранить в пробирке с закрытой крышкой при -20^oC в течение месяца.

Для дальнейшей обработки сухого осадка готовят смесь для обратной транскрипции путем смешения соответствующего реагента RTB-xx (буфер для обратной транскрипции, содержащий трифосфаты и требуемые антисмысловые праймеры; хх - сокращенное обозначение возбудителя) и рабочего раствора обратной транскриптазы MuLV (реагент RT). Состав этих реагентов отвечает условиям проведения обратной транскрипции и хранения фермента, но его особенностью является то, что необходимый для работы обратной транскриптазы MuLV дитиотреитол вводится в состав не замерзающего при -20^oC реагента RT. Это позволяет избежать потерь дитиотреитола из-за побочных процессов при заморозках-оттаиваниях, вызывающих появление осадка в слабощелочном (pH 8,3) реагенте RTB-хх, если он содержит дитиотреитол. Смесь RTB-xx и RT вносят по 20-30 мкл в пробирки с сухими осадками РНК+ДНК и суспендируют осадки. Пробирки далее инкубируют 30 минут при 42^oC. Для дальнейшего анализа используют только жидкую фазу, для чего перед каждым отбором пробирки центрифугируют 1 минуту при 12000 об/мин. Этот раствор, представляющий собой сумму ДНК и кДНК биопробы, смешивается с 2хБФ и требуемым амплификационным реагентом, полученная смесь вводится в ПЦР. В тех случаях, когда анализируется только ДНК, обработку обратной транскриптазой не проводят, а сухой осадок растворяют в слабосолевом буфере, например 10 мМ трис-HCl pH 8.

Примеры использования универсальной технологии.

На основе изложенных общих принципов проведения обработки биологического материала и проведения ПЦР-анализа готовятся наборы рабочих реагентов, с помощью которых проводятся анализы.

Пример 1. Набор реагентов для получения суммы ДНК и РНК биопробы. Этот набор, аналогично его ближайшему аналогу и предыдущему варианту - набору "ГенТест-РНК/ДНК-экстракция" (патент RU 21348771, 01.12.98, ТУ 9398-423-47621883-00) предназначен для получения из биологического материала суммы РНК+ДНК в виде сухого осадка и включает три компонента: лизирующий раствор, осадитель и промыватель. Отличием нового варианта является введение в промыватель (ацетон) воды в количестве 10% по объему (улучшает промывку осадка, не замедляя его высушивание), и возможная модификация состава лизирующего раствора (см. пример 7).

Пример 2. Выделение ДНК из цельной крови и типирование антигенов лейкоцитов и тромбоцитов двух доноров.

Для выделения ДНК из цельной крови применен лизирующий раствор с иодидом натрия, позволяющий эффективно удалять из лизата балластные вещества в виде плотного слоя, собирающегося на поверхности при центрифугировании перед изопропанольным осаждением. Осадок растворен в 10 мМ трис-HCl pH 8, полученный раствор введен в ПЦР в системе INNO-LiPA DRB key (Innogenetic-Abbot, контроль ПЦР в этой системе приведен на фиг. 1) с последующей гибридизацией на двух стрипах ("широкое" типирование лейкоцитов по локусу DRB) и в аллель-специфичную ПЦР для типирования тромбоцитов по антигенам 2, 3 и 4 (Shigenori Tanaka et al. Simultaneous DNA typing of human platelet antigens 2, 3 and 4 by an allele-specific PCR method. - Vox Sanguinis 1995, v. 68, p. 225-230), см. фиг. 2.

Результат гибридизации полученных продуктов ПЦР на стрипах и компьютерной обработки данных (INNO-LiPA identification program v4.0) приведен в конце текста.

Пример 3. Набор реагентов для определения РНК гепатита C методом двукратной РНК-ПЦР.

Данный набор предназначен для ПЦР-определения РНК вируса гепатита C в сухом осадке, полученном из плазмы крови или другого биоматериала однопробирочным методом с помощью набора, указанного в примере 1. Возможно применение данного набора также и для сухого осадка, полученного другим методом (например, фенольной депротеинизации) или для анализа растворенной РНК. Анализ с помощью данного набора включает проведение обратной транскрипции РНК и последующую двукратную гнездовую ПЦР в присутствии минимального количества ДНК внутреннего стандарта - 10 молекул на пробу. ПЦР-амплификация проводится на консервативном нетранслируемом 5'-концевом участке РНК вируса гепатита C, используемые праймеры для обратной транскрипции, первой и второй ПЦР имеют длину от 19 до 22 звеньев, отвечают критериям ПЦР и могут работать на всех известных субтипах вируса гепатита С. ДНК внутреннего стандарта представляет собой продукт ПЦР (амплификон) длиной 550 н.п. и состоит из следующих участков: промотор РНК-полимеразы Т7 (18 звеньев, это необязательный участок, позволяющий получать РНК-копию этого стандарта), далее 153-звенный фрагмент ДНК-копии вирусной РНК (звенья 16-168 по нумерации HPCCGAA, EMBL accession М67463), следующие 32 звена этой копии заменены на 128-звенный фрагмент (может быть любой последовательности, использован участок гена LacZ, входящего в состав многих векторов для клонирования), далее продолжение ДНК-копии вирусной РНК (звенья 200-361 по нумерации HPCCGAA, EMBL accession М67463). Данный внутренний стандарт был получен методом направленного соединения фрагментов ДНК путем ПЦР (Horton R.M., Hunt H.D., Но S.N., Pullen J. R. and Pease L.R. - Gene 1989, v. 77, p. 61-68; Yolov A.A. and Shabarova Z.A. Nucl. Acids Res. 1990, v. 18, N 13, p. 3983-3987).

В состав набора входят следующие компоненты:
1. Реагент для обратной транскрипции (RTB HC), 1000 мкл на 100 проб: буфер 140 мМ трис-HCl pH 8,3, 40 мМ сульфата аммония, 0,04% бычьего сывороточного альбумина, 6 мМ хлористого магния, по 0,7 мМ каждого из 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, антисмысловой праймер для обратной транскрипции (может совпадать с одним из праймеров первой ПЦР) в количестве 0,2 пмоль на пробу.

2. Рабочий раствор обратной транскриптазы (RT), 105 мкл на 100 проб: буфер 50 мМ трис-HCl pH 7,5, 20 мМ хлористый натрий, 100 мМ дитиотреитол, 0,1% тритон X-100, 0,5 мМ ЭДТА, 50 объемных % глицерина, обратная транскриптаза M-MLV (фирма Promega, США, кат. N М 1701) в количестве 400-600 единиц на 100 проб. При необходимости работать в условиях высокого рибонуклеазного фона в состав реагента RT может быть введен ингибитор рибонуклеаз RNAsin (фирма Promega, США, кат. N 2515) в количестве до 2000 единиц на 100 проб.

3. Двукратный буфер для ПЦР с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ), 2000 мкл на 100 проб: буфер 140 мМ трис-HCl pH 8,3, 40 мМ сульфата аммония, 0,04% бычьего сывороточного альбумина, 6 мМ хлористого магния, 100 ед/мл ДНК-полимеразы BioTaq (ПКЗАО "Диалат", Россия, или аналогичного препарата Taq-полимеразы). Это универсальный реагент для всех ПЦР-анализов.

4. Реагент для 1-й ПЦР (a1-HC), 1000 мкл на 100 проб: по 250 мкМ каждого из 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, по 5-10 пмоль каждого из двух внешних праймера на пробу и 10 молекул ДНК внутреннего стандарта на пробу.

5. Реагент для 2-й ПЦР (а2-HC), 1000 мкл на 100 проб: по 250 мкМ каждого из 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, по 5-10 пмоль каждого из двух внутренних праймера на пробу и до 0,04% бромфенолового синего.

6. Вода для ПЦР, 2,5 мл на 100 проб: обычная дистиллированная вода (ГОСТ 6709-72).

7. Масло для ПЦР, 4,5 мл на 100 проб: масло вазелиновое (ГОСТ 3164-75), отмытое дистиллированной водой.

8. Положительный контроль (HC+) - раствор любой РНК в слабосолевом буфере, содержащей амплифицируемый с помощью данного набора участок.

Особенности состава реагентов и методика анализа.

При смешивании 10 мкл RTB HC, 1 мкл RT и 10 мкл воды формируется смесь, в которой может работать обратная транскриптаза. Именно такая смесь добавляется к сухому осадку РНК/ДНК. При этом одновременно с растворением РНК происходит синтез ее ДНК-копии (кДНК), а ДНК просто растворяется. При анализе растворенной ДНК вместо воды добавляется 10 мкл раствора РНК в воде или слабосолевом буфере. Для первой ПЦР смешивают 10 мкл а1-HC, 10 мкл 2хБФ и 1-10 мкл раствора суммы ДНК и кДНК после обратной транскрипции. Возможность введения в ПЦР различных объемов этого раствора обусловлена совпадением солевых составов RTB HC и 2хБФ. Более того, использование буфера для обратной транскрипции, рекомендованного фирмой "Promega" (содержит хлористый калий вместо сульфата аммония и меньшую концентрацию трис-буфера) вполне допустимо. Возможна также модификация состава 2хБФ с учетом особенностей используемого препарата Taq-полимеразы. Условия первой ПЦР: 3 мин при 94^oC, далее 35 циклов 92^oC 30 сек, 55^oC 30 сек, 72^oC 30 сек; в конце 3 мин при 72^oC. Для второй ПЦР смешивают по 10 мкл а2-HC и 2хБФ, к этой смеси добавляют 1,5 мкл раствора после первой ПЦР. Условия второй ПЦР: 15 циклов 92^oC 30 сек, 60^oC 30 сек, 72^oC 30 сек; в конце 3 мин при 72^oC. Присутствие в а2-HC бромфенолового синего, не мешающего ПЦР, позволяет наносить раствор после второй ПЦР прямо на гель для анализа продуктов. Длина этих продуктов определяется праймерами второй ПЦР и составляет в действующем варианте этого набора 258 н.п. для вируса гепатита C и 354 н.п. для внутреннего стандарта. Пример анализа с помощью этого набора приведен на фиг. 3. Наличие сигнала HCV в положительном контроле 15 и его отсутствие в отрицательном контроле 14 при наличии в них сигнала стандарта свидетельствует о нормальной работе системы. Наличие в пробах доноров 1, 3, 5, 6, 10, 11, 12 и 13 только сигнала стандарта говорит об отсутствии в их крови вируса. В то же время сигнал HCV обнаруживается у доноров 2, 4, 7, 8 и 9.

Пример 4. Набор реагентов для определения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) методом двукратной РНК-ПЦР.

Набор реагентов по своему составу, принципу действия и методике анализа полностью аналогичен набору из примера 3. Анализ с помощью данного набора включает проведение обратной транскрипции РНК и последующую двукратную гнездовую ПЦР в присутствии минимального количества ДНК внутреннего стандарта - 10 молекул на пробу. ПЦР-амплификация проводится на консервативном участке гена pol ВИЧ, используемые праймеры для обратной транскрипции, первой и второй ПЦР имеют длину от 19 до 22 звеньев, отвечают критериям ПЦР и могут работать на ВИЧ-1 и ВИЧ-2, что является некоторой гарантией устойчивого обнаружения с помощью данного набора быстро мутирующего ВИЧ. Структура и метод получения ДНК внутреннего контроля опубликованы ранее (Yolov А.А. et al. Virus genes, 1995, v. 10, p. 45-51)
В состав набора входят компоненты, аналогичные таковым из примера 3:
1. Реагент для обратной транскрипции (RTB HI), 1000 мкл на 100 проб. Отличается только антисмысловым праймером.

2. Рабочий раствор обратной транскриптазы (RT), 105 мкл на 100 проб: тот же, что и для гепатита C.

3. Двукратный буфер для ПЦР с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ), 2000 мкл на 100 проб: тот же универсальный реагент для всех ПЦР-анализов.

4. Реагент для 1-й ПЦР (а1-HI), 1000 мкл на 100 проб: по 250 мкМ каждого из 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, по 5-10 пмоль каждого из двух внешних праймера на пробу и 10 молекул ДНК внутреннего стандарта на пробу.

5. Реагент для 2-й ПЦР (а2-HI), 1000 мкл на 100 проб: по 250 мкМ каждого из 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, по 5-10 пмоль каждого из двух внутренних праймера на пробу и до 0,04% бромфенолового синего.

6. Вода для ПЦР, 2,5 мл на 100 проб: обычная дистиллированная вода (ГОСТ 6709-72).

7. Масло для ПЦР, 4,5 мл на 100 проб: масло вазелиновое (ГОСТ 3164-75), отмытое дистиллированной водой.

8. Положительный контроль (HI+) - раствор любой РНК в слабосолевом буфере, содержащей амплифицируемый с помощью данного набора участок.

Особенности состава реагентов, методика анализа и условия ПЦР те же, что и в примере 3. Длина продуктов ПЦР определяется праймерами второй ПЦР и составляет в действующем варианте этого набора 288 н.п. для ВИЧ и 368 н.п. для внутреннего стандарта. На приведенной на фиг. 4 электрофореграмме наличие сигнала ВИЧ в положительном контроле 8 и его отсутствие в отрицательных контролях 7 и 9 при наличии в них сигнала стандарта свидетельствует о нормальной работе системы. Наличие в пробах пациентов 2, 4 и 6 только сигнала стандарта говорит об отсутствии у них вируса. В то же время сигнал ВИЧ обнаруживается у пациентов 1, 3 и 5.

Пример 5. Набор реагентов для определения ДНК вируса гепатита B методом ПЦР.

Данный набор предназначен для определения ДНК гепатита B в сухом осадке, полученном с помощью набора из примера 1, растворенном в слабосолевом буфере (например, 10 мМ трис-соляная кислота pH 7,5-8) либо в смеси после обратной транскрипции из примеров 3 и 4. Возможно также определение ДНК гепатита B в препарате, полученном простым щелочным лизисом сыворотки крови (G.Lucotte et al. Molecular and cellular probes 1994, v. 8, p. 437-440). Анализ с помощью данного набора включает проведение ПЦР в присутствии ДНК внутреннего стандарта в количестве 100 молекул на пробу. ПЦР-амплификация проводится на консервативном участке гена кор-белка вируса гепатита B, используемые праймеры имеют длину от 19 до 22 звеньев, отвечают критериям ПЦР и могут работать на всех известных субтипах вируса гепатита B. ДНК внутреннего стандарта представляет собой продукт ПЦР (амплификон) длиной 383 н.п. и состоит из следующих участков: 112-звенный фрагмент вирусной ДНК (звенья 1891-2002 по нумерации HPBADW2, EMBL accession D00330), следующие 30 звеньев этой копии заменены на 105-звенный фрагмент (может быть любой последовательности, использован участок гена LacZ, входящего в состав многих векторов для клонирования), далее продолжение последовательности ДНК вируса гепатита B (звенья 2032-2199 по нумерации HPBADW2, EMBL accession D00330). Данный внутренний стандарт был получен методом направленного соединения фрагментов ДНК путем ПЦР (Horton R. M. , Hunt H.D., Но S.N., Pullen J.K. and Pease L.R. - Gene 1989, v. 77, p. 61-68; Yolov A.A. and Shabarova Z.A. Nucl. Acids Res. 1990, v. 18, N 13, p. 3983-3987).

В состав набора входят следующие компоненты:
1. 10-кратный буфер для растворения ДНК (10хРастворитель ДНК): 100 мМ трис-HCl pH 8, 210 мкл на 100 проб.

2. Двукратный буфер для ПЦР с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ), 1000 мкл на 100 проб: тот же универсальный реагент для всех ПЦР-анализов.

3. Амплификационный реагент (аНВ), 500 мкл на 100 проб: по 750 мкМ каждого из 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, по 5-10 пмоль каждого из двух праймеров на пробу, 100 молекул ДНК внутреннего стандарта на пробу и до 0.08% бромфенолового синего.

4. Вода для ПЦР.

5. Масло для ПЦР.

6. Положительный контроль (HB+) - раствор любой ДНК в слабосолевом буфере, содержащей амплифицируемый с помощью данного набора участок.

Для формирования реакционной смеси ПЦР смешивают 10 мкл 2хБФ, 5 мкл аНВ и 5 мкл препарата ДНК в виде раствора. Условия ПЦР: 3 мин при 94^oC, далее 35 циклов 92^oC 30 сек, 55^oC 30 сек, 72^oC 30 сек; в конце 3 мин при 72^oC. Далее окрашенный раствор наносится на гель для электрофореза. Для действующего варианта набора реагентов сигнал вируса гепатита B проявляется в виде фрагмента длиной 215 н.п., сигнал внутреннего стандарта - 290 н.п. На электрофореграмме (фиг. 5) приведен анализ серии разведений сыворотки крови носителя вируса гепатита B неинфицированной сывороткой.

Пример 6. Устойчивость реагентов для ПЦР при хранении при комнатной (18-25^oC) температуре.

Специальный опыт был проведен для 2хБФ и реагента аНВ (см. пример 5). Растворы этих двух реагентов были разделены на 3 порции. Одна пара реагентов хранилась при -20^oC как обычно, вторая и третья хранилась при комнатной температуре, но в третью пару, в отличие от второй, был добавлен консервант (азид натрия) в количестве 0,5% в 2хБФ и в aHB. Через 35, 66 и 150 суток такого хранения были проведены ПЦР на положительном контроле HB+ и отрицательном контроле (фиг. 6).

Из полученных данных видно, что рассматриваемые реагенты для ПЦР-анализа надежно хранятся при комнатной температуре в течение пяти месяцев. По этой причине не удается заметить влияние консерванта азида натрия, который, как следует из тех же данных, не мешает ПЦР в используемых концентрациях.

Пример 7. Набор реагентов для определения ДНК Treponema pallidum методом ПЦР и использование РНК-ПЦР на 16S рибосомальной РНК для увеличения чувствительности генодиагностики сифилиса.

Данный набор предназначен для определения ДНК бледной трепонемы в сухом осадке, полученном с помощью набора из примера 1, растворенном в слабосолевом буфере (например, 10 мМ трис-соляная кислота pH 7,5-8). Анализ с помощью данного набора включает проведение ПЦР в присутствии ДНК внутреннего стандарта в количестве 100 молекул на пробу. ПЦР-амплификация проводится на фрагменте гена 16S рибосомальной РНК, используемые праймеры имеют длину от 19 до 22 звеньев, отвечают критериям ПЦР и могут работать только на ДНК инфекционного штамма Treponema pallidum. ДНК внутреннего стандарта представляет собой 451-звенный продукт ПЦР и состоит из следующих участков: 313-звенный фрагмент ДНК-копии 16S рибосомальной РНК Treponema pallidum (звенья 207-520 по нумерации TPSEQA, EMBL accession М88726), следующие 29 звеньев этой копии заменены на 116-звенный фрагмент (может быть любой последовательности, использован участок гена LacZ, входящего в состав многих векторов для клонирования), далее продолжение последовательности ДНК-копии той же рибосомальной РНК (звенья 550-570 по нумерации TPSEQA, EMBL accession M88726). Данный внутренний стандарт был получен методом направленного соединения фрагментов ДНК путем ПЦР (Horton R.M., Hunt H.D., Но S.N., Pullen J.K. and Pease L.R. - Gene 1989, v. 77, p. 61-68; Yolov A.A. and Shabarova Z.A. Nucl. Acids Res. 1990, v. 18. N 13, p. 3983-3987).

1. 10-кратный буфер для растворения ДНК (10хРастворитель ДНК): 100 мМ трис-HCl pH 8, 210 мкл на 100 проб.

2. Двукратный буфер для ПЦР с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ), 1000 мкл на 100 проб: тот же универсальный реагент для всех ПЦР-анализов.

3. Амплификационный реагент (aTR), 500 мкл на 100 проб: по 750 мкМ каждого из 4-х дезоксинуклеозидтрифосфатов, по 5-10 пмоль каждого из двух праймеров на пробу, 100 молекул ДНК внутреннего стандарта на пробу и до 0,08% бромфенолового синего.

4. Вода для ПЦР.

5. Масло для ПЦР.

6. Положительный контроль (ТР+) - раствор любой ДНК в слабосолевом буфере, содержащей амплифицируемый с помощью данного набора участок.

Для формирования реакционной смеси ПЦР смешивают 10 мкл 2хБФ, 5 мкл аНВ и 5 мкл препарата ДНК в виде раствора. При использовании "горячего старта" на дно пробирки для ПЦР помещают 15 мкл расплавленного парафина, далее помещают 5 мкл aTR на застывший парафин и последний вновь расплавляют. При этом синяя капля aTR опускается под парафин на дно. Затем поверх застывшего парафина помещают 2хБФ и раствор анализируемой ДНК. Далее пробирка помещается в темоциклер и при нагревании перед первым циклом ПЦР парафиновая прослойка расплавляется и происходит смешивание праймеров с ферментом и ДНК при температуре не ниже 70^oC. Условия ПЦР: 3 мин при 94^oC, далее 35 циклов 92^oC 30 сек, 55^oC 30 сек, 72^oC 30 сек; в конце 3 мин при 72^oC. Далее окрашенный раствор наносится на гель для электрофореза. Для действующего варианта набора реагентов сигнал трепонемы проявляется в виде фрагмента длиной 364 н.п., сигнал внутреннего стандарта - 451 н.п. На дорожках 1-3 электрофореграммы (фиг. 7) приведен результат анализа ДНК инфекционной трепонемы, полученной путем смыва со срезов пораженных яичек инфицированного кролика. Количество клеток трепонемы в смыве было подсчитано с помощью темно-польной микроскопии, а ДНК выделена однопробирочным методом с использованием набора реагентов из примера 1. Используемый лизирующий раствор содержал в качестве денатурирующего агента гуанидинтиоцианат.

Особенностью системы праймеров данного набора является то, что они могут работать не только на участке клеточной ДНК, но и на рибосомальной РНК. Необходимый для этого перевод РНК в кДНК проводится по той же методике одновременно с растворением сухого осадка, как и для вирусных РНК. Это позволяет поднять чувствительность определения бледной трепонемы (и соответственно генодиагностики сифилиса) на 2-3 порядка, так как в клетке содержится примерно 1000 рибосом. Такой эффект обратной транскрипции рибосомальной РНК как раз наблюдается при сравнении проб 1-3 и 4-6 на приведенной электрофореграмме.

Из следующей электрофореграммы (фиг. 8) видно, что при разбавлении раствора кДНК после обратной транскрипции сигналы трепонемы проявляются на фоне 100 молекул внутреннего стандарта даже тогда, когда на пробу приходится менее 1 клетки. Именно так и должно быть при ПЦР на многокопийной РНК.

Изобретение относится к медицине, в частности к трансфузиологии, гематологии и эпидемиологии, и может применяться для прямого генотестирования и генодиагностики. Способы и наборы обеспечивают высокую чувствительность и специфичность генотестирования и генодиагностики, а также позволяет автоматизировать их выполнение. Биологический материал центрифугируют для осаждения балластных веществ и затем лизируют осадок клеток и вирусов биологического материала, осаждают изопропанолом вирусные, бактериальные и клеточные ДНК и РНК, причем осажденные ДНК и РНК переводят из органической среды в сухой осадок, который обрабатывают обратной транскриптазой в буфере, содержащем трифосфаты и антисмысловые праймеры к определяемым РНК, получая при этом без изоляции РНК препарат суммарной ДНК и кДНК для ПЦР-анализов. ПЦР-анализ проводят смешиванием препарата ДНК с заранее приготовленными реагентами, в качестве которых используют двухкратный буфер с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ) и специфичный для каждого инфекционного агента или анализируемого гена амплификационный реагент, содержащий праймеры и трифосфаты. Наборы реагентов используют для диагностики гепатита В и С, ВИЧ-инфекции и сифилиса при возможности обнаружения нескольких инфекций в одной пробе. А также для получения ДНК и РНК. 8 с. и 4 з.п. ф-лы, 8 ил.

1. Способ получения ДНК и РНК из биологического материала для ПЦР-генотестирования и генамплификационной диагностики вирусных и бактериальных инфекций, включающий освобождение от балластных веществ центрифугированием, лизис осадка клеток и вирусов биологического материала, осаждение изопропанолом вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК, отличающийся тем, что осажденные ДНК и РНК переводят из органической среды в сухой осадок, который обрабатывают обратной транскриптазой в буфере, содержащем трифосфаты и антисмысловые праймеры к определяемым РНК, получая при этом без изоляции РНК препарат суммарной ДНК и кДНК для ПЦР-анализов. 2. Способ проведения ПЦР-анализа препарата по п.1 для генотестирования и генамплификационной диагностики вирусных и бактериальных инфекций, включающий смешивание препарата ДНК с заранее приготовленными реагентами для ПЦР, отличающийся тем, что с указанными реагентами смешиваются ДНК и кДНК, полученные по п. 1, а в качестве реагентов используют двукратный буфер с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ) и специфичный для каждого инфекционного агента или анализируемого гена амплификационный реагент, содержащий праймеры и трифосфаты. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что амплификационный реагент дополнительно содержит ДНК внутреннего контроля, сконструированную путем замены не менее чем 30-звенного фрагмента последовательности между праймерами ПЦР или между внутренними праймерами при двукратной гнездовой ПЦР на более длинный, так что такая замена позволяет применять для раздельной детекции в одной смеси продуктов ПЦР на фрагменте генома возбудителя и на внутреннем контроле как гельэлектрофорез, так и гибридизационный анализ любого типа. 4. Способ по пп.2 и 3, отличающийся тем, что для анализа используется препарат ДНК, полученный путем растворения сухого осадка по п.1 в слабосолевом буфере. 5. Способ по пп.2, 3 и 4, отличающийся тем, что ПЦР проводят с "горячим стартом", причем один из соединяемых при повышенной температуре реагентов представляет собой амплификационный реагент по п.2, а другой - смесь универсального буфера 2хБФ по п.2 и анализируемого препарата ДНК и кДНК. 6. Способ по п.1 и 2, отличающийся тем, что полученную по п.1 сумму ДНК и кДНК используют для диагностики гепатита В и С, ВИЧ-инфекции и сифилиса при возможности обнаружения нескольких инфекций в одной пробе. 7. Набор реагентов для выделения суммы ДНК и РНК биологического материала по п.1, отличающийся тем, что он содержит лизирующий раствор, имеющий в составе эффективные количества высокоионного спирторастворимого денатурирующего агента (иодистого натрия и/или гуанидинтиоцианата), трис-HCl буфера с pH 6,8 - 7,5, хелатирующего агента (ЭДТА), детергента ионного (N-лаурилсаркозината натрия) или неионного (тритон Х-100), и гликогена; осадитель: изопропанол; промыватель: ацетон, содержащий до 90% воды по объему. 8. Набор реагентов для обнаружения РНК вируса гепатита С в плазме крови или другом биологическом материале методом двукратной гнездовой РНК-ПЦР по пп.1, 2 и 3, либо в готовом растворе РНК в слабосолевом буфере, отличающийся тем, что имеет состав: (а) реагент для обратной транскрипции, содержащий оптимальный для обратной транскриптазы MuLV солевой буфер без дитиотрейтола, трифосфаты и антисмысловой праймер (RTB-HC); (б) рабочий раствор обратной транскриптазы MuLV в буфере для хранения этого фермента, содержащем дитиотрейтол (RT); (в) реагент для 1-й ПЦР (a1-HC), содержащий трифосфаты, внешние праймеры и ДНК внутреннего контроля по п.3 в количестве 10 молекул на пробу; (г) реагент для 2-й ПЦР (a2-HC), содержащий трифосфаты и внутренние праймеры, (д) двукратный буфер с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ); (е) вода для ПЦР; (ж) масло для ПЦР; (и) положительный контроль - раствор РНК, содержащей амплифицируемый при анализе участок. 9. Набор реагентов для обнаружения РНК вируса иммунодефицита человека методом двукратной гнездовой РНК-ПЦР в плазме крови или другом биоматериале по пп.1, 2 и 3, либо в готовом растворе РНК в слабосолевом буфере, отличающийся тем, что имеет состав: (а) реагент для обратной транскрипции, содержащий оптимальный для обратной транскриптазы MuLV солевой буфер без дитиотрейтола, трифосфаты и антисмысловой праймер (RTB-HI); (б) рабочий раствор обратной транскриптазы MuLV в буфере для хранения этого фермента (RT); (в) реагент для 1-й ПЦР (a1-HI), содержащий трифосфаты, внешние праймеры и ДНК внутреннего контроля по п.3 в количестве 10 молекул на пробу; (г) реагент для 2-й ПЦР (a2-HI), содержащий трифосфаты и внутренние праймеры, (д) двукратный буфер с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ); (е) вода для ПЦР; (ж) масло для ПЦР; (и) положительный контроль - раствор РНК, содержащей амплифицируемый при анализе участок. 10. Набор реагентов для обнаружения ДНК вируса гепатита В методом ПЦР по пп. 2, 3 и 4, отличающийся тем, что имеет состав: (а) 10-кратный буфер для растворения осадка ДНК, (б) амплификационный реагент (aHB), содержащий трифосфаты, праймеры и ДНК внутреннего контроля по п.3 в количестве 100 молекул на пробу; (в) двукратный буфер с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ); (г) воду для ПЦР; (д) масло для ПЦР; (е) положительный контроль - раствор ДНК вируса гепатита В или ее фрагмент, содержащий амплифицируемый при анализе участок. 11. Набор реагентов для обнаружения ДНК бледной трепонемы методом ПЦР по пп. 2 - 5, отличающийся тем, что имеет состав: (а) 10-кратный буфер для растворения осадка ДНК; (б) амплификационный реагент (аТР), содержащий трифосфаты, праймеры и ДНК внутреннего контроля по п.3 в количестве 100 молекул на пробу; (в) двукратный буфер с ферментом Taq-полимеразой (2хБФ); (г) воду для ПЦР; (д) парафин для ПЦР; (е) положительный контроль - раствор ДНК бледной трепонемы или ее фрагмент, содержащий амплифицируемый при анализе участок. 12. Способ обнаружения бактериальных возбудителей в биопробе, отличающийся тем, что биоматериал обрабатывают по п.1 с проведением обработки сухого осадка суммы ДНК и РНК обратной транскриптазой в соответствующем буфере, содержащем антисмысловой праймер к рибосомальной или другой многокопийной клеточной РНК, а полученный при этом раствор суммы ДНК и кДНК вводят в ПЦР с использованием праймеров к определяемой РНК.