СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ Российский патент 1999 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 

Описание патента на изобретение RU2134871C1

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии и вирусологии, и может применяться для выявления истинных вирусоносителей среди сероположительных лиц на основе прямого генотестирования этих вирусов.

В силу наличия серонегативного периода системы иммуноферментного анализа (ИФА) даже третьего поколения не может полностью гарантироваться отсутствие вирусов иммунодефицита человека, гепатитов B и C и других вирусов в донорской крови, поэтому существует настоятельная необходимость внедрения в практику здравоохранения генодиагностических методов исследования. Генодиагностические методы исследования отличают высокая специфичность и чувствительность, а также возможность их автоматизации. Наиболее широкое распространение во всем мире в последние годы получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Как известно, метод ПЦР включает в себя три основных этапа: выделение ДНК и РНК, собственно реакцию амплификации и визуализацию результатов реакции. В основе метода лежит многократное увеличение количества копий специфического участка ДНК или РНК инфекционного агента путем полимеразной достройки с помощью термофильного фермента Taq-полимеразы двух олигонуклеотидов-праймеров, ориентированных навстречу друг другу. В случае детекции РНК последняя предварительно переводится в ДНК путем обратной транскрипции (РТ). В свою очередь этап выделения ДНК и РНК состоит из следующих стадий: лизис биологического материала, экстракция или осаждение ДНК или РНК и получение очищенной ДНК или РНК.

Одна из основных проблем на пути внедрения метода генотестирования и связана с необходимостью ускорения и упрощения первой стадии анализа - выделением ДНК и РНК (НК) любого происхождения в пригодной для ПЦР форме. Эта проблема особенно актуальна для РНК-содержащих вирусов в связи с нестойкостью РНК из-за рибонуклеазного гидролиза.

Известен способ подготовки биологического материала для ДНК-ПЦР генамплификационной диагностики путем лизиса образца, многократной экстракции водонасыщенным фенолом или смесью фенол-хлороформ и осаждение ДНК этанолом в присутствии ацетата натрия (Мазин А.В. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990, c. 13-14).

Известен также способ выделения ДНК из биологического материала путем лизиса образца раствором гуанидинтиоционата, содержащим ЭДТА и Triton X-100, после чего проводят сорбцию ДНК из раствора на сорбенте. Сорбент отмывают последовательно раствором гуанидинтиоционата, 70%-ным этанолом и ацетоном и затем проводят элюцию ДНК с сорбента ТЕ-буфером (Boom R., Sol C. J. A et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. J. Clin. Microbiol., 1990, v.28, N 3, p.495-503).

Однако данные методы в одном случае не позволяют добиться необходимой степени очистки целевой ДНК от многих присутствующих в образцах примесей - ингибиторов ПЦР, a в другом случае провести эффективный лизис биологических образцов, содержащих плотныe ткани.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ подготовки биологического материала для ДНК-ПЦР генамплификационного анализа путем лизиса биологического материала 6M NaI и N-лауроилсаркозинатом и осаждения изопропанолом (Masaki Ishizawa et al. Simple procedure of DNA isolation from human serum. Nucleic Acids Research, 1991, vol. 19, N 20, p.5792).

Метод был предложен только для выделения ДНК, конкретно для ДНК вируса гепатита.

Целью изобретения является ускорение и упрощение генамплификационной диагностики за счет одновременного выделения ДНК и РНК в процессе подготовки биологического материала и проведения ПЦР-анализа одной и той же пробы.

Поставленная цель достигается тем, что для наиболее полного и одновременного выделения вирусных бактериальных и клеточных ДНК и РНК лизис биологического материала осуществляют раствором 6M NaI, содержащeм РНК-носитель, при этом раствор полученных ДНК и РНК пригоден как для ДНК-ПЦР, так РТ-ПЦР.

Подобная подготовка биологического материала для ПЦР-анализа обеспечивает сохранность нестабильной РНК, концентрирование ДНК и РНК в малом объеме и удаление ингибиторов ПЦР, а также позволяет выявлять истинных вирусоносителей с высокой точностью.

Способ осуществляется следующим образом.

Лизирующий раствор, содержащий 6M NaI и 20-50 мкг/мл РНК-носителя вносят по 550 мкл в пробирки на 1,5 мл и добавляют в каждую пробирку по 200 мкл исследуемого биологического материала и перемешивают пипетированием. Инкубируют смесь в течение 15 мин при 60oC. К полученному лизату добавляют 750 мкл (равный объем) изопропанола, перемешивают и ставят на 15 мин при комнатной температуре. Центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин, тщательно удаляют супернатант. Рекомендуется остатки супернатанта собрать на дне кратким (3-5 с) центрифугированием и еще раз отсасать. Обмывают осадок и стенки пробирки 0,5 мл промывочного раствора ацетона. Центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин, тщательно отсасывают супернатант. Осадок высушивают на воздухе, открыв пробирки и положив их горизонтально на стол. Отбирают в новую пробирку ТE- или РТ-буфер для растворения из расчета 31 мкл на пробу и добавляют к нему ингибитор рибонуклеаз (RNA sin, 40 units/ul) из расчета 0,2 мкл на пробу и перемешивают. Добавляют полученную смесь по 30 мкл к сухим осадкам и перемешивают на вортексе. Как правило, осадок полностью не растворяется (он содержит на только ДНК и РНК), при перемешивании он должен отделиться от дна пробирки. Оставляют пробирки на 15 мин при комнатной температуре. Для анализа следует использовать только жидкую фазу, поэтому перед каждым отбором центрифугируют 1 мин при 12000 об/мин для отделения осадка.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Сыворотку крови здорового донора и носителя HCV обрабатывали в пробирках Эппендорфа, пронумерованных по количеству проб. 200 мкл смешивали с 300 мкл лизирующего раствора и инкубировали в течение 15 мин при 60oC. Полученный лизат смешивали с равным объемом изопропанола и оставляли на 15 мин, центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин для осаждения ДНК и РНК. Осадок промывали 0,5 мл ацетона, суспендируя его на вортексе. Центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин и высушивали в вакууме. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 1, где показана электрофореграмма продукта РТ-ПЦР РНК HCV, изолированной из сывороток крови однопробирочным методом (дорожки 1 и 2 - сывортки HCV-носителей, дорожка 3 - сыворотка здорового) и фенол-хлороформгуанидинтиоционатным методом (дорожки 5 и 6 - сыворотки тех же HCV-носителей, дорожка 4 - сыворотка того же здорового).

Пример 2.

Сыворотку крови здорового донора и сыворотку крови, содержащую аликвоту РНК ВИЧ, обрабатывали как в примере 1. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 2, где показана электрофореграмма продукта РТ-ПЦР РНК ВИЧ, выделенной из сыворотки, содержащей аликвоту РНК ВИЧ (дорожка 2) и из сыворотки, не содержащей РНК ВИЧ (дорожки 1 и 3). В пробу 4 РНК ВИЧ внесена не в сыворотку а непосредственно. Верхний сигнал соответствует 10 молекулам внутреннего стандарта, сигнал ВИЧ расположен ниже.

Пример 3.

Серонегативную плазму крови и плазму крови носителя вируса гепатита B обрабатывали как в примере 1. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 3, где показана детекция вируса гепатита В путем двукратной гнездовой ПЦР в присутствии 10 молекул внутреннего стандарта (его сигнал на электрофореграмме указан стрелкой, сигнал вирусной ДНК расположен ниже) после выделения однопробирочным методом из 200 мкл плазмы крови. Дорожки 1-3 - анализы минипулов серонегативной плазмы, 4 - отрицательный контроль (вода), 5 - положительный контроль - плазма крови носителя вируса гепатита В, разбавленная в 1000 раз неинфицированной плазмой.

Пример 4.

Проводили анализ различных вакцинных препаратов в том числе содержащих ДНК из культуры Brucella bovis. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 4, где показана детекция ДНК Brucella bovis путем однократной ПЦР после выделения однопробирочным методом. 5 и 6 - соответственно положительный (раствор ДНК из культуры Brucella bovis) и отрицательный (вода) контроли. Сигнал ДНК возбудителя на электрофореграмме указан стрелкой. 1-4 анализы различных вакцинных препаратов.

Пример 5.

Проводили исследование антигенных участков тромбоцитов путем аллельспецифичной ПЦР на суммарной лейкоцитарной ДНК, выделенной как в примере 1. Результаты электрофореграммы отражены на фиг. 5, где показано генотипирование антигенных участков 2, 3 и 4 тромбоцитов путем аллель-специфичной ПЦР на суммарной лейкоцитарной ДНК, выделенной однопробирочным методом. Сигналы на уровне двух стрелок указыввают на наличие аллели a, b или обеих (ab), так что для данного донора генотип по этим участкам определен как 2 ab, 3a, 4a. Расположенный выше сигнал соответствует маркерному гену (в данном случае - гормона роста) и указывает на нормальное протекание ПЦР по всех пробах.

Как видно из конкретных примеров, предложенная обработка биологических материалов и их ПЦР-анализ позволяют быстро и надежно выявлять вирусо- и бактерионосительство даже у клинически здоровых серонегативных лиц.

Таким образом, применение подготовки биологических материалов предложенным способом позволяет ускорить время исследования без снижения чувствительности ПЦР теста. Чувствительность и специфичность ПЦР близки к предельно возможной, а результаты получают в течение одного дня. Данная обработка позволяет использовать для ПЦР практически любой материал: гистологические препараты, сухие пятна крови и тканей, количество исследуемого материала во многих случаях составляет несколько микролитров. Стоимость анализа ниже по сравнению с бактериологическими и иммунологическими методами при использовании отечественных реагентов и внедрении технологии ПЦР-минипулов.

Похожие патенты RU2134871C1

название год авторы номер документа
СПОСОБЫ И НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ МЕТОДАМИ ПЦР И РНК-ПЦР 2000
  • Федоров Н.А.
  • Елов А.А.
  • Суханов Ю.С.
RU2164532C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОНТАМИНАЦИИ КРОВИ 2002
  • Черкасов Е.Г.
  • Круглов А.Н.
  • Елов А.А.
  • Федоров Н.А.
  • Федоров Е.Н.
  • Суханов Ю.С.
RU2208645C1
УНИВЕРСАЛЬНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ГЕНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВЛАГАЛИЩНОЙ МИКРОФЛОРЫ БОЛЬШИХ ГРУПП ЖЕНЩИН 2002
  • Федоров Н.А.
  • А.А.
  • Гришаев М.П.
  • Гришаева О.Н.
  • Липатникова С.В.
RU2209040C1
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ ПУТЕМ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ВОЗБУДИТЕЛЯ В ИССЛЕДУЕМОЙ ПРОБЕ 1996
  • Елов Андрей Александрович
  • Виноградов Александр Владимирович
  • Медников Борис Михайлович
  • Макаров Николай Васильевич
RU2143113C1
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 2014
  • Хрипко Юрий Иванович
  • Батенева Наталья Владимировна
  • Смирнов Павел Николаевич
RU2584346C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PSP64-S, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ТРАНСКРИПЦИЮ IN VITRO ФРАГМЕНТА S-СЕГМЕНТА РНК ВИРУСА-ВОЗБУДИТЕЛЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ СЕРОТИПА ХАНТААН И ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РНК-КОНТРОЛЬ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР НА ЕЕ ОСНОВЕ 2002
  • Кузина И.И.
  • Яшина Л.Н.
  • Гришаева О.Н.
RU2221869C2
ПАРА СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА КОШЕК И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА КОШЕК 2014
  • Красникова Екатерина Сергеевна
  • Ларионова Ольга Сергеевна
  • Красников Александр Владимирович
  • Марушева Юлия Алексеевна
RU2553534C1
Способ определения ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле 2019
  • Малышев Денис Владиславович
  • Черных Олег Юрьевич
  • Баннов Василий Александрович
  • Котельникова Александра Андреевна
  • Кривонос Роман Анатольевич
  • Лысенко Александр Анатолиевич
  • Кощаев Андрей Георгиевич
  • Вацаев Шахаб Вахидович
  • Шевченко Александр Алексеевич
  • Хахов Латиф Асланбиевич
  • Черных Владимир Олегович
  • Лысенко Юрий Андреевич
  • Дробин Юрий Дмитриевич
  • Дмитрив Николай Иванович
  • Мищенко Алексей Владимирович
  • Дайбова Любовь Анатольевна
  • Семененко Марина Петровна
  • Неверова Ольга Петровна
  • Коломиец Сергей Николаевич
  • Гулюкин Михаил Иванович
  • Исаева Альбина Геннадьевна
  • Клименко Александр Иванович
  • Гринь Светлана Анатольевна
RU2728660C1
Способ выделения РНК и ДНК из сухих биологических образцов, хранившихся на бумажном носителе, и набор для его осуществления 2016
  • Жигалева Ольга Николаевна
  • Шестюк Василий Михайлович
RU2628695C1
СМЕННЫЙ МИКРОФЛЮИДНЫЙ МОДУЛЬ ДЛЯ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ И СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2008
  • Ходаков Дмитрий Андреевич
  • Мамаев Дмитрий Дмитриевич
  • Филатов Иван Васильевич
  • Юрасов Дмитрий Александрович
  • Черепанов Алексей Игоревич
  • Смолдовская Ольга Валерьевна
  • Дементьева Екатерина Игоревна
  • Лапа Сергей Анатольевич
  • Грядунов Дмитрий Александрович
  • Михайлович Владимир Михайлович
  • Заседателев Александр Сергеевич
RU2380418C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 134 871 C1

Реферат патента 1999 года СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии и вирусологии, и может применяться для выделения истинных вирусоносителей среди сероположительных лиц на основе прямого генотестирования этих вирусов. Проводят лизис образца биологического материала, осаждают вирусные, бактериальные и клеточные ДНК и РНК изопропанолом и центрифугированием. Затем осуществляют их очистку. При этом лизис проводят раствором 6М NaI, содержащeм РНК-носитель, а осаждают из лизата одновременно ДНК и РНК любого происхождения. Этот раствор полученных ДНК и РНК пригоден как для ДНК-ПЦР, так и РТ-ПЦР. Способ прост в исполнении и позволяет ускорить генамплификационную диагностику без снижения чувствительности и специфичности ПЦР-теста. 5 ил.

Формула изобретения RU 2 134 871 C1

Способ подготовки биологического материала для ПЦР - генамплификационной диагностики, включающий лизис образца, осаждение вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК изопропанолом и центрифугированием и их очистку, отличающийся тем, что лизис проводят раствором 6М NaI, содержащим РНК-носитель, а осаждают из лизата одновременно ДНК и РНК любого происхождения, при этом раствор полученных ДНК и РНК пригоден как для ДНК-ПЦР, так и РТ-ПЦР.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 1999 года RU2134871C1

Печь для непрерывного получения сернистого натрия 1921
  • Настюков А.М.
  • Настюков К.И.
SU1A1
СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА К ГИСТОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ 1994
  • Извозчиков И.Б.
  • Клочкова О.В.
  • Криволапов Ю.А.
  • Ермилов А.Н.
RU2089871C1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 1995
  • Зубкова Т.В.
  • Тарнопольская О.В.
  • Мармарова Т.Ю.
RU2104513C1
Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. 1921
  • Богач Б.И.
SU3A1
Объемный двигатель 1976
  • Ефременко Вячеслав Трофимович
  • Жирухин Юрий Николаевич
  • Жураковский Тарас Давидович
  • Свиридов Геннадий Серафимович
  • Сороковой Виктор Алексеевич
SU600323A1
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
EP 0696730 A1, 14.02.96
Кипятильник для воды 1921
  • Богач Б.И.
SU5A1
Masaki Jshizawa et al
Simple procedure of DNA isolation from human serum
Nucleic Acids Research
Циркуль-угломер 1920
  • Казаков П.И.
SU1991A1

RU 2 134 871 C1

Авторы

Федоров Н.А.

Елов А.А.

Суханов Ю.С.

Даты

1999-08-20Публикация

1998-12-01Подача