СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ КОНТАМИНАЦИИ КРОВИ Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/68 C12N15/10 

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, пищевой и фармацевтической промышленности и может применяться для прямого генотестирования бактериальной контаминации различных материалов, в том числе донорской крови и ее компонентов.

До последнего времени кровь клинически здоровых людей считали стерильной, а кровь доноров контролировали на бактерионосительство посевом на питательных средах с последующим наблюдением образования колоний. Однако рост бактерий происходит не в 100% случаев, так как существуют некультивируемые микроорганизмы, например Treponema pallidum, и медленно растущие микроорганизмы, например Mycobacterium tuberculosis, а также труднокультивируемые формы микроорганизмов. Одной из частых причин ложноотрицательных результатов бактериального тестирования является наличие антибиотиков в исследуемых материалах.

Известный и общепринятый метод контроля стерильности донорской крови и ее компонентов состоит в применении культивирования на средах, оптимизированных для широкого круга бактерий (С.Д.Митрохин. Микробиологическая диагностика инфекций кровяного русла на современном этапе развития клинической микробиологии. - Инфекции и антимикробная терапия 2002, т.4, 1, с. 27-29; T. Montag. "Concept for bacterial safety of blood components in Germany" - Transfusion and Aferesis Science, dispatch 20, April 2001, article N 90, p. 1-2). Этот метод позволил выявить довольно заметный уровень нестерильности хранимых единиц тромбоконцентрата, эритромассы и свежезамороженной плазмы, составивший в 1998-1999 гг. в Германии в среднем 0,2%. С учетом отмеченной выше трудной культивируемости многих патогенных микроорганизмов можно предполагать еще больший реальный уровень бактериальной загрязненности компонентов крови. Время, необходимое для идентификации бактерий посредством культивирования в средах, составляет от 1 до 8 дней, а современные генамплификационные методы позволяют сделать это в течение рабочего дня (S.Y.Turenne et al. "Rapid identification of bacteria from positive blood cultures by fluorescent-based PCR-single-strand conformational polymorphism analysis of the 16S rRNA gene. " - Journal of Clinical Microbiology 2000, v.38, No.2, p. 513-520). Ранняя диагностика в бактериологии значительно увеличивает эффективность антимикробной терапии и уменьшает смертность.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ обнаружения бактерий в различных материалах методом ПЦР на общем для всех бактерий участке гена 16 S рРНК (Klausegger A. et al. "Gram type-specific broad-range PCR amplification for rapid detection of 62 patogenic bacteria" - Journal of Clinical Microbiology 1999, v.37, No.2, p. 464-466) и его аналог, использующий ПЦР в реальном времени (C.E.Corless et al. "Contamination and Sensitivity Issues with a Real-Time Universal 16S rRNA PCR" -Journal of Clinical Microbiology, 2000, vol. 38, No. 5, p. 1747-1752). Основной проблемой, сдерживающей широкое применение геанамплификационного контроля стерильности донорской крови и ее компонентов, являются ложноположительные сигналы из-за бактериальной ДНК, примесь которой содержится в препаратах необходимой для ПЦР Taq-полимеразы. Этот фермент, в том числе и рекомбинантный, в любом случае имеет бактериальное происхождение, так что примесь ДНК в нем может быть значительной (см. пример 1). Специальные методы удаления этой ДНК (УФ-облучение, обработка ДНКазой 1 с последующим ее удалением прогревом) сопровождаются инактивацией полимеразы, в связи с чем даже при неоправданно трудоемком строго дозированном воздействии ДНК полностью не удаляется и не инактивируется. Даже в будущем, когда проблема устранения бактериальной ДНК из Taq-полимеразы будет решена клонированием этого фермента в небактериальных клетках (например, в дрожжах) фон ложноположительных сигналов может сохраниться из-за нестерильной работы при генодиагностических анализах.

Целью предложенного способа является повышение точности определения контаминации материалов за счет устранения ложноположительных результатов, обусловленных фоновыми сигналами от загрязнения Taq-полимеразы бактериальной ДНК.

Поставленная цель достигается тем, что определение бактериальной контаминации материалов осуществляют посредством генамплификации на общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности, причем препарат для генамплификации получают из материала цельной крови или осадка бактерий, полученных селективным центрифугированием бактерий из жидких биопроб или минипулов, объединяющих такие биопробы, а генамплификацию проводят в присутствии внутреннего стандарта и контаминацию определяют на основе превышения интенсивности сигнала бактериальной нуклеотидной последовательности относительно интенсивности сигнала внутреннего стандарта.

Сущность предлагаемого изобретения состоит в том, что для отличия неизбежного при генамплификационном анализе фонового сигнала от положительного предлагается использовать внутренний стандарт, сигнал которого определяется отдельно от сигнала бактериальной ДНК. Для анализов с обычной электрофоретической детекцией размноженного фрагмента это должен быть внутренний стандарт конкурентного типа, как и при генодиагностических анализах. Структура такого стандарта и его действие рассмотрены в примере 1. Минимально значимый уровень сигнала от бактериальной ДНК на электрофореграмме подавляется внутренним стандартом (который как бы "глушит" сигнал примесной ДНК фермента). В примере 2, который демонстрирует эффективность генамплификационного обнаружения как культивируемых, так и некультивируемых бактерий, сигнал примесной ДНК фермента подавлен полностью. Последнее не всегда удается в практической работе, и исследуемые пробы рассматриваются как положительные лишь в тех случаях, когда отношение интенсивностей сигналов от бактериальной ДНК и от стандарта превышает определенную величину (полный аналог cut-off в широко распространенном ИФА-анализе). Для удобства визуальной оценки результата без применения видеокомпьютерных систем анализа электрофореграмм следует считать инфицированными те пробы, в которых сигнал бактериальной нуклеотидной последовательности превышает по интенсивности сигнал внутреннего стандарта.

В генодиагностических системах нового поколения, основанных на ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией продукта количественная оценка содержания анализируемой ДНК в пробе определяется по моменту появления флуоресцентного сигнала (величине С_т), определяемому при компьютерной обработке зависимости флуоресценции от времени и температуры. Эта величина позволяет определить количество ДНК-мишени в пробе более точно, чем рассмотренное выше отношение сигналов мишени и внутреннего стандарта при гель-электрофорезе. Однако при весьма вероятном присутствии в пробе ингибиторов ПЦР величина С_т (имеет обратную зависимость от количества определяемой ДНК в пробе) может быть завышена аналогично ослаблению или полному исчезновению сигналов на электрофореграмме. Это приведет к ложноотрицательным результатам так же, как в обычной ПЦР без внутреннего стандарта с электрофоретической детекцией продукта. Для устранения такого эффекта при ПЦР в реальном времени также применяются внутренние контроли различного типа, сконструированные по соответствующим схемам (Absolute quantification with external standards and internal controls. - Roche Molecular Biochemicals, Technical Note No. LC 12/2000). Поэтому заявленный в данном изобретении внутренний стандарт как инструмент различения сигналов от бактериальной ДНК анализируемого материала и фоновых сигналов, обусловленных присутствием такой ДНК в ферменте или внесенной при проведении анализа, также необходим при ПЦР в реальном времени и/или флуоресцентной детекции продукта. Соответствующие внутренние стандарты конкурентного или иного типа могут быть сконструированы для любого из известных методов детекции продукта генамплификации.

Неизбежный для предлагаемого метода эффект частичного "глушения" электрофоретического сигнала от бактериальной ДНК в составе фермента внутренним стандартом и соответственно снижения чувствительности анализа может быть преодолен использованием препаратов Taq-полимеразы с минимальным содержанием примесной ДНК (см. пример 1, для такого фермента следует вводить меньшие количества внутреннего стандарта) и переходом к РНК-ПЦР на многокопийной 16 S рРНК вместо обычной ПЦР на ДНК гена этой РНК (патент РФ 2164532, пример 7; Е.Н.Федоров и др. ПЦР-детекция ДНК и РНК Treponema pallidum в крови серопозитивных доноров. - Вестник службы крови России 2001, 3, с. 42-46). В последнем случае многокопийность 16 S рРНК требует использования высоких концентраций внутренних стандартов, что упрощает анализ и снижает требования к примеси бактериальной ДНК в Taq-полимеразе.

Пример 3 показывает, что генамплификационное определение хорошо культивируемых бактерий в крови проходит одинаково эффективно для четырех разных видов бактерий, а чувствительность, как и в примере 2, сопоставима с посевом на твердую среду. При этом цельная кровь прямо вводилась в обработку однопробирочным методом выделения ДНК для ПЦР (патент РФ 21348771), который оказался весьма эффективен для крови и эритромассы. При введении этих материалов в лизирующий раствор на основе концентрированного йодистого натрия и прогреве по обычной методике все ДНК биопробы переходят в раствор, а избыток белков (гемоглобина, альбумина и др.) вместе с ингибиторами ПЦР выпадает в виде черного осадка. Последний после центрифугирования 5 мин при 16000 g образует на поверхности плотный слой, который может быть легко удален перед изопропанольным осаждением ДНК. Метод легко применим для объемов крови до 200 мкл (инструкция к набору для однопробирочного выделения суммы ДНК и РНК "ГенТест-РНК/ДНК-экстракция" по ТУ 9398-423-47621885-00, утверждена Минздравом РФ 17.03.2000), что соответствует обычным объемам при стандартных посевах на твердые среды.

Определение бактериальной контаминации в крови и жидких биопробах облегчено еще и возможностью селективного отделения бактерий на простой настольной центрифуге. Применяемые в клинических лабораториях современные модели таких центрифуг развивают ускорение до 16000 g, что позволяет надежно собрать все бактерии в виде плотного осадка. С другой стороны, клетки крови и тем более крупная взвесь других биопроб во многих случаях оседают на дно даже при стоянии; тем более это происходит при центрифугировании до 1000 g, когда бактерии остаются распределенными по всему объему, особенно если они живые и подвижные. Пример 4 показывает, что при центрифугировании 5 мин при 16000 g образца плазмы донорской крови, реально оказавшегося бактериально-инфицированным, все бактерии собрались в осадке, а супернатант стал совершенно свободным от бактерий. На этом основании может быть предложена общая методика: кровь или любая биопроба (моча, СМЖ, смыв, мазок) суспендируется в растворе, стабилизирующем бактерии и обеспечивающем их сохранность (например, забуференный физиологический раствор (PBS, SSC); если нужен бактерицидный эффект, можно ввести еще 0,02-0,10% азида натрия), после отстоя или низкоскоростного центрифугирования отбирается верхний слой осветленной жидкости, которая далее центрифугируется при 16000g для осаждения бактерий.

Пример 1. Вариант структуры внутреннего стандарта для универсального генамплификационного определения бактериальной контаминации материалов. Большие различия в содержании бактериальной ДНК в препаратах Taq-полимеразы от разных производителей, подбор препарата фермента для работы.

Для обнаружения бактерий были применены праймеры DG 74 и RW 01 (Greisen К. et al. "PCR primers and probes for 16 S rRNA genes of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid" - Journal of Clinical Microbiology, Feb. 1994, p. 335-351), расположенные в консервативном участке гена 16 S рРНК и универсальные для всех бактерий. Внутренний стандарт был получен ПЦР-амплификацией фрагмента LacZ гена плазмиды PUC 19 с использованием составных праймеров agg-agg-tga-tcc-aac-cgc-act-ggc-cgt-cgt-ttt-ac (DGC) и aac-tgg-agg-aag-gtg-ggg-atc-aga-gca-gat-tgt-act-g (RWZ 2). В этих праймерах 19 и 20 5' - концевых звеньев соответственно совпадают с рабочими праймерами DG 74 и RW 01, а оставшиеся части способны работать как праймеры на участке 291-538 плазмиды pUC 19 (нумерация по AGPUC 19 WB, AC M 77789). Продукт ПЦР с DGC и RWZ 2 на pUC 19 имеет длину 278 нуклеотидных пар с участками связывания DG74 и RW01, так что может работать с этими праймерами как внутренний стандарт при ПЦР на гене 16 S рРНК бактерий, в которой продукт ПЦР имеет длину 372 нуклеотидных пар. Такой внутренний стандарт был синтезирован методом ПЦР, выделен электрофорезом в агарозном геле и затем извлечен расплавлением полоски геля в 1 мл воды с последующим вымораживанием агарозы. По интенсивности флуоресценции полосы в геле количество элюированного в 1 мл стандарта было оценено как 0,1 мкг= 0,5 пмоль, а концентрация в полученном растворе как 3•10⁸ молекул/мкл. На основе этих данных рассчитывалось приближенное количество внутреннего стандарта в ПЦР. На фиг.1,а приведен результат ПЦР с амплификационными реагентами, скомпонованными по патенту РФ 2164532 (амплификационный раствор aRR с праймерами DG 74 и RW 01, буфер 2хБФ с препаратом Taq-полимеразы, отобранным по интенсивности ПНР-сигнала примесной ДНК фермента, см. ниже). Очень сильный сигнал бактериальной ДНК в составе Taq-полимеразы без добавления какой-либо ДНК является характерным для ПЦР с DG 74 и RW 01 для большинства ферментов (фиг. 1, а, дорожка 5). Синтезированный внутренний стандарт действительно может подавить этот сигнал, но для большинства ферментов его требуется слишком много. Вместе с тем сопоставление препаратов Taq-полимераз разных производителей позволяет найти фермент, где сигнал примесной бактериальной ДНК очень слабый даже в присутствии 300 молекул внутреннего стандарта (препарат 6 на фиг.1,Б). Этот препарат и использовался для дальнейшей работы. Следует, однако, указать, что большинство других препаратов Taq-полимераз, эффективно работающих в обычных ПЦР-анализах, содержат неприемлемо большие количества бактериальной ДНК. Эта ДНК может быть инактивирована хотя бы частично известным методом УФ-облучения, но это сопровождается инактивацией фермента, и потому требует очень трудоемкого подбора условий.

Пример 2. Генамплификационное обнаружение культивируемых и некультивируемых бактерий.

Серия разведений культуры St. aureus в PBS посеяна обычным методом на среду и параллельно 1 мл каждого из разведений центрифугирован 10 мин при 16000 g и осадок со 100 мкл придонного слоя обработан однопробирочным методом ("ГенТест-РНК/ДНК-экстракция" по ТУ 9398-423-47621885-00). Полученный осадок ДНК растворен в 20 мкл воды и 5 мкл введено в ПЦР в присутствии 300 молекул внутреннего стандарта. Полученная электрофореграмма продуктов приведена на фиг.2,а. Результаты суммированы в таблице 1. В тех же условиях был проведен ПЦР-анализ некультивируемой in vitro бледной трепонемы. Серия разведений смыва бледной трепонемы со срезов придатков яичек инфицированного кролика, имеющего концентрацию возбудителя примерно 10⁷ клеток/мл по данным темнопольной микроскопии, была обработана аналогичным образом. Бледная трепонема надежно определяется в количестве 200 клеток на пробу (фиг.2,Б).

Полученные результаты в определенной мере указывают на пониженную чувствительность ПЦР из-за необходимости "глушить" внутренним стандартом сигнал бактериальной ДНК в составе фермента, и даже на меньшую чувствительность по сравнению с посевом для хорошо культивируемых микроорганизмов. Однако при этом наглядно проявляется незаменимость ПЦР при обнаружении некультивируемых микроорганизмов.

Пример 3. Определение бактериальной контаминации в искусственно инфицированной донорской крови.

Четыре культуры бактерий (Echerichia coli, Pseudomonas aerugenosa, Staphyhcoccus aureus, Enterococcus fecalis) были добавлены к аликвотам донорской крови. Далее полученные четыре образца искусственно инфицированной крови были последовательно разбавлены в 100 раз неинфицированной кровью аналогично примеру 2. Из каждого разведения 100 мкл цельной крови посеяно на твердую среду. Тот же объем (100 мкл) введен в выделение ДНК однопробирочным методом ("ГенТест-РНК/ДНК экстракция" по ТУ 9398-423-47621885-00), полученный осадок ДНК растворен в 20 мкл воды и 5 мкл введено в ПЦР в присутствии 300 молекул внутреннего стандарта. Полученные результаты суммированы в таблице 2.

Пример 4. Осаждение бактерий из реального образца инфицированной плазмы донорской крови.

Образец плазмы донорской крови, давший положительный результат при ПЦР-анализе на бактериальную нуклеотидную последовательность в условиях примера 2 (фиг. 3, дорожка 5), был подвергнут центрифугированию 10 мин при 16000 g параллельно с образцом неинфицированной плазмы. Из электрофореграммы на рис. 3 следует, что в таких условиях все бактерии собираются в осадке, и супернатант инфицированной плазмы также оказывается свободным от бактерий (дорожка 4). Это указывает на возможность использования даже простых центрифуг для концентрирования бактерий из жидких биопроб, в том числе и большого объема. Соответственно при ПЦР-анализе бактерий был применен и метод минипулов, при котором не было обнаружено понижение чувствительности из-за разбавления.

Таким образом, способ позволяет с высокой точностью определять бактериальную контаминацию донорской крови и ее компонентов генамплификационным методом на общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности в присутствии внутреннего стандарта.

Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано для прямого генотестирования бактериальной контаминации донорской крови и ее компонентов. Для проведения определения из образца крови выделяют ДНК и проводят с ней полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В ПЦР используют праймеры на общую для всех бактерий нуклеотидную последовательность (НП), а реакцию проводят в присутствии внутреннего стандарта конкурентного типа. Выявляют сигналы от внутреннего стандарта и общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности и при наличии сигналов одновременно от внутреннего стандарта и общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности определяют бактериальную контаминацию крови, а при наличии сигнала от одного внутреннего стандарта - отсутствие бактериальной контаминации. Способ позволяет повысить точность определения контаминации материалов. 3 ил., 2 табл.

Способ определения бактериальной контаминации крови, отличающийся тем, что из исследуемой крови выделяют ДНК, проводят с ней полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) с использованием праймеров на общую для всех бактерий нуклеотидную последовательность в присутствии внутреннего стандарта конкурентного типа, затем выявляют сигналы от внутреннего стандарта и общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности и при наличии сигналов одновременно от внутреннего стандарта и общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности определяют бактериальную контаминацию крови, а при наличии сигнала от одного внутреннего стандарта - отсутствие бактериальной контаминации.