БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ КРАХМАЛА, СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ, ТВЕРДЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ И СПОСОБ ОСАХАРИВАНИЯ КРАХМАЛА Российский патент 2001 года по МПК C12N11/14 C12P19/02 

Изобретение относится к биокатализаторам, способам их приготовления и способам получения глюкозы осахариванием крахмала и может быть использовано в химической, пищевой и фармакологической промышленности для производства глюкозы из крахмалсодержащего сырья.

Известно, что в процессе получения глюкозы из крахмалсодержащего сырья ключевой стадией является осахаривание крахмала, которое заключается в его гидролизе глюкоамилазой - ферментом, разрушающим терминальные связи в молекулах крахмала и/или декстринов с высвобождением глюкозы. При производстве глюкозы процесс осахаривания проводят, как правило, в присутствии гетерогенного биокатализатора, который представляет собой названный фермент - глюкоамилазу, иммобилизованый на поверхности небиологического твердого носителя.

Известен, например, гетерогенный биокатализатор осахаривания глюкозы, полученный путем иммобилизации глюкоамилазы на носителе - предварительно обработанных частицах костного материала свиньи, с последующей сшивкой адсорбированного фермента глутаровым альдегидом [S. Mukataka, S. Negishi, S. Sato. J. Takahashi. Effect of presoaking treatment of support material on the activity of immobilized glucoamylase. Enzyme Microb. Technol. 1993. V. 15, N 3. P. 229-233]. В этом биокатализаторе глюкоамилаза сохраняет до 60% от ее активности в растворе - максимальная удельная активность иммобилизованной глюкоамилазы составляет 19,7 ЕА/ мг белка, в среднем 2-5 ЕА/мг. Этот биокатализатор обладает относительно высокой стабильностью как в условиях периодического проведения процесса получения глюкозы (за 10 циклов, по 48 часов каждый, сохраняется до 70% первоначальной активности), так и при непрерывном функционировании (за 700 часов работы активность практически не изменяется). Однако приготовление этого катализатора достаточно сложно.

Известны также различные биокатализаторы, приготовленные иммобилизацией глюкоамилазы на носителе - активированном угле путем адсорбции, или ковалентного связывания, или поперечной сшивки или др. [Y.K. Cho, J.E. Bailey. Immobilization of enzymes on activated carbon: selection and preparation of carbon support. Biotechnol. Bioeng. 1979. V. 21. N 3. P. 461-476]. Максимальная величина адсорбции фермента в таких катализаторах составляет 49 мг белка/г угля, максимальная удельная активность равна 0,4 ЕА/мг белка и около 80% данной активности сохраняется через 1 месяц.

Наиболее близким является биокатализатор, состоящий из глюкоамилазы и твердого носителя - активированного угля, и способ его приготовления путем иммобилизации ферментов на активированном угле с удельной поверхностью 600-1000 м²/г [Патент США N 4289853, МПК C 12 N 11/02, 15.09.1981], пригодный в том числе и для иммобилизации глюкоамилазы с получением в результате биокатализатора для осахаривания крахмала. При приготовлении катализатора активированный уголь подвергают специальной обработке: вначале модифицируют его поверхность обработкой концентрированными кислотами, преимущественно азотной, для образования поверхностных кислородсодержащих функциональных групп, в том числе карбоксигрупп, а затем модифицированный уголь выдерживают в растворе бифункционального сшивающего агента (карбодиимида, диальдегида и др.). Подготовленный таким образом активированный уголь вводят в контакт с раствором глюкоамилазы, при этом происходит связывание ферментной глобулы посредством образования ковалентных связей, и поверхность угля заполняется ферментом. Поскольку только 10-30% пористого пространства активированного угля занимают мезопоры размером 300-1000 А, подходящие для иммобилизации крупных белковых молекул ферментов, максимальная величина адсорбции составляет 49 мг белка/г угля. Удельная ферментативная активность полученного этим способом биокатализатора равна 0,4 ЕА/мг белка (18 ЕА/г биокатализатора), а его стабильность характеризуется тем, что в течение 1 месяца его хранения при 30^oC иммобилизованная глюкоамилаза сохраняет 80% первоначальной активности. Этот биокатализатор по наибольшему количеству сходных с предлагаемым биокатализатором для осахаривания глюкозы признаков принят за прототип изобретения. Описанный биокатализатор имеет недостаточно высокую ферментативную активность и стабильность, а непосредственно процесс иммобилизации глюкоамилазы при приготовлении катализатора достаточно сложен.

Изобретение решает задачу увеличения ферментативной активности и стабильности биокатализатора осахаривания крахмала и упрощения способа его приготовления.

Поставленная задача решается тем, что предлагается биокатализатор для осахаривания крахмала, включающий фермент глюкоамилазу и твердый носитель, на поверхности которого иммобилизована глюкоамилаза, носителем является, в частности, зауглероженный алюмосиликат, который имеет удельную поверхность не менее 2 м²/г и выполнен в форме гранул, сотовых монолитов; пеноматериала.

Задача решается также способом приготовления биокатализатора для осахаривания крахмала путем иммобилизации глюкоамилазы адсорбцией на поверхности твердого зауглероженного носителя, в частности зауглероженного алюмосиликата. При этом носитель имеет удельную поверхность не менее 2 м²/г и выполнен в форме гранул, сотовых монолитов, пеноматериала.

Задача решается также использованием для иммобилизации ферментов, твердого зауглероженного носителя.

Твердым носителем является зауглероженный аюмосиликат с удельной поверхностью не менее 2 м²/г. Величина углеродного покрытия составляет не менее 1,5 мас.% углерода, углеродное покрытие имеет структуру волокнистого каталитического углерода с выходом по углероду не менее 3 г углерода на 1 г катализатора, углеродное покрытие имеет мезопористую структуру.

Носитель выполнен в форме гранул, сотовых монолитов, пеноматериала.

При этом носитель готовят способом, который позволяет усилить адсорбционные свойства зауглероженного алюмосиликата. При приготовлении носителя на исходный алюмосиликат с удельной поверхностью 0,1-24 м²/г наносят никель. Затем проводят пиролиз пропан-бутановой смеси в присутствии данного носителя, в результате чего получают зауглероженный алюмосиликат, удельная поверхность которого в несколько раз превышает удельную поверхность исходного алюмосиликата. Приготовленный таким образом носитель имеет структуру, содержащую большое количество мезопор, пригодных по размеру для размещения в них молекул фермента, причем основное количество мезопор образуется в углеродном поверхностном покрытии за счет того, что оно имеет уникальную волокнистую микроструктуру. Это способствует более прочному, относительно известных носителей, удержанию в этих мезопорах молекул фермента. Иммобилизация глюкоамилазы заключается в проведении процесса ее физической адсорбции на поверхности этого носителя, например, путем погружения носителя в водный раствор фермента, выдерживания его в течение необходимого времени при периодическом перемешивании. Следует отметить, что адсорбционная иммобилизация фермента на твердом носителе - наиболее простой способ получения гетерогенного биокатализатора. При этом активность фермента сохраняется на высоком уровне, так как в таком катализаторе отсутствуют токсические сшивающие реагенты, которые могут оказывать дезактивирующее действие на ферментативную активность. Адсорбция фермента на поверхности носителя прочная, так как поры его имеют подходящий размер, а углеродное поверхностное покрытие - соответствующую микроструктуру (углеродные тонкие волокна) и химическую природу, вследствие чего биокатализаторы на этом носителе обладают высокой стабильностью.

Задача решается также способом осахаривания крахмала в присутствии биокатализатора, включающего фермент глюкоамилазу и твердый носитель, при этом используют биокатализатор, в котором глюкоамилаза иммобилизована на поверхности зауглероженного носителя, предпочтительно алюмосиликата.

Процесс проводят в непрерывном режиме с использованием неподвижного слоя биокатализатора.

Процесс осахаривания крахмала проводят при температуре не ниже 50^oC.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для приготовления биокатализатора используют в качестве носителя зауглероженный алюмосиликат, содержащий 1,97 мас.% углерода, в виде монолитов сотовой структуры, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию глюкоамилазы. Биокатализатор готовят следующим образом.

На первой стадии алюмосиликат с удельной поверхностью 24 м²/г прокаливают при 900^oC и далее пропитывают раствором, содержащим соединения никеля. Затем носитель восстанавливают в токе водорода и зауглероживают в процессе пиролиза пропан-бутановой смеси. Содержание углерода в носителе составляет 1,97 мас.%.

На второй стадии осуществляют процесс иммобилизации фермента глюкоамилазы в статическом режиме путем адсорбции, которую проводят при 20-22^oC следующим образом: буферный раствор (0,05 М ацетатный буфер, pH 4,6) глюкоамилазы находится в контакте с носителем в соотношении 10:1 (по весу) в течение 1 суток при периодическом перемешивании. Величину адсорбции определяют по разности количеств белка в растворе до и после проведения процесса адсорбции и выражают в мг белка на 1 г носителя. Полученный биокатализатор промывают 10-кратным избытком буферного раствора и используют в процессе осахаривания 1%-ного раствора крахмала до глюкозы при 20-22^oC. Ферментативную активность биокатализатора в данном процессе выражают в мкмоль выделившейся глюкозы в мин (ЕА) на 1 мг белка при pH 4,6.

Полученный биокатализатор имеет следующие характеристики: величина адсорбции глюкоамилазы составляет 2,5 мг белка /г носителя, начальная удельная ферментативная активность составляет 1,5 ЕА/мг (что в 3,7 раза больше, чем в прототипе), стабильность: биокатализатор сохраняет 60% первоначальной активности через 7 месяцев хранения при 20-22^oC (это значительно превышает стабильность пропотипа).

Пример 2. Для приготовления биокатализатора используют зауглероженный алюмосиликат, содержащий 2.5 мас.% углерода, в виде монолитов сотовой структуры, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию глюкоамилазы. Биокатализатор готовят следующим образом.

На первой стадии алюмосиликат с удельной поверхностью 24 м²/г прокаливают при 900^oC и далее наносят на поверхность никель. Затем зауглероживают в процессе пиролиза пропан-бутана. Содержание углерода в образце составляет 2,5 мас.%.

Иммобилизацию глюкоамилазы на носителе проводят аналогично примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора с величиной адсорбции 1,2 мг белка/г следующие: начальная удельная активность 3,2 ЕА/мг белка (в прототипе 0,4 ЕА/мг). Стабильность: биокатализатор сохраняет 87% первоначальной активности за 1 месяц хранения при 20-22^oC; 26% первоначальной активности за 5 месяцев и 22% - за 8 месяцев (в прототипе-80% за 1 месяц хранения).

Пример 3. Для приготовления биокатализатора используют в качестве носителя зауглероженный алюмосиликат, содержащий 4,4 мас. % углерода, в виде гранул диаметром не более 5 мм, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию глюкоамилазы. Биокатализатор готовят следующим образом.

На первой стадии готовят носитель так же, как в примере 1. Содержание углерода в образце составляет 4,4 мас.%. Полученный образец обрабатывают концентрированной азотной кислотой (ρ = 1,407) при 80^oC, отмывают дистиллированной водой до нейтрального значения pH и высушивают.

Вторую стадию - непосредственно иммобилизацию глюкоамилазы проводят так же, как в примере 1.

Полученный биокатализатор имеет следующие характеристики: величина адсорбции 1,2 мг/г, начальная удельная активность 1,3 ЕА/мг белка (в прототипе 0,4 ЕА/мг), стабильность: биокатализатор сохраняет 100% первоначальной активности за 1 месяц хранения при 20-22^oC; 61% первоначальной активности за 5 месяцев и 54% - за 8 месяцев (в прототипе - 80% за 1 месяц хранения).

Пример 4. Для приготовления биокатализатора используют в качестве носителя зауглероженный алюмосиликат, содержащий 2,23 мас.% углерода, в виде сотовых монолитов, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию глюкоамилазы. Биокатализатор готовят следующим образом.

На первой стадии используют носитель, приготовленный как в п.1. Содержание углерода в образце составляет 2,23 мас.%. Иммобилизацию глюкоамилазы проводят так же, как описано в примере 1.

Полученный биокатализатор с величиной адсорбции 3,2 мг белка/г носителя имеет следующие характеристики: начальная удельная активность 1,0 ЕА/мг белка (в прототипе 0,4 ЕА/мг); стабильность: сохраняется 50% первоначальной активности за 2 месяца хранения при 20-22^oC (в прототипе-80% за 1 месяц хранения).

Пример 5. Для приготовления биокатализатора используют в качестве носителя зауглероженный алюмосиликат, содержащий 1,22 мас.% углерода, в виде пеноматериала с диаметром ячейки не более 2 мм, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию глюкоамилазы. Биокатализатор готовят следующим образом.

Используют алюмосиликатный носитель с удельной поверхностью 0,13 м²/г, прокаленный при 1200^oC. Данный носитель обрабатывают раствором, содержащим соли никеля и мочевины. Высушенные образцы помещают в реактор, восстанавливают водородом, затем зауглероживают в процессе пиролиза пропан-бутана. Содержание углерода в образце составляет 1,22 мас.%.

Иммобилизацию глюкоамилазы на носителе проводят, как описано в примере 1. Процесс проводят в реакторе с неподвижным слоем биокатализатора.

Свойства полученного биокатализатора с величиной адсорбции 3,4 мг/г: начальная удельная активность 0,4 ЕА/мг белка (аналогично прототипу); стабильность: биокатализатор сохраняет 58% первоначальной активности за 2 месяца хранения при 20-22^oC; через 5,5 месяцев хранения активность остается на том же уровне (в прототипе - 80% за 1 месяц хранения).

Пример 6. Для приготовления биокатализатора используют в качестве носителя зауглероженный алюмосиликат, содержащий 3,96 мас.% углерода, в виде монолитов сотовой структуры, на котором путем адсорбции проводят иммобилизацию глюкоамилазы. Биокатализатор готовят следующим образом.

Используют такой же носитель, как в примере 1. Содержание углерода в образце составляет 3,96 мас.%.

Иммобилизацию глюкоамилазы осуществляют в динамических условиях: при 20-22^oC. Через колоночный реактор, заполненный носителем (2-10 г) в виде блока сотовой структуры диаметром 20 мм, длиной 130 мм, размером канала квадратного сечения 1,8х1,8 мм и толщиной стенки 0,25 мм, прокачивают непрерывно со скоростью 10 мл/мин раствор глюкоамилазы до полного заполнения адсорбционной емкости носителя (в течение 6 часов).

Затем полученный биокатализатор промывают десятикратным объемом буферного раствора и используют в процессе непрерывного гидролитического расщепления крахмала до глюкозы в следующих условиях: 50^oC, проточный режим, 1-5% раствор крахмала. В процессе иммобилизации температурный оптимум функционирования глюкоамилазы расширяется и сдвигается в область более высоких температур на 15^oC, что составляет 50-60^oC.

Свойства полученного биокатализатора: адсорбционная емкость носителя 4,3 мг/г, начальная удельная активность 5,5 ЕА/мг белка, операционная стабильность: биокатализатор сохраняет 60% первоначальной активности после непрерывной работы биокатализатора в течение 300 часов, конверсия (степень превращения) при гидролизе 1%-ного раствора крахмала составляет 95%; при гидролизе 5%-ного раствора крахмала 55-60% за один проход через слой биокатализатора, производительность биореактора с неподвижным слоем полученного биокатализатора составляет 0,5 г глюкозы/1 г биокатализатора/час при гидролизе 5%-ного раствора крахмала.

Таким образом, биокатализатор для осахаривания крахмала на основе глюкоамилазы, иммобилизованной на зауглероженном алюмосиликате, имеет активность, превышающую активность прототипа в 3-8 раз, а стабильность - в 1,5-3 раза. Твердый зауглероженный носитель для биокатализатора является эффективным адсорбентом для глюкоамилазы. Способ приготовления катализатора чрезвычайно прост.

Изобретение может быть использовано в химической, пищевой и фармакологической промышленности для производства глюкозы из крахмалсодержащего сырья. Биокатализатор для осахаривания крахмала включает фермент глюкоамилазу, иммобилизированную на твердом носителе зауглероженном алюмосиликате. Носитель имеет мезопористую структуру и удельную поверхность не менее 2 м²/г, с величиной углеродного покрытия не менее 1,5 мас.% углерода. Биокатализатор имеет высокую ферментативную активность и стабильность, при этом прост в приготовлении. 4 с. и 11 з.п. ф-лы.

1. Биокатализатор для осахаривания крахмала, включающий фермент глюкоамилазу и твердый носитель, на поверхности которого иммобилизована глюкоамилаза, отличающийся тем, что носителем является зауглероженный алюмосиликат, имеющий удельную поверхность не менее 2 м²/г, с величиной углеродного покрытия не менее 1,5 мас.% углерода, при этом углеродное покрытие имеет структуру волокнистого каталитического углерода и мезопористую структуру. 2. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме гранул. 3. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме сотовых монолитов. 4. Биокатализатор по п.1, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме пеноматериала. 5. Способ приготовления биокатализатора для осахаривания крахмала путем иммобилизации глюкоамилазы на твердом носителе, отличающийся тем, что глюкоамилаза иммобилизована путем адсорбации на поверхности зауглероженного алюмосиликата, имеющего удельную поверхность не менее 2 м²/г, с величиной углеродного покрытия не менее 1,5 мас.% углерода, при этом углеродное покрытие имеет структуру волокнистого каталитического углерода и мезопористую структуру. 6. Способ приготовления по п.5, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме гранул. 7. Способ приготовления по п.5, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме сотовых монолитов. 8. Способ приготовления по п.5, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме пеноматериала. 9. Твердый носитель для иммобилизации глюкоамилазы, отличающийся тем, что он является зауглероженным алюмосиликатом, имеющим удельную поверхность не менее 2 м²/г, с величиной углеродного покрытия не менее 1,5 мас.% углерода, при этом углеродное покрытие имеет структуру волокнистого каталитического углерода и мезопористую структуру. 10. Твердый носитель по п.9, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме гранул. 11. Твердый носитель по п.9, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме сотовых монолитов. 12. Твердый носитель по п.9, отличающийся тем, что носитель выполнен в форме пеноматериала. 13. Способ осахаривания крахмала в присутствии биокатализатора, включающего фермент глюкоамилазу и твердый носитель, отличающийся тем, что используют биокатализатор, в котором глюкоамилаза иммобилизована на поверхности зауглероженного алюмосиликата, имеющего удельную поверхность не менее 2 м²/г, с величиной углеродного покрытия не менее 1,5 мас.% углерода, при этом углеродное покрытие имеет структуру волокнистого каталитического углерода и мезопористую структуру. 14. Способ осахаривания крахмала по п.13, отличающийся тем, что процесс проводят в непрерывном режиме с использованием неподвижного слоя биокатализатора. 15. Способ осахаривания крахмала по п.13, отличающийся тем, что процесс проводят при температуре не ниже 50^oC.