Способ иммобилизации ферментов Советский патент 1982 года по МПК C12N11/14 

Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, получению гетерогенных катализаторов на неорганических матрицах.

Известен способ иммобилизации ферментов, в частности, щелочной фосфата зы, адсорбцией на карбохроме из нейтральных и щелочных буферных растворов Используемый в качестве носителя карбохром представляет собой термическую сажу с нанесенным на ее поверхность пироуглеродом при пиролизе бензола (фракция с размером гранул 0,25-0,5 мм).

Однако данный способ не обеспечивает высокой активности получаемых иммобили зованных ферментов, достигаемая активность не превышает 5-20% от исходной активности фермента в растворе. Кроме того, использование указанного носителя требует дополнительных затрат на его получение, при этом для данного носителя ограничены возможности регулирования макрокинетических свойств матрицы, прежде всего пористой структуры. Эта характеристика является чрезры тайно важной для иммобилизации фермента, так как для получения стабильного и активного препарата размер пор носителя должен соответствовать размеру глобулы фермента и обеспечить транспорт субстрата и продукта реакции.

Целью изобретения является повышение активности иммобилизованных ферментов и упрощение процесса за счет применения более дешевых и доступных носителей.

Указанная цель достигается тем,

10 что при осуществлении способа иммобилизации ферментов, адсорбцией на углеролсодержаишх носителях в качестве носителей использук1Т окись алюминия или окись кремния, или алюмоси15ликаты, зауглероженные при пиролизе углеводородов.

Минеральные матрицы, зауглероженные в различных каталитических реакциях пиролиза углеводородов, факти20чески представляют собой отработанные катализаторы ряда нефтехимических производств. При этом используемые минеральные матрицы являются дешевыми и широко распространенными

25 носителями с легко регулируемыми макрокинетическими характеристиками (пористая структура, площадь поверхности). Нанесенное на минеральный каркас углеродное покрытие обус30лавливает брлее прочное связывание фермента с носителем за счет связывания фермента с обеими составляющими носителя (как с минеральной матри цей, так и с углеродным покрытием). Активность иммобилизованных ферментов, полученных предлагаемым способом, составляет 20-50%. Носители, используемые в предлага емом способе, получают следующим образом. В кварцевый реактор (ЮО см) помещают 50 см исходной окиси алюминия или окиси кремния, или алюмосиликата, приводят слой в виброожиженное состояние, опускают реактор в трубчатую печь и до выхода на заданную температуру () пропускают ток аргона (10 л/ч) для удаления сле дов влаги. Затем образец зауглероживают, обрабатывая его дивинилом или пропан-бутаном, или бензолом, или TO луолом в течение часа. По окончании процесса реактор продувают 30 мин аргоном, после чего охлаждают также в токе аргона. В полученном углеродсодержашем сорбенте определяют содержание углерода весовым методом и удельную поверхность по тепловой десорбции аргона. Пример 1. Иммобилизация лак татдегидрогеназы на окиси алюминия, зауглероженной при пиролизе дивинила Навеску АБг ОдСЮО мг) ,. зауглероженного пиролизом дивинила согласно приведенной методике (% С 16,5; SSA - размер частиц 0,250,40 мм) заливают 3-5 мл воды и дез аэрируют до прекращения выделения пузырьков воздуха из пор адсорбента Эта предосторожность позволяет избе жать денатурации фермента на границе раздела жидкой и газообразной фаз, где ее скорость значительно выме, чем в растворе. Дезаэрированный носитель переносят в медленно вращающу юся колбу, .заливают 10 мл раствора лактатдегидрогеназы (концентрация 0,4 мг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,0 и перемешивают в тече ние часа при . Слабо связанный с носителем фермент удаляют трехКратным промыванием 1 М раствором хлористого натрия. По разности количеств фермента в исходном растворе и в растворе после нанесения, соединенном с промывными водами, рассчитывают количество адсорбированной лактатдегидрогеназы в миллиграммах фермента на rpar-iM носителя, оно составляет 40 мг/г. Полученный препа рат иммобилизованной лактатдегидрогеназы заливгиот фосфатным буфером -и выдерживают в течение недели. Как показывают измерения активности раст вора и общий анализ на белок, десорб ции фермента с поверхности носителя не происходит. Носитель с адсорбированным на нем ферментом за.гружают в без градиентный реактор циркуляционной установки, термостатированной при 25°С, и определяют активность иммобилизованной лактатдег.идрогеназы по уменьшению оптической плотности никотинамидадениндинуклеотида (NADH) при длине волны 340 нм в реакции, ката(Лизируемой этим ферментом 00+HADH+H--- OTjCC OO -TTAD ООН (пирубот) (; CiKfflom) Скорость циркуляции выбирают такой чтобы скорость реакции от нее не зависела, что позволяет избежать протекания реакции во внутридиффузионной области. Адсорбированная лактатдегидрогеназа сохраняет 35% активности от активности фермента в растворе. Адсорбция лактатдегидрогеназы на зауглероженном А.г.0э повышает ее термостабильность. При нагревании при 65с в течение 10 ч сохраняется 45% начальной активности адсорбированной лактатдегидрогеназы, в то время как фермент в растворе при этой температуре полностью инактивируется за 1-2 мин. Адсорбированный фермент значительно стабильнее при длительном хранении, чем фермент в растворе. Последний полностью дезактивируется в течение 1-2 недель в фосфатном буфере с рН 6,0 при комнатной температуре. Иммобилизованная же лактатдегидрогеназа сохраняет 90% активности от исходной величины в Течение 6 мес при тех же условиях. Пример 2. Иммобилизация лактатдегидрогеназы на окиси алюминий, зауглероженной при пиролизе бензола. На , зауглероженный пироли-а зом бензола (% С 3,4; S-aA 114 м/г f размер частиц 0,25-0,40 мгд) , наносят фермент в количестве 30 Мг/г по методике, описанной в примере 1. Адсорбированный фермент сохраняет 30% активности от активности лактатдегидрогеназы в pacj ope. Активгность определяетсятак же, как в примере 1. При хранении в течение 3 мес (фосфа тный буфер с рН б,0 комнатная температура) -активность иммобилизованного фермента сохраняется на 100% в сравнении с исходной. Пример 3. Иммобилизация лактатдегидрогеназы на окиси кремния, зауглероженкой при пиролизе толуола. На SiOrj, зауглероженный пиролизом толуола С % С 18,0 f . 66 MVr размер частиц 0,15-0,40 мм), наносят фермент по методике, отличающейся от методики примера 1 тем, что адсорбцию проводят при комнатной температуре, периодически помешивая раствор фермента над носителем в течение суток. Остальные операции те же, что и в методике примера 1. Количество адсорбированной лактатдегидрогеназы составляет 25 мг/г.

Адсорбированная лактатдегидрогеназа сохраняет 20% активности от активности фермента в растворе (активность определяется так же, в примере 1) . Адсорбция на зауглероженной окиси кремния повышает стабильность |фермента при длительном хранении.Иммобилизованная лактатдегидрогенеза схраняет 100% активности в течение 3 мёс при комнатной температуре ч рН 6,0.

Пример 5. На , зауглероженный пиролизом дивинила (% С 5; 5(д 80 размер частиц 0,4-0,6 мм) наносят щелочную,фосфатазу из кишечника цыплят (ReanaE) в количестве 10 мг/г по следующей методике: 50 мг носителя заливают 4 мл раствора фермента,, рН 7,5, адсорбцию проводят при комнатной температуре в течение 4-5 ч при периодическом помешивании. Количество адсорбированного фермента определяют по уменьшению его активности в растворе над носителем. Адсорбция фермента прочная и практически необратимая, что показано многократным испытанием в буферном растворе с рН 7, в течение 2 недель.

Адсорбированная на зауглероженном щелочная фосфатаза сохраняет 50% активности от активности фермента в растворе. Активность фермента Определяется по скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата , Накопление продукта реакции п-нитрофенола peniCTрируется спектрофотометрически при длине волны 400 нм.

Через 2 недели хранения в буфере .с рН 7,5 сщсорбированная щелочная фосфатаза не потеряла своей первоначальной активности.

Пример 6.На зауглероженную окись алюминия (% С 24, 17 , размер частиц 0,25-0,40 мм) наносят лактатдегидрогеназу по мето- дике примера 3 в количестве 31 мг/г. Адсорбция практически необратима: при выдерживании в буферном растворе с рН 6,0 в течение 2 сут фермент над носителем не обнаруживается. Адсорбированная на зауглероженной

окиси алюминия лактатдегидрогеназа сохраняет 40% активности от активности фермента в растворе.

За неделю хранения в буферном растворе с рН 6,0 адсорбированный

фермент сохраняет 80% первоначальной активности.

Технико-экономическая эффектив ность предлагаемого способа заключается в значительном упроп1ении процесса, достигаемом за счет использования в качестве носителей отработанных катализаторов ряда нефтехимических производств, в частности крекинга углеводородов, а также в повыпеНИИ активности получаемых иммобилизованных ферментов.

Формула изобретения

Способ иммобилизации ферментов адсорбцией на углеродсодержащих носителях, отличающийся тем, что, с целью упрощения процессз и увеличения активности иммобилизованных ферментов, в качестве носителей используют окись алюминия, или окись кремния, или гшюмосиликаты, зауглероженные при пиролизе углеводородов .

Источники информации принятые во внимание при экспертизе

1. Жирков Ю. А., Чухрай Е. С., 45 Полторак О. М. и др. Адсорбционная иммобилизация щелочной фосфатаэы на карбохроме. Вест. Моск. ун-та. Сер. Химия, 1978, т. 19, 2, с. 127-132.