СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И/ИЛИ ОЧИСТКИ КЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ФЕРМЕНТАЦИОННОГО БУЛЬОНА ПОСРЕДСТВОМ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ Российский патент 2001 года по МПК C07D503/18 

Изобретение относится к процессу очистки и/или получения клавулановой кислоты и фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров клавулановой кислоты, в частности, но не исключительно, солей щелочных металлов, особенно клавуланата калия.

Клавулановая кислота - это тривиальное название для (2R,5R,Z)-30(2-гидроксиэтилиден)-7-оксо-4-окса-1- азабицикло[3,2,0] гептан-2-карбоновой кислоты. Клавулановая кислота и ее соли щелочных металлов и сложные эфиры являются активными ингибиторами бета-лактамазы, продуцируемой некоторыми грамположительными, а также грамотрицательными микроорганизмами. В дополнение к ингибированию бета-лактамазы, клавулановая кислота и ее соли щелочных металлов также обладают синергетическим действием с пенициллиновыми и цефалоспориновыми антибиотиками. Клавулановую кислоту и ее соли используют в фармацевтических средствах для предотвращения деактивации бета-лактамовых антибиотиков. Коммерческие средства содержат клавуланат калия в комбинации с тригидратом амоксициллина. Клавуланат калия более стабилен, чем свободная кислота или другие соли.

Клавулановую кислоту получают ферментацией микроорганизмом, таким как штаммы Streptomyces, такие как S.clavuligerus NRRL 3585, S.jumonjinensis NRRL 5741 и S.katsurahamanus IF013716 и Streptomyces sp. P6621FERM P2804. Водную культуру, полученную после ферментации, очищают и концентрируют в соответствии с традиционными способами, например посредством фильтрации и хроматографической очистки, как описано в патенте GB 1508977, предварительно с экстракцией водного раствора органическим растворителем для получения раствора неочищенной клавулановой кислоты в растворителе.

Известно [GB 1508977] получение клавуланатов посредством фильтрации ферментационного бульона путем пропускания через анионообменную смолу. Этот способ может обеспечивать приемлемые выходы, но требует сложных хроматографических методов очистки, а использование колонок со смолой обуславливает существенные инвестиции в производство в коммерческих масштабах.

Известен [GB 1543563] ферментационный способ, при котором значение pH среды поддерживают в интервале от 6,3 до 6,7. Фармацевтически приемлемые соли, такие как клавуланат калия, получают из клавуланата лития реакцией обмена.

Известно [ЕР-А-0026044] использование трет-бутиламинной соли клавулановой кислоты в качестве промежуточного соединения для очистки клавулановой кислоты. Известно [ВЕ-862211 или DE 2733230], что эта соль даже более стабильна, чем клавуланаты натрия или калия. Третичный бутиламин является токсичным соединением, а также трудно удаляемым из сточных вод, что порождает серьезные проблемы загрязнения окружающей среды.

Известно [ЕР-А-0562583] использование солей клавулановой кислоты с N, N'-моноэамещенными симметричными этилендиаминами, таких как N,N'-диизопропилэтилендиаммоний диклавуланат, в качестве полезных промежуточных соединений для выделения и получения чистой клавулановой кислоты или клавуланатов щелочных металлов из этилацетатного экстракта.

Обычно профильтрованный ферментационный бульон, содержащий клавулановую кислоту, может содержать от 10 до 20% белков в расчете на количество клавулановой кислоты. Эти белки мешают последующему выделению и очистке клавулановой кислоты. Обработка профильтрованного бульона ионообменными смолами или флоккулянтами занимает время, дорого стоит и может усилить разрушение нестабильного продукта.

Согласно настоящему изобретению предложен способ получения и/или очистки клавулановой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, включающий:
удаление твердых веществ из содержащего клавулановую кислоту ферментационного бульона посредством микрофильтрации с образованием первого фильтрата,
дальнейшее удаление твердых веществ из первого фильтрата посредством ультрафильтрации с образованием второго фильтрата,
концентрирование второго фильтрата путем удаления воды и
обработку концентрированного второго фильтрата с выделением клавулановой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира,
отличающийся тем, что первый фильтрат фильтруют с использованием мембраны для ультрафильтрации, имеющей отсечку молекулярной массы от 10 до 30 кДа и пропускающую способность от 10 до 30 л•м²•ч^-1.

Использование ультрафильтрации в соответствии с настоящим изобретением может дать раствор клавулановой кислоты, достаточно чистый, чтобы избежать какой-либо необходимости в образовании промежуточного амина или диаммониевой соли перед превращением в клавуланат калия. Кроме того, второй фильтрат можно концентрировать посредством обратного осмоса без засорения или образования нежелательного слоя геля на поверхности мембраны обратного осмоса. Скорость пропускания через аппарат обратного осмоса можно увеличить и можно избежать необходимости частой очистки.

Было обнаружено, что использование настоящего изобретения повышает эффективность выделения клавулановой кислоты и имеет еще преимущество в том, что второй фильтрат существенно обесцвечивается на стадии ультрафильтрации.

Микрофильтрацию бульона можно проводить, как описано в нашей заявке WO 95/23870. В предпочтительном способе согласно этому описанию водный ферментационный бульон, содержащий неочищенную клавулановую кислоту, мицелий, белки и другие суспендированные твердые вещества, очищают микрофильтрацией при pH между 5,8 и 6,2 и температуре от около 20 до 40^oC.

Ультрафильтрацию можно осуществлять, используя мембрану, содержащую полисульфон.

Дальнейшая обработка второго фильтрата предпочтительно включает в себя концентрирование посредством обратного осмоса. Этот фильтрат можно сконцентрировать до примерно 1/5 объема от первоначального объема с получением концентрированной водной клавулановой кислоты, которую можно экстрагировать серией центробежных противоточных экстракций не смешивающимся с водой растворителем, предпочтительно этилацетатом, например, как это описано в WO 95/23670.

Экстракцию предпочтительно проводят при температуре между 15 и 25^oC и pH между 1 и 3. Затем экстракт сушат до содержания воды ниже 0,1 об.%, далее концентрируют выпариванием и, при необходимости, обесцвечивают активированным углем.

Клавулановую кислоту в экстракте можно предварительно подвергнуть взаимодействию с амином или диамином для выделения клавуланата аммония или диаммония и превращения последнего в фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир. Альтернативно, концентрат можно подвергнуть взаимодействию непосредственно с донором металла до образования фармацевтически приемлемой соли, например соли калия.

Донором металла может быть органическая соль, карбонат, бикарбонат или гидроксид калия, натрия, лития или магния. Предпочтительно использовать органические соли, предпочтительно соли карбоновых кислот. Использовать соли калия предпочтительно с точки зрения сравнительной стабильности клавуланата калия.

Соли карбоновых кислот могут быть выбраны из ацетата, пропионата, гексаноата, бензоата и бензоата, замещенного одной или более чем одной C₁-C₄алкильной группой, предпочтительно C₁-C₄алкильной группой; галогеном; нитрогруппой; О, S или NR, замещенным гетероалкилом; C₁-C₁₀алкилом, замещенным группой: R; OR, SR, или NR¹R² где R, R¹ и R² независимо представляют собой C₁-C₄алкил.

Предпочтительные доноры металлов включают в себя 2-этилгексаноат калия, ацетат калия, 2-этилгексаноат лития и ацетат лития.

Можно добавлять дополнительный растворитель, который может содержать C₁-C₄спирт или его смеси. Использовать C₁-C₄спирты является предпочтительным. Особенно предпочтительные дополнительные растворители включают в себя метанол, этанол, изопропанол и изобутанол или их смеси. Использовать изопропанол особенно предпочтительно. Эти растворители предпочтительно являются сухими, например содержащими от 0 до 4% воды. Донор металла может быть растворен в дополнительном растворителе перед добавлением к клавулановому экстракту. Альтернативно, донор металла может быть растворен в том же самом растворителе, что и экстракт клавулановой кислоты, например этилацетате и дополнительном растворителе, добавленном отдельно.

В частности преимущественные результаты получают, когда 2-этилгексаноат калия растворяют в изопропаноле, ацетат калия растворяют в метаноле или бензоат калия растворяют в метаноле. Концентрация 2-этилгексаноата калия в изопропаноле предпочтительно может быть от 0,1 моль/л до 5 моль/л, более преимущественно от 1 моль/л до 2,5 моль/л и предпочтительно от 1,5 моль/л до 2 моль/л при молярном избытке от 0,8 до 5 в расчете на количество клавулановой кислоты, предпочтительно при молярном избытке от 5 до 25%.

Не смешивающийся с водой растворитель, используемый для экстракции фильтрата ферментационного бульона, предпочтительно выбирают из этилацетата, метилацетата, пропилацетата, н-бутилацетата, кетонов, таких как метилэтилкетон, спиртов, таких как н-бутанол, н-амиловый спирт, или галогенированных растворителей, таких как метиленхлорид, хлороформ, или простых эфиров, таких как диэтиловый эфир, или гексана, или их смесей. Использовать этилацетат является предпочтительным. Концентрат может быть очищен активированным углем и, при необходимости, на колонке из силикагеля.

Концентрация неочищенной клавулановой кислоты в сухом концентрированном экстракте не смешивающегося с водой растворителя, такого как этилацетат, может находиться между 8 г/л и 40 г/л, предпочтительно между 20 г/л и 40 г/л.

Концентрат клавуланата, предпочтительно в этилацетате, может быть обесцвечен добавлением активированного угля. Было найдено, что количество активированного угля от 0,2 до 0,5 г на грамм клавулановой кислоты достаточно, хотя по желанию можно использовать альтернативные количества.

Далее данное изобретение иллюстрируется примером, но не в каком-либо ограничивающем смысле.

Пример
Используют водный профильтрованный бульон, полученный ферментацией Streptomyces sp. P6621 FERM P2804 и микрофильтрацией, как описано в WO 95/23870. Микрофильтрат, имеющий содержание клавулановой кислоты 3,5 г/л, содержание белков 0,56 г/л и светопропускание при 420 нм (после разбавления водой 1:2) 27,9%, непрерывно добавляют в устройство для двухступенчатой фильтрации типа 2NUF2000 производства компании IMP Promont Ljubljana, Словения. Два промывочных модуля ультрафильтрации типа GR62-3833/47P производства компании Filmtech (филиала Dow Chemical Со) имеют два контура с общей площадью мембраны 194,4 м². Аппарат расположен так, чтобы ультрафильтрационные модули могли быть соединены параллельно или последовательно. Отсечка молекулярной массы мембран составляет 20 кДа. Профильтрованный бульон имеет температуру 35^oC, pH между 5,8 и 6,2, и пропускающая способность составляет 12 л•м^-2•ч^-1. Давление на мембрану составляет 5 бар, а разница продольного давления между концентратом и фильтратом составляет 1,4 бар. Жидкости получают посредством ультрафильтрации с первой ступени при скорости пропускания 1600 л/ч для фильтрата и 400 л/ч для концентрата. Концентрат с первой ступени ультрафильтрации используют для второй ступени ультрафильтрации и промывают деминерализованной водой со скоростью пропускания 800 л/ч. Скорость пропускания фильтрата из второй ступени ультрафильтрации составляет 800 л/ч, и этот фильтрат отправляют вместе с фильтратом из первого контура в устройство для обратного осмоса.

Содержащий клавулановую кислоту фильтрат, образующийся при обратном осмосе, получают при скорости пропускания 2400 л/ч, и он содержит 0,11 г/л белка. Светопропускание (420 нм) этого фильтрата составляет 45,1%, а выход составляет 95% в расчете на содержание клавулановой кислоты.

Таким образом, при осуществлении предложенного способа сокращают количество примесей, имеющих поглощение при 420 нм, что видно по увеличению светопропускания раствора на указанной длине волны с 27,9% (светопропускание микрофильтрата, т. е. первого фильтрата) до 45,1% (светопропускание фильтрата, полученного при концентрировании обратным осмосом, т.е. концентрированного второго фильтрата).

Изобретение относится к способу получения и/или очистки клавулановой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, включающему в себя удаление твердых веществ из содержащего клавулановую кислоту ферментационного бульона посредством микрофильтрации с образованием первого фильтрата, имеющего рН 5,8-6,2, дальнейшее удаление твердых веществ из первого фильтрата посредством ультрафильтрации с использованием мембраны из полисульфона, имеющей отсечку молекулярной массы от 10 до 30 кДа и пропускающую способность от 10 до 30 л•м^-2•ч^-1, с образованием второго фильтрата, дальнейшее его концентрирование путем удаления воды и обработка концентрированного второго фильтрата с выделением клавулановой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, при этом сокращается количество примесей, имеющих поглощение при 420 нм. Технический результат - повышение эффективности выделения и обесцвечивания клавулановой кислоты. 6 з.п. ф-лы.

1. Способ получения и/или очистки клавулановой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, включающий в себя удаление твердых веществ из содержащего клавулановую кислоту ферментационного бульона посредством микрофильтрации с образованием первого фильтрата, имеющего рН 5,8-6,2, дальнейшее удаление твердых веществ из первого фильтрата посредством ультрафильтрации с образованием второго фильтрата, концентрирование второго фильтрата путем удаления воды и обработку концентрированного второго фильтрата с выделением клавулановой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, отличающийся тем, что первый фильтрат фильтруют с использованием мембраны для ультрафильтрации, имеющей отсечку молекулярной массы от 10 до 30 кДа и пропускающую способность от 10 до 30 л•м^-2•ч^-1. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ультрафильтрация является непрерывной. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что непрерывную ультрафильтрацию проводят с использованием двухступенчатого аппарата. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что мембрана для ультрафильтрации содержит полисульфон. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что пропускающая способность мембраны составляет 12 л•м^-2•ч^-1. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что отсечка молекулярной массы составляет 20 кДа. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что сокращают количество примесей, имеющих поглощение при 420 нм.