СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2002 года по МПК C12P17/18 C12P17/18 C12R1/465 

Изобретение относится к способу получения клавулановой кислоты.

Клавулановая кислота - это общепринятое наименование для (2R, 5R, Z)-30(2-гидроксиэтилиден)-7-оксо-4-окса-1-азабицикло[3.2.0] гептан-2-карбоновой кислоты. Клавулановая кислота и ее соли с щелочными металлами, а также сложные эфиры активны в качестве ингибиторов бета-лактамазы, продуцируемой некоторыми грамположительными, а также грамотрицательными микроорганизмами. В добавление к ингибированию бета-лактамазы клавулановая кислота и ее соли с щелочными металлами обладают также синергическим действием с пенициллиновыми и цефалоспориновыми антибиотиками. Клавулановую кислоту и ее соли используют в составе фармацевтических препаратов для предотвращения дезактивации бета-лактамных антибиотиков. Коммерческие препараты содержат клавуланат калия в комбинации с амоксициллина тригидратом. Кпавуланат калия более стабилен, чем свободная кислота или другие соли.

Клавулановую кислоту получают посредством ферментации микроорганизмов, таких как штаммы Streptomyces, например S. clavuligerus NRRL 3585, S. jumonjinensis NRRL 5741, а также S. katsurahamanus IFO 13716 и Streptomyces sp. P6621 FERM P2804. Перед экстракцией водного раствора органическим растворителем с целью получения раствора неочищенной клавулановой кислоты в растворителе полученную после ферметации водную культуру очищают и концентрируют в соответствии с обычными способами, например фильтрацией и хроматографической очисткой, как описано (GB 1508977).

Известны (WO 95/23870 и WO 96/28452) улучшенные коммерческие способы очистки клавулановой кислоты и получения клавуланата калия. Рост продуцирующего антибиотик микроорганизма может включать две фазы; фазу роста, во время которой происходит рост биомассы, и последующую стационарную фазу, в течение которой роста не происходит. Продуцирование вторичных метаболитов, таких как антибиотики, обычно происходит во время стационарной фазы.

Способы периодической ферментации с подпиткой хорошо известны для производства антибиотиков и являлись предпочтительными для производства клавулановой кислоты. Контроль и поддержание желаемых уровней ассимилируемых источников азота и углерода в культуральной жидкости бульоне известны (Lee J.S. et al, Kor. Jour. Microbiol. 1978, Vol 15, No 1, р 21-29), где описано улучшение способа ферментации для получения пенициллина посредством контроля за добавлением источника ассимилируемых азота и углерода в соответствии с потребностями микрорганизмов в ферментаторе. Известно (Lilley G. et al, J. Chem. Tech. Biotechnol. 1981, Vol 31, р 127-134), что продуцирование антибиотиков видами Streptomyces можно контролировать посредством изменения концентрации источника ассимилируемых азота и углерода и источника фосфора. Так, например, продуцирование тиенамицина в ферментаторе не начинается до тех пор, пока концентрация фосфора не приблизится к нулю. Известно (ЕР 82522) использование в ферментации S. clavuligerus NRRL 3585 непрерывного или периодического добавления источника ассимилируемого углерода. Регулирование количества аммиака описано (WO 96/18743). Способы непрерывной ферментации для приготовления клавулановой кислоты не описаны.

В соответствии с данным изобретением способ получения клавулановой кислоты включает в себя ферментацию продуцирующих клавулановую кислоту видов Streptomyces в культуральной жидкости, содержащей ассимилируемые источники углерода и азота, причем концентрация фосфора в культуральной жидкости не превышает 0,15% мас./об.

Концентрацию фосфора в ходе фазы роста предпочтительно поддерживают ниже предела 0,15% мас. /об. , после чего концентрация фосфора может снижаться. Фаза роста для типичной ферментации клавулановой кислоты, длящейся в общей сложности до 5 или 6 дней, может быть завершена в течение около 40 часов. Источник ассимилируемого фосфора может быть представлен в виде соли - фосфата, например фосфата натрия или калия, дигидрофосфата натрия или калия или динатрий- или дикалий-гидрофосфата, или их смесей. Упоминаемая в данном описании концентрация фосфора определяется как процент мас./об. фосфора, эквивалентный количеству присутствующего ассимилируемого соединения фосфора.

Концентрация фосфора предпочтительно составляет от 0,0015 до 0,15% мас. /об. , а более предпочтительно - от 0,002 до 0,015% мас./об. Предпочтительно допускается, чтобы концентрация фосфора снижалась до низкого значения, предпочтительно - до нуля, к 40-му часу ферментации.

Регулирование количества ассимилируемого фосфора в соответствии с данным изобретением может дать неожиданно высокие выходы клавулановой кислоты.

Концентрация источника ассимилируемого углерода может быть подобрана с помощью обычных исследований, в зависимости от характеристик используемого штамма Streptomyces. Доля такого источника углерода, как глицерин, триолеат глицерина или кукурузный крахмал, в исходной среде может превышать 5% мас. /об., а во время ферментации в соответствии с обычными методами непрерывного культивирования с подпиткой могут быть добавлены дополнительные количества источника углерода.

Ассимилируемый азот может быть обеспечен посредством белкового вещества в исходной среде. В качестве альтернативы или дополнения в ферментатор может быть также введен аммиак. Аммиак использовали также для регулирования рН культуральной жидкости в ходе процесса ферментации. Тем не менее авторы данного изобретения обнаружили, что использование аммиака как в качестве единственного источника ассимилируемого азота, так и для регулирования рН нежелательно. Высокая концентрация аммиака может отравить микроорганизмы, а слишком низкий рН является причиной менее эффективного биосинтеза клавулановой кислоты. Соответственно предпочтительно, чтобы ассимилируемый источник азота, например соевая мука, был добавлен к исходной среде, а соль аммония, такую как сульфат аммония, добавляли во время процесса ферментации для обеспечения дополнительного азота по мере необходимости.

В соответствии с предпочтительным аспектом данного изобретения для контроля рН используют не содержащее азота соединение, предпочтительно - гидроксид аммония. Это приводит к более позднему снижению уровня биомассы, нежели при применении аммиака в качестве единственного источника азота и регулятора рН.

Источник ассимилируемого азота может представлять собой муку, например соевую муку или муку из семян хлопка. Количество ассимилируемого азота предпочтительно составляет от 0,5 до 15% мас./об., а более предпочтительно - от 1,5 до 7,5%. Количество азота преимущественно превышает 5%.

Данное изобретение относится, в частности, к ферментации видов Streptomyces S. clavuligerus NRRL 3585, S. jumonjinensis NRRL 5741, а также S. katsurahamanus IFO 13716 и в особенности Streptomyces sp. P6621 FERM P2804. Данное изобретение позволяет достичь улучшенного выхода клавулановой кислоты из S. clavuligerus. Данное изобретение находит частное применение для ферментации в коммерческих масштабах, в частности при объемах содержимого ферментатора, не превышающих 10⁴ л, а предпочтительно - 5•10⁴ л.

Культуральную жидкость можно обрабатывать, как описано в принадлежащей авторам данного изобретения заявке (WO 95/23870) или другими известными способами получения клавуланата калия высокой степени чистоты.

Изобретение дополнительно описано посредством примеров, не имеющих тем не менее никакого ограничивающего значения.

ПРИМЕР 1
А) КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Streptomyces sp: P6621 FERM P2804
Селекция и поддержание штаммов
Наиболее продуктивные клоны Streptomyces sp. P6621 FERM P2804 получали селекционными методами. Наиболее продуктивные культуры этого микроорганизма сохраняли и в дальнейшем использовали в качестве источника для новых циклов селекции.

Колонию Streptomyces sp. P6621 FERM P2804 асептически переносили в стерильный керамический сосуд, содержащий 2 см³ стерильной воды, и гомогенизировали. Фрагменты мицелия переносили на агаровый косяк и инкубировали в термостате при температуре 25^oС до созревания (в течение от 10 до 14 дней).

Через 8-10 дней поверхность агара была покрыта серо-зеленым бактериальным мицелием. С поверхности соскабливали споры, которыми асептически инокулировали в вегетативную посевную среду и инкубировали на качалке при 250 оборотах в минуту и при температуре 25±1^oС в течение 24 часов.

Гомогенная суспензия спор с агаровых косяков может храниться в снятом молоке (которое может быть использовано в качестве защитной среды) в течение более чем двух месяцев.

После завершения вегетативной стадии часть культуры асептически переносили в ферментационную среду и инкубировали на роторной качалке в течение 96 часов. После завершения ферментации анализировали содержание клавулановой кислоты. Культуры, дающие наибольшие выходы, использовали в качестве лабораторного инокулюма в ферментаторе.

Всю процедуру производили в асептических условиях.

Штаммы могут храниться на агаровом косяке при температуре 4^oС в течение максимум четырех недель, в снятом молоке при тех же условиях - в течение двух месяцев, а лиофилизированные штаммы могут храниться при температуре 4^oС годами.

Состав среды для селекции штамма для инокуляции в ферментатор
Состав для косяков и чашек Петри
Состав - Количество
Декстрин - 10 г
KH₂PO₄ - 1 г
MgSO₄•7H₂O - 1 г
NaCl - 1 г
(NH₄)₂SO₄ - 1 г
CaCO₃ - 4 г
Микроэлементы* - 1 см³
Агар - 20 г
Деминерализованная вода - До 1000 см³
Композицию готовили в соответствии с классическими способами.

Микроэлементы*
Состав - Количество
CaCl₂•2H₂O - 10,0 г
MgCl₂•6H₂O - 10,0 г
NaCl - 10,0 г
FeCl₃•6H₂O - 3,0 г
ZnCl₂ - 0,5 г
CuCl₂•2H₂O - 0,5 г
MnSO₄•H₂O - 0,5 г
Деминерализованная вода - До 1000 см³
Вегетативная среда для селекции штаммов
Состав - Количество
Кукурузный крахмал - 10,0 г
Соевая мука - 20,0 г
KH₂PO₄ - 0,6 г
Эстол (Priolube 1435) - 5,0 г
Водопроводная вода - До 1000 см³
Ферментационная среда для селекции штаммов
Состав - Количество
Кукурузный крахмал - 9,6 г
Соевая мука - 38,5 г
KH₂PO₄ - 1,2 г
Эстол (Priolube 1435) - 23,0 г
Глицерин - 5,0 г
Морфолин-пропан-сульфоновая кислота - 12,0 г
Микроэлементы* - 10,0 мл
Водопроводная вода - До 1000 мл
Приготовление лабораторного инокулюма
Исходную культуру для получения лабораторных инокулюмов выращивали с агарового косяка. Выбранный косяковый агар асептически заполняли стерильной водой (10 см³), споры соскабливали и гомогенизировали в стерильном фаянсовом сосуде. Раствор спор использовали в качестве лабораторного инокулюма.

ВЕГЕТАТИВНАЯ ФАЗА В ЧАНЕ ДЛЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ВЫРАЩИВАНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА
Среда для чана для предварительного выращивания посевного материала
Объем чана для предварительного выращивания посевного материала = 500 л
Объем среды = 350 л
Состав - Количество
Кукурузный крахмал - 7,0 кг
Соевая мука - 7,0 кг
NaH₂PO₄ - 0,185 кг
Эстол (Priolube 1435)* - 0,7 кг
Synperonic - 0,150 кг
Водопроводная вода - До 350 л
*Вместо эстола может быть использовано соевое масло.

Инокулюм переносили в среду, которую стерилизовали в чане для предварительного выращивания посевного материала и охлаждали стерильным воздухом до 28^oС. Вегетативная фаза продолжалась от 50 до 70 часов при температуре 28±1^oС, давлении 0,03 МПа, при аэрации стерильным воздухом и последовательном смешивании.

Параметры роста в чане для предварительного выращивания посевного материала представлены в табл.1.

ВЕГЕТАТИВНАЯ ФАЗА В ФЕРМЕНТАТОРЕ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА
Среда для ферментатора для выращивания посевного материала
Объем ферментатора для выращивания посевного материала = 7500 л
Объем среды = 4500 л
Состав - Количество
Кукурузный крахмал - 90,0 кг
Соевая мука - 90,0 кг
NaH₂PO₄ - 2,4 кг
Эстол (Priolube 1435)* - 9 кг
Synperonic - 0,5 кг
Вода - До 4500 л
*Вместо эстола может быть использовано соевое масло.

Вегетативную фазу из чана для предварительного выращивания посевного материала под давлением переносили в среду, которая была простерилизована в ферментаторе для выращивания посевного материлала и охлаждена стерильным воздухом до 28^oС. Воздух стерилизовали с помощью фильтров с размером пор 0,2 мкм.

Вегетативная фаза продолжалась от 10 до 20 часов при температуре 28±1^oС, давлении 0,03 МПа, при аэрации стерильным воздухом и постоянном перемешивании.

Рост оценивали по результатам анализа рН, PMV %, по обесцвечиванию метиленового красителя и посредством микроскопического исследования образцов.

Параметры роста в чане для предварительного выращивания посевного материала представлены в табл.2.

Б) ПЕРИОДИЧЕСКАЯ ФЕРМЕНТАЦИЯ Streptomyces sp. P6621 FERM P2804 В ФЕРМЕНТАТОРЕ
Среда для ферментаторов
Объем ферментатора = 90 000 л
Объем среды = 60 000 л
Состав - Количество
Кукурузный крахмал - 570 кг
Соевая мука - 2300 кг
NaCl - 6 кг
Эстол (Priolube 1435)* - 1680 кг
NaH₂PO₄ - 5 кг
MgCl₂•6H₂O - 7 кг
FeCl₃•6H₂O - 1,6 кг
ZnCl₂ - 0,5 кг
MnSO₄•H₂O - 0,1 кг
Synperonic - 25 кг
Вода - До 60 м³
Пояснения:
- Эстол - общеупотребительное наименование глицерина триолеата; (Priolube 1435 - зарегистрированный товарный знак Unichem GmbH, Германия);
- Synperonic (зарегистрированный товарный знак ICI, Великобритания) - пропиленгликолевый пеногаситель;
*Вместо эстола может быть использовано соевое масло.

4700 л культуры Streptomyces sp. РР 6621 FERM P2804 в вегетативной фазе роста из ферментатора для выращивания посевного материала посредством стерильного переноса инокулировали в стерильную исходную среду (60000 л) в ферментаторе из нержавеющей стали объемом 90000 л, оборудованном для перемешивания и доставки стерильного воздуха через фильтры с размером пор 0,2 мкм. Ферментационную среду и все впускные трубы стерилизовали и охлаждали стерильным воздухом до 24^oС. Ферментационную фазу из ферментатора для выращивания посевного материала поддерживали при 24-25^oС и 0,03 МПа. Питательную среду перемешивали и аэрировали в течение всей ферментации, а рН среды поддерживали на уровне 6,8-6,9 посредством добавления 25%-ного водного раствора гидроксида аммония. Ферментация продолжалась в течение 96 часов, и итоговая концентрация клавулановой кислоты составила 3580 мг/л.

Во время ферментации Streptomyces sp. PP 6621 FERM P 2804 источник фосфора и ассимилируемый источник азота (500 кг соевой муки в 5000 л воды и 25%-ный водный раствор гидроксида аммония) добавляли следующим образом:
Концентрация ассимилируемых источников фосфора и азота в культуральной жидкости (см. табл.3).

После 51-го часа ферментации концентрация фосфора была ниже определяемого предела.

Значение рН в первые часы роста культуры достигало почти 7,5. В течение этого времени происходило потребление фосфора и начиналось продуцирование клавулановой кислоты, вследствие чего рН снижалась и становился необходимым контроль рН среды для поддержания рН на оптимальном уровне.

ПРИМЕР 2
ПРОЛОНГИРОВАНИЕ ВЕГЕТАТИВНОЙ ФАЗЫ ФЕРМЕНТАЦИИ ПОСРЕДСТВОМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СУЛЬФАТА АММОНИЯ В КАЧЕСТВЕ АССИМИЛИРУЕМОГО ИСТОЧНИКА АЗОТА И ГИДРОКСИДА НАТРИЯ В КАЧЕСТВЕ РЕГУЛЯТОРА рН
Среду с таким же соотношением ингредиентов, как в Примере 1Б, помещали в два ферментатора из нержавеющей стали объемом по 500 л каждый. В первом ферментаторе ферментацию проводили при тех же условиях, что описаны в Примере 1Б. Условия ферментации во втором ферментаторе отличались от описанных в Примере 1Б только тем, что между 40-м и 60-м часами после инокулирования в культуральную жидкость добавляли 11%-ный водный раствор сульфата аммония в количестве 9 см³/л. Желаемый уровень рН поддерживали с помощью гидроксида натрия. После 60-го часа добавление источника азота прекращали. В течение ферментации анализировали являющуюся пропорциональной количеству биомассы вязкость культуральной среды. (см. табл.4).

Способ предусматривает культивирование продуцирующих клавулановую кислоту видов Streptomyces в культуральной жидкости, содержащей ассимилируемые источники углерода и азота, причем концентрация фосфора в культуральной жидкости во время фазы роста до 40 ч составляет менее чем 0,15% мас./об. После 40 ч ферментации допускают снижение концентрации фосфора и источник фосфора не добавляют. В качестве источника ассимилируемого азота предпочтительно используют муку или другие источники, но не аммиак. При определенных концентрациях источников углерода, азота, фосфора выращивают микроорганизмы видов Str. clavuligerus, Str. jumonjinensis, Str. Katsurahamanus или Str. sp. P 6621. Способ позволяет повысить выход клавулановой кислоты и применим для ферментаций в коммерческих масштабах (при объемах ферментаторов до 5•10⁴ л). 13 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения клавулановой кислоты, включающий в себя ферментацию продуцирующих клавулановую кислоту видов Streptomyces в культуральной жидкости, содержащей ассимилируемые источники углерода и азота, при котором источник фосфора присутствует в культуральной жидкости на начальной стадии, после начальной стадии ферментации в культуральную жидкость во время фазы роста до 40 ч добавляют дополнительный источник фосфора в концентрации от 0,0015 до 0,15%, и потом клавулановую кислоту выделяют из культуральной жидкости. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что снижение концентрации фосфора допускают после времени ферментации, равного 40 ч. 3. Способ по любому из пп. 1 и 2, отличающийся тем, что ко времени ферментации, равном 40 ч, концентрация фосфора составляет от 0,0015 до 0,15 % мас. /об. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанная концентрация фосфора составляет от 0,002 до 0,05 % мас. /об. 5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что после времени ферментации, равного 40 ч, ассимилируемый фосфор не добавляют. 6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что источник ассимилируемого азота не включает в себя аммиак. 7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что единственный источник ассимилируемого азота не является аммиаком. 8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что источник ассимилируемого азота представляет собой муку. 9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что источник ассимилируемого азота представляет собой сульфат аммония. 10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что концентрация источника поглощаемого азота составляет от 0,5 до 15 % мас. /об. 11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что источник ассимилируемого фосфора представляет собой фосфат натрия или калия, дигидрофосфат натрия или калия, или динатрий или дикалий гидрофосфат, или их смесь. 12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что микроорганизм представляет собой Streptomyces clavuligerus, Streptomyces jumonjinensis, Streptomyces katsurahamanus или Streptomyces sp. P6621. 13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что объем культуральной жидкости составляет свыше 10⁴ л. 14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что объем составляет 5•10⁴ л.