СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА Российский патент 2001 года по МПК A61K31/70 A61P43/00 

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано в экспериментальной и практической медицине и ветеринарии.

В качестве средств для коррекции энергетического обмена в настоящее время применяются рибозилированные производные пуринов: аденозинтрифосфат, входящий в состав таких препаратов как "Аденозинтрифосфорной кислоты динатриевая соль" (Россия), "Вита-иодурол" (Франция), аденозинмонофосфат (отечественные препараты: "Фосфаден", "Адениловая кислота"), инозин - препараты "Рибоксин" (Россия), "Инозие Ф" (Япония). Были предложены также отечественные препараты из мышц: "Мышечный адениловый препарат" ("МАП"), содержащий аденозинмонофосфат, и "Миоль", содержащий аденозинтрифосфат, аденозиндифосфат и аденозинмонофосфат. Механизм действия всех перечисленных препаратов включает как регуляторные эффекты, реализующиеся через пуринергетические рецепторы, так и непосредственное воздействие на метаболизм, осуществляемое не столько самими препаратами, сколько продуктами их распада.

К недостаткам препаратов пуриновых мононуклеидов и нуклеозидов относится то, что технология их производства весьма сложна и дорога. Кроме того, известно, что для фосфорилированных метаболитов, в частности адениновых мононуклеотидов клеточная мембрана непроницаема [Buhl M.R. //Dan. Med. Bull.-1982. - V.29, N 1, - P.1-26]. Под действием эктоферментов, располагающихся на внешней стороне плазматических мембран (экто-АТФаза, экто-АДФаза, экто-5'-нуклеотидаза, аденилатциклаза, эктонуклеотидтрансферазы, пирофосфогидролазы, неспецифические эктофосфатазы, эктопротеинкиназы) и ферментов крови происходит их дефосфорилирование [Алабовский В.В., Олейников О.Д., Рябова В. В. // Бюлл. эксперим.биологии и медицины. - 1990. - Т.109, N 5, - С.436-438; Дмитриенко Н.П. Пуриновый обмен и его регуляция в лимфоцитах. - Киев: Наукова думка, 1991. 200 с.; Berne R.M., Rubio R.// Adv. Cardiol.-1974.- V.12. - P.303-317; Cooper D.R., Lewis G.P., Lieberman G.E. et. al.// Thrombosis Research. - 1979. - V.14. - P.901-914.; Ronca-Testoni S., Borghini F.// J.Mol. Cell. Cardiol. -1982. -V. 14, N.3 - P.177-180], конечным продуктом которого является аденозин. При этом образуется также неорганический фосфат, что часто нежелательно, поскольку при многих заболеваниях, являющихся показаниями для применения препаратов пуриновых мононуклеотидов, имеет место эндогенная гиперфосфатемия, обусловленная катаболизмом собственных тканевых нуклеотидов.

Аденозин (как и другие нуклеозиды) способен проникать в клетку, однако значительная часть его катаболизируется внеклеточно под действием аденозиндезаминазы, локализованной на внешней поверхности цитолеммы [Дмитриенко Н.П. //Укр. биохим. журн. - 1981.-Т.53, N 1. - С.114-123.; Дмитриенко Н.П. Пуриновый обмен и его регуляция в лимфоцитах. - Киев: Наукова думка, 1991, 200 с.], в эндотелии кровеносных сосудов и форменных элементах крови [Trams E.G. , Lauter O.J.// Biochim.Biophys.Acta.- 1974. -V.346, N.2 - P. 180-197; Berne R. M. , Rubio R.// Adv.Cardiol.-1974.-V.12.-P.303-317], и пуриннуклеозидфосфорилазы, локализованной в эндотелиальных клетках, гладких мышцах сосудов и перицитах [Berne R.M., Rubio R.// Adv.Cardiol.-1974.-V.12.-P.303-317; Rubio R. , Berne R.M., Winn H.R.// Cerebral vascularsmooth muscle and its control/ Ed. by M. J.Perves. - Amsterdam: Elsevier-North Holland, 1978.-P.355-372]. Аденозиндезаминаза превращает аденозин в инозин, пуриннуклеозидфосфорилаза расщепляет инозин с образованием гипоксантина и рибозо-1-фосфата. Далее рибозо-1-фосфат под действием фосфорибомутазы может превращаться в рибозо-5-фосфат, который служит исходным субстратом для ряда биохимических процессов [Шульцев Г.П., Панченко В.М., Антонидзе А.В.// Нов. лекарств. препараты. Экспресс-информ. ВНИИМИ, 1979.-N 7.-C.8-14]. В частности, под действием фосфорибозилдисфосфатсинтетазы из рибозо-5-фосфата образуется фосфорибозилдифосфат - ключевой субстрат как синтеза пуринов de novo, так и реутилизации азотистых оснований [Buhl M.R.// Dan.Med.Bull.- 1982.- V.29, N 1. - P.1-26].

Рибозо-1-фосфат образуется также при катаболизме эндогенных нуклеозидов, превращающихся в соответствующее азотистое основание: аденозин - в аденин, гуанозин - в гуанин, инозина - в гипоксантин [Нуклеиновые кислоты /Под. ред. Э. Чаргаффа и Дж.Дэвидсона. - М., 1957.: Buhl M.R.// Dan.Med.Bull.-1982.-V. 29, N.1-P.1-26]. В условиях патологии скорость распада пуриннуклеотидов превышает скорость их образования из продуктов распада - рибозо-1-фосфата и азотистых оснований. Реутилизация азотистых оснований зависит от доступности фосфорибозилдифосфата, синтез которого лимитируется in vivo доступностью рибозо-5-фосфата [Дмитриенко Н.П. Пуриновый обмен и его регуляция в лимфоцитах. -Киев. : Наукова думка, 1991. 200 с.: Hershko A., Mager J.// Israel. J. Chem. - 1968. -V.6 -P.100-109; Pilz R.B., Willis R.C., Boss G.R.// J.Biol. Chem. -1984. -V. 259. N 5.-P.2927-2935], но не активностью фосфорибозилдифосфатсинтетазы [Hershko A., Mager J.// Israel. J.Chem.-1968.-V.6.-P.100-109] . Последняя в условиях снижения уровня АДФ, ее ингибитора [Buhl M.R. //Dan.Med.Bull.-1982.-V.29. N1.-P.1-26] и повышения содержания неорганического фосфата, активатора этого энзима [Hershko A., Mager J.// Israel. J.Chem. - 1968. -V.6.-P.100-109], способна даже возрастать. Таким образом, превышение рибозо-1-фосфата в фосфорибозилдифосфат чаще всего тормозится на стадии фосфорибомутазной реакции. Это может быть обусловлено ингибированием фосфорибомутазы неорганическим фосфатом [Головацкий И.Д., Цегельский А.А.// Укр. биохим. -1987.-Т. 59, N 5, C. 45-49], закономерно накапливающимся в условиях усиленного распада нуклеотидов. Использование же рибозо-1-фосфата для прямого ресинтеза пуриновых нуклеозидов не представляется возможным, поскольку пуриннуклеозидфосфорилазная реакция in vivo практически необратима [Buhl M. R.//Dan.Med.Bull. - 1982. - V.29, N1. - P.1-26].

Гипоксантин, образующийся в результате катаболизма экзогенных пуриновых мононуклеотидов и нуклеозидов, может вовлекаться в ксантиноксидазную реакцию и превращаться в мочевую кислоту, давая обострения подагры и ряда других заболеваний, связанных с нарушениями пуринового обмена. Кроме того, активация ксантиноксидазной реакции сопряжена с гиперпродукцией активных форм кислорода, усилением перекисного окисления липидов и повреждением биомембран [Киреев М.М., Конвай В.Д.// Патогенез и экспериментальная терапия терминальных состояний. - Омск, 1976. -С.44-45; Конвай В.Д.// Патолог.физиология и эксперим.терапия. - 1982. N 6.-C.78-81; Золин П.П., Конвай В.Д. // Бюл. экспер. биол. -1997. -Т.124, N 12.-С.629-631]. Это тем более опасно, что многие заболевания, при которых применяются препараты пуриннуклеотидов и нуклеозидов, сопровождаются накоплением эндогенного гипоксантина и других пуриновых оснований, образующихся в результате катаболизма нуклеотидов.

Цель настоящего изобретения - расширение ассортимента средств для коррекции энергетического обмена путем предложения средства, имеющего фармакотерапевтический эффект, сходный с эффектами пуриновых мононуклеотидов и нуклеозидов, используемых сейчас для коррекции энергетического обмена, но с меньшими побочными эффектами.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства для коррекции энергетического обмена предлагается использовать D-рибозу.

Рибоза в настоящее время применяется в качестве добавки к культуральным средам для некоторых микроорганизмов, а также в качестве реакции для химических, биохимических и физиологических исследований [Большая медицинская энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия, 1984. - Т.22. - С.279-280; Краткая химическая энциклопедия. - М., 1965. - Т.4. - С.673; Кочетков Н.К. и др. Химия углеводов. -М., 1957; Нуклеиновые кислоты /Под ред. Э.Чаргаффа и Дж.Дэвидсона.-М., 1957; Methods in carbohydrate chemistry/ Ed.by R.L.Whistler and M.L.Wolform. - New York, London, 1962; Michelson A.M. The chemistry of nucleosides and nucleotides. - London, New York, 1963].

Нами в серии экспериментов установлено, что рибоза, подобно существующим фармпрепаратам пуриновых мононуклеотидов и нуклеозидов, восполняет пул пуриновых мононуклеотидов, уменьшенный вследствие их катаболизма. При этом рибоза оказывает благоприятное воздействие и на интегральные показатели организма: выживаемость реанимированных животных, восстановление у них неврологического статуса и показателя общего состояния.

Эксперименты по изучению нарушений энергетического обмена и влияния на них рибозы проводились в 1989-97 гг. в Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии. Всего нами было использовано 302 беспородных белых крыс-самцов, содержащихся в обычных условиях вивария и получавших стандартный лабораторный корм [Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. - Киев: Вища школа, 1983.-383 с.]. Для воспроизведения состояния нарушения энергетического обмена нами была избрана модель механической асфиксии по [Шим Н.В./Патогенез и экспериментальная терапия терминальных состояний. - Омск, 1979. - С.57-62], технически не сложная и не сопряженная с использованием никаких фармакологических средств, за исключением эфира для наркоза. Из предыдущих наших работ было известно, при клинической смерти и постреанимационной болезни, вызванной 6,5-минутной механической асфиксией, резко усиливается катаболизм пуриновых мононуклеотидов, происходит накопление нуклеозидов и азотистых оснований, в том числе гипоксантина, ксантина и урата, что сопровождается активацией перекисного окисления липидов [Конвай В.Д.// Патолог. физиология и эксперим. терапия. - 1982. - N 6. - C.78-81; Конвай В.Д. Нарушение пуринового обмена в печени в постреанимационном периоде и его профилактика: Дисс. ... д-ра мед. наук.-Томск, 1988. - 426 л.].

Крыс, находящихся под легким эфирным наркозом, фиксировали в положении на спине, интубировали полиэтиленовой трубкой диаметром 2 мм или 2,5 мм (в зависимости от массы крысы) при помощи осветительного аппарата со световодом. Трубку фиксировали к верхней губе ниткой, прошитой сквозь губу, и полость рта тампонировали увлажненной салфеткой. После установления ритмичного дыхания трубку перекрывали на 6,5 мин, после чего проводили реанимационные мероприятия, состоящие из прямого массажа сердца и искусственного дыхания.

Сразу после восстановления сердцебиения (обычно это происходило через 4-5 мин от момента начала реанимации) в бедренную вену однократно вводили D-(-)-рибозу производства фирм "Fluka AG, Buchs SG" (Швейцария) или "Schuchardt Munchen" (Германия) в дозе 50 мг • кг^-1 массы тела, или двуктарно в дозе 200 мг • кг^-1 (второй раз - через 40 мин после начала реанимации), растворенную в 0,9% NaCl (2,5 мл • кг^-1). Эти группы крыс назывались соответственно "Реанимация + Рибоза" и "Реанимация + Рибоза 200". Животным группы "Реанимация" сразу после восстановления сердцебиения вводили вместо рибозы эквивалентный объем 0,9% NaCl. Крыс группы "Контроль" не подвергали асфиксации и вводили им 0,9% NaCl. Животных групп "Рибоза" и "Рибоза 200" не подвергали асфиксии и вводили им рибозу в дозах соответственно 50 и 200 мг • кг^-1 массы тела. Эти животные, так же как и крысы группы "Контроль", подвергались тем же воздействиям (эфирному наркозу, фиксации, интубации), за исключением асфиксии и реанимации.

В серии радиоизотопных исследований вместе с раствором рибозы или физраствором крысам сразу после восстановления сердцебиения внутривенно вводили ¹⁴C-гипоксантин в дозе 2 МБк • кг^-1 массы тела (для изучения межорганного и межтканевого перераспределения гипоксантина) или 740 кБк • кг^-1 (для изучения метаболизма гипоксантина). Забой животных и забор тканей для исследований производились под эфирным наркозом.

Полученные цифровые данные подвергали статической обработке с использованием параметрических и непараметрических методов.

Установлено, что после того, как пул пуриновых мононуклеотидов в мозге, печени и сердце крыс был истощен под действием 6,5-минутной асфиксии, внутривенное введение D-рибозы в дозе 50 мг • кг^-1 приводило к его восполнению через 30 мин после начала реанимации. Благоприятный эффект рибозы, скорее всего, реализуется через превращение ее в рибозо-5-фосфат под действием рибокиназы, с последующим синтезом фосфорибозилдисфосфата и усилением реутилизации азотистых оснований. На такой механизм действия рибозы указывают следующие наблюдения. Включение ¹⁴C-гипоксантина в пуриновые мононуклеотиды печени статистически достоверно уменьшилось через 30 мин после реанимации по сравнению с контрольными крысами. А в группе крыс, которым сразу после реанимации вводили рибозу, данный показатель не только не снижался, но даже был несколько выше контроля. Включение меченого гипоксантина в пуриновые мононуклеотиды мозга у леченных рибозой крыс также было выше контрольного уровня. В сердце и клетках крови реанимированных животных, получавших рибозу, образование пуриновых мононуклеотидов из гипоксантина было выше, чем у крыс, реанимированных без рибозы.

Активируя включение гипоксантина в пуриннуклеотиды, рибоза тем самым предотвращала его окисление ксантиноксидазой до ксантина и мочевой кислоты. Содержание урата в крови крыс, леченных рибозой в дозе 50 мг • кг^-1, через 30 мин после начала реанимации было ниже, чем у нелеченных и контрольных животных. При этом выработка ксантиноксидазой супероксидных радикалов и перекиси водорода и активация ими перекисного окисления липидов также поддавалась коррекции рибозой. Содержание продуктов липопероксидации - диеновых конъюгатов, триеновых конъюгатов и липофусцинподобного пигмента в печени крыс, реанимированных без лечения, было выше, чем у контрольной группы, а при лечении рибозой - не отличалось от контроля. Изучение общих биохимических показателей печени: содержания в ней белка, липидов, холестерина, триглицеридов, активности лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, альфа-амилазы не выявило статистически достоверных различий между группами.

Известно, что интенсивность проникновения гипоксантина в клетку может зависеть от интенсивности его внутриклеточного метаболизма [Vincent M.-F., Van der Berghe G. , Hers H.-G.// Biochem.J.-1984.-V.222, N 1.-P.145-155]. Изучение межорганного и межтканевого перераспределения ¹⁴C-гипоксантина позволило выявить дополнительные механизмы действия рибозы. Было обнаружено, что на 30-й минуте постреанимационного периода у нелеченных крыс увеличивалось общее включение метки в кору больших полушарий мозга (особенно в сенсомоторную кору), в таламусы и другие подкорковые структуры мозга. В группе крыс, леченных рибозой в дозе 50 мг • кг^-1, включение гипоксантина в структуры мозга было ниже, чем в группе без лечения. Включение ¹⁴C-гипоксантина в хлорнокислый экстракт цельного мозга изменялось аналогичным образом. Таким образом, рибоза ограничивает поступление в мозг экстрацеребрального гипоксантина и тем самым снижает опасность повреждения нейронов активными формами кислорода при окислении гипоксантина ксантиноксидазой, активность которой в тканях мозга весьма высока [Wajner M., Harkness R.A.// Biochim.Biophys.Acta. -1989.-V.991.- P.79-84]. Введение рибозы в дозе 50 мг • кг^-1 здоровым животным приводило к достоверному снижению радиоактивности хлорнокислого экстракта цельного мозга и общей радиоактивности таламусов по сравнению с контролем.

В условиях накопления в организме гипоксантина усиленное включение его в печень - основной орган метаболизма гипоксантина [Vincent M.-F., Van der Berghe G. , Hers H.-G.//Biochem.J.-1984.-V.222, N. 1 -P. 145-155] имело бы компенсаторное значение. Однако включение ¹⁴C-гипоксантина в печень через 30 мин после реанимации без лечения остается на контрольном уровне и статистически достоверно усиливается лишь в группе крыс, которым вводилась рибоза. Радиоактивность крови через полчаса после реанимации увеличивалась, причем в группе без лечения - за счет форменных элементов, а в группе с лечением рибозой - за счет плазмы. Включение ¹⁴C-гипоксантина в кишечник, сердце и надпочечники крыс перечисленных групп не отличалось достоверно от контроля, включение же в другие органы и ткани (корковый и мозговой слои почек, селезенка, тимус, легкие, поджелудочная железа и т.д.) изменялось в каждом случае своеобразно, в соответствии с тканевой спецификой. Введение рибозы в дозе 50 мг • кг^-1 здоровым животным не приводило к достоверному изменению включения метки в экстрацеребральные ткани.

Через 30 мин после реанимации в группах крыс без лечения и с лечением рибозой, а также в группе с введением рибозы здоровым животным содержанием в плазме общего белка, мочевины, креатинина, глюкозы, холестерина и триглицеридов, а также общих липидов не отличалось достоверно от контроля. Содержание в плазме и эритроцитах продуктов перекисного окисления липидов также существенно не изменялось.

В отдельной серии экспериментов изучали сравнительное влияние рибозы и ее ближайшего аналога - инозина на показатель общего состояния реанимированных крыс, измерявшийся по [Лысенков С.П., Корпачев В.Г., Тель Л.З.// Клиника, патогенез и лечение неотложных состояний. - Новосибирск, 1982. - С. 8-13] , выраженность у них неврологического дефицита, измерявшегося по [Hendrickx H.H.L., Rao G.R., Safar P., Gisvold S.E.// Resuscitation.-1984.-N 12. - P.97-116], и выживаемость животных в постреанимационном периоде. Было установлено, что в группе крыс, котором в процессе реанимации сразу после восстановления кровообращения вводили рибозу в дозе 50 мг • кг^-1, выраженность неврологического дефицита была достоверно ниже, чем у крыс, реанимированных без лечения (то есть с введением физраствора). У животных, леченных по той же схеме инозином, вводившимся в эквимолярной по отношению к рибозе дозировке (16 мг•кг^-1), неврологический дефицит тоже уменьшался, но недостоверно. Влияние однократного введения рибозы на показатель общего состояния реанимированных крыс также было более выраженным, чем влияние инозина, и продолжалось дольше. При этом введение реанимируемым крысам рибозы в дозе 50 мг • кг^-1, равно как и инозима в эквимолярной дозировке не приводило к статистически значимому снижению постреанимационной летальности.

Введение крысам рибозы в дозе 200 мг • кг^-1, помимо благоприятного влияния на показатель общего состояния реанимированных крыс и восстановление у них неврологического статуса, приводило к снижению летальности через 3 сут после реанимации с 39% в группе без лечения до 10% в группе с введением раствора рибозы. Достоверность различия составили P=0,02 по непараметрическому критерию Фишера, что можно считать статистически достоверным [Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам. - М.: Медицина, 1990. - 224 с.].

Таким образом, введение реанимированным крысам рибозы оказывает благоприятное действие на интегральные показатели организма: выживаемость животных, восстановление у них неврологического статуса и показателя общего состояния. Эффект рибозы, вводившийся в дозе 50 мг • кг^-1, был более выражен, чем эффект ее ближайшего фармакопейного аналога инозина (фармпрепараты инозина -"Рибоксин", "Инозин Ф"), вводившегося в эквимолярной дозировке. Полученные нами результаты биохимических и радиоизотопных исследований свидетельствуют о том, что фармакотерапевтическое действие экзогенной рибозы связано с ее превращением в рибозо-5-фосфат, из которого затем синтезируется фосфорибозилдифосфат, являющийся ключевым субстратом синтеза пуринов de novo и реутилизации азотистых оснований. Показано, что экзогенная рибоза усиливает реутилизацию гипоксантина в печени, мозге и сердце, вследствие чего предотвращает его вовлечение в ксантиноксидазную реакцию и активацию перекисного окисления липидов. Благодаря усилению реутилизации азотистых оснований, а также, возможно, другим механизмам, рибоза восполняет пул пуриновых мононуклеотидов, уменьшенный вследствие асфиксии, тем самым способствуя нормализации энергетического обмена.

Изобретение относится к области фармакологии и касается средства для коррекции энергетического обмена. Изобретение заключается в том, что средство представляет собой раствор для парентерального введения в дозах 50-200 мг/кг массы тела. Изобретение обеспечивает эффект, сходный с эффектом пуриновых мононуклеотидов и нуклеозидов, используемых для коррекции энергетического обмена, но с меньшими побочными эффектами.

Средство для коррекции энергетического обмена на основе D-рибозы, отличающееся тем, что оно представляет собой раствор для парентерального введения в дозах 50 - 200 мг/кг массы тела.