Способ профилактики ишемических и реперфузионных повреждений нейронов гиппокампа в постреанимационном периоде Российский патент 2019 года по МПК A61K33/14 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к средствам терапевтического воздействия, основным компонентом которых является хлорид лития (LiCl). Изобретение может быть использовано в нейрохирургии, неврологии, кардиохирургии, реаниматологии, а также для дальнейшей разработки медикаментозных средств и лечении больных, перенесших остановку кровообращения, в качестве компонента комплексных реанимационных мероприятий, направленных на купирование неврологических осложнений, связанных с постгипоксической энцефалопатией, а также воздействием токсинов, образующихся вследствие реперфузионных повреждений на организменном уровне.

Уровень техники

Известны средство для сдерживания повреждения нейронов при ишемическом инсульте головного мозга (ГМ), представляющее собой генетический материал, состоящий из гена сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF, гена глиального нейротрофического фактора GDNF и гена нейрональной молекулы адгезии NCAM и способ клеточно-опосредованной генной терапии ишемического инсульта ГМ с помощью интратекального введения терапевтически эффективной дозы средства сдерживания гибели нейронов, в течение 4-х часов после наступления ишемического инсульта ГМ (RU 2676701).

Недостатками известного способа являются: интратекальное введение препарата, что делает невозможным его использование у постреанимационных больных, перенесших остановку кровообращения, отсутствие стандартизации в получении препарата, сдерживающего повреждение нейронов, а также направленность только на уменьшение ишемических повреждений при полном отсутствии учета патогенного влияния реперфузионного компонента у пациентов, перенесших клиническую смерть.

Известно также использование 4-(2-гидроксиэтил)-фенола (п-тирозола) в качестве средства, стимулирующего нейрогенез при ишемических повреждениях ГМ (RU 2585094). Однако, имеют место причины, по которым результаты, полученные авторами известного способа, не могут быть оценены однозначно. К ним относится методика проведения эксперимента, а именно:

- использование модели глобальной транзиторной ишемии ГМ, когда сосудистыми зажимами на определенное время перекрывается кровоток по 3-м церебральным сосудам, что не позволяет получить, а, следовательно, и оценить эффективность влияния способа на воздействие токсинов реперфузионного происхождения генерализованного характера (появляющихся после восстановления кровообращения при клинической смерти);

- выведение животных из эксперимента на 31-й день, что существенно снижает достоверность полученных результатов и не всегда свидетельствует только о влиянии используемого препарата, введение которого осуществляли только на протяжении первых 10 дней, так как в столь продолжительном периоде оказывают свое влияние и физиологические механизмы компенсации нейрогенеза, а также могут практически полностью нивелироваться последствия локальной ишемии.

Известно также комбинированное лекарственное средство для первичной нейропротекции, содержащее глицин и тиотриазолин (RU 2636616). Однако, результативность использования данного способа подлежит сомнению также как в предыдущем случае. Недостатками данного способа, обусловленными методикой проведения эксперимента являются:

- моделирование острого нарушения мозгового кровообращения путем односторонней перевязки общей сонной артерии, что у крыс является физиологически недостаточным элементом для развития ишемической альтерации нейронов;

- оценка лечебного эффекта предлагаемой смеси препаратов по активности в сыворотке цереброспецифического изофермента КФК - ВВ-КФК (маркера повреждения ГМ), по содержанию в гомогенате коры головного мозга пирувата, лактата, маната, изоцитрата, активности сукцинатдегидрогеназы, цитохром-С-оксидазы, глутаматдекарбоксилазы, ГАМК-трансферазы, что является методологически не верным подходом, так как референсным методом диагностики ишемических повреждений в эксперименте является морфологическое исследование;

- использование модели локальной ишемии ГМ, которая не позволяет получить, а, следовательно, и оценить эффективность влияния способа на воздействие токсинов реперфузионного происхождения генерализованного характера (появляющихся после восстановления кровообращения при клинической смерти).

Наиболее близким к заявляемому способу по совокупности существенных признаков является применение нового водорастворимого производного гамма-аминомасляной кислоты - 4-[(4-ацетоксибензоил)амино]бутирата лития в качестве средства для лечения ишемических нарушений мозгового кровообращения (RU 2617233). Выбран в качестве прототипа.

Использование указанного в прототипе соединения основано на ином, по сравнению с заявляемым способом, патофизиологическом механизме действия, который состоит в том, что первое введение препарата в эксперименте за 30 минут до моделирования ишемии ГМ (путем перевязки артерий) категорически не соответствует клиническим реалиям возникновения нарушений мозгового кровообращения и, следовательно, не может полностью транслироваться в практику. Кроме того, проводимое определение эффективности используемого препарата по шкале неврологического дефицита McGrow не является специфическим для ишемического повреждения ГМ, не относится к референсным методам и не может однозначно свидетельствовать о значимости полученных результатов. Используемая модель локальной ишемии ГМ, не позволяет получить, а, следовательно, и оценить эффективность влияния указанного соединения на воздействие токсинов реперфузионного происхождения генерализованного характера (появляющихся после восстановления кровообращения при клинической смерти).

Из уровня техники неизвестно использование хлорида лития в качестве средства для предотвращения повреждения высокочувствительных к гипоксии нейронов гиппокампа в результате воздействия токсинов, образующихся вследствие как локального, так и генерализованного воздействия ишемии и реперфузии в постреанимационном периоде после временной остановки системного кровообращения.

Раскрытие изобретения

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи предотвращения повреждения высокочувствительных к гипоксии нейронов гиппокампа в постреанимационном периоде после временной остановки кровообращения.

Поставленная задача решается тем, что предотвращение повреждения нейронов гиппокампа в постреанимационном периоде достигают путем однократного внутривенного введения 4,2% раствора LiCl в дозе 40 мг/кг сразу после восстановления спонтанной сердечной деятельности и последующим введением препарата на 1-е, 2-е и 3-и сутки после реанимации.

Преимуществом заявляемого способа по сравнению с известными способами является лечебное воздействие раствора LiCl, позволяющее нивелировать последствия влияния как ишемии нейронов, так и действия патогенных экстрацеребральных факторов, возникающих в условиях генерализованной реперфузии.

Указанный терапевтический эффект был четко показан на примере максимально приближенной к клинической картине модели ишемического и реперфузионного повреждения нейронов ГМ после восстановления спонтанной сердечной деятельности.

Ишемические и реперфузионные (генералирализованного и местного характера) повреждения мозга были изучены авторами заявляемого способа на гиппокампе, который характеризуется высокой чувствительностью к гипоксии, и имеет большое значение в высшей нервной деятельности организма. Гиппокамп, являясь центральным структурным элементом лимбической системы мозга, принимает участие в процессах обучения и памяти.

Описание процедуры эксперимента

Эксперименты проводились согласно рекомендациям Этического комитета НИИ общей реаниматологии имени В.А. Неговского в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР №755 от 12.08.1977) на белых нелинейных половозрелых крысах-самцах (масса 180-280 г). У животных под наркозом (хлоралгидрат 0,8-1 мл 6%) вызывали 10-минутную остановку сердца путем внутриторакального пережатия сосудистого пучка сердца [Корпачев В.Г. Моделирование клинической смерти и постреанимационной болезни у крыс / В.Г. Корпачев, С.П. Лысенков // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1982. - №3. - С. 78-80]. Реанимационные мероприятия включали в себя непрямой массаж сердца в сочетании с искусственной вентиляцией легких воздухом в режиме гипервентиляции аппаратом «Animal Respirator» фирмы «SMT Geratehandel» с внутритрахеальным введением раствора адреналина в дозе 0,1 мг/кг. 9-ти крысам (основная группа леченных животных) вводили 4,2% раствор LiCl в дозе (40 мг/кг в/в), сразу после восстановления сердечной деятельности, в последующем на 1-е, 2-е и 3-й сутки после реанимации (40 мг/кг в/б, соответственно). 9 нелеченых животных (группа сравнения) получали эквивалентные объемы физиологического раствора на 1-е и 2-е сутки после реанимации. Контролем служили ложнооперированные крысы (n=10), которым под наркозом выполняли разрез кожи и ее ушивание без пережатия сосудистого пучка сердца.

Через 7 дней после реанимации животных выводили из эксперимента декапитацией под наркозом (хлоралгидрат). Немедленно извлекали мозг, выделяли его сегменты, содержащие гиппокамп, и фиксировали их в растворе Карнуа 3,5 ч и заливали в парафин по стандартной методике. Для морфометрического исследования фронтальные срезы толщиной 5-6 мкм, окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля. На изображениях срезов гиппокампа, полученных с помощью светового микроскопа AXIO Imager.A2 и цифровой камеры AxioCamMRc5 (Carl Zeiss, Германия) при увеличении об. ×40, с использованием программы ImageScopeM (ООО «Системы для микроскопии и анализа», Россия) слепым методом вручную подсчитывали число нормальных пирамидных нейронов в полях СА1 и СА3/СА4 гиппокампа левого полушария (Фиг. 1).

Полученный показатель пересчитывали на 1 мм длины пирамидного слоя гиппокампа. К категории нормальных, сохранивших жизнеспособность, нейронов относили клетки с четко очерченным ядром эллипсоидной или круглой формы и ясно различимым ядрышком, расположенным в центре ядра.

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 7.0 с использованием метода ANOVA для множественных сравнений (Post-hog comparisons of means).

Анализ полученных данных показал, что через 7 суток после 10-минутной остановки кровообращения происходит снижение числа морфологически неизмененных, нормальных нейронов у нелеченных реанимированных животных в сравнении с группой ложнооперированных крыс - в поле СА1 гиппокампа - на 35,8% (р<0,001).

В поле СА3/СА4 ишемия-реперфузия приводила к менее выраженному повреждению - число жизнеспособных нейронов было уменьшено на 15,9% (р<0,025) в сравнении с контролем (Фиг. 3).

В группе реанимированных крыс с введением раствора LiCl число жизнеспособных нейронов не отличалось от числа таковых у контрольных животных как в поле СА1 (р>0,05), так и в поле СА3/СА4 гиппокампа (р>0,05). При этом у леченых животных в сравнении с нелеченными число жизнеспособных нейронов повышалось - в поле СА1 на 30,4% (р<0,05), в поле СА3/СА4 на 14% (р<0,05).

Таким образом, при использовании заявляемого способа было установлено, что лития хлорид обладает выраженным нейропротективным эффектом, который проявляется в сохранении жизнеспособности пирамидных нейронов полей СА1 и СА3/СА4 гиппокампа в постреанимационном периоде, снижая деструктивное влияние токсинов, генерализовано накапливаемых в организме в результате реперфузионных повреждений после восстановления системного кровообращения.

Краткое описание иллюстраций

На Фиг. 1 представлена микрофотография области гиппокампа. Примечание: PCL - слой пирамидных нейронов (pyramidal cell layer); СА1, СА3, CA4 - поля СА1, СА3, СА4 (subfields). Ув. об. ×5.

На Фиг. 2 представлены микрофотографии гистологических срезов гиппокампа, демонстрирующие снижение плотности жизнеспособных нейронов в поле СА1 гиппокампа в постреанимационном периоде. Сектор А - контрольные (ложнооперированные) крысы, сектор В - реанимированные нелеченные крысы (группа сравнения), сектор С - реанимированные крысы (основная группа) с введением раствора LiCl. Сектор D - диаграмма плотности нейронов в разных экспериментальных группах. Данные представлены в виде М±m.** - р<0,025 в сравнении с контролем; * - р<0,05 в сравнении с нелеченными реанимированными животными.

На Фиг. 3 представлены микрофотографии гистологических срезов гиппокампа, демонстрирующие снижение плотности жизнеспособных нейронов в поле СА3/4 гиппокампа в постреанимационном периоде. Сектор Е - гистологические срезы гиппокампа контрольных (ложнооперированных) крыс, сектор F - реанимированных нелеченных крыс (группа сравнения), сектор G - реанимированных крыс (основная группа) с введением раствора LiCl. Сектор Н - диаграмма плотности нейронов в разных экспериментальных группах.

Заявленное изобретение относится к области медицины и представляет собой способ предотвращения ишемических и реперфузионных повреждений нейронов гиппокампа в постреанимационном периоде, включающий использование солей лития, отличающийся тем, что в качестве средства для предотвращения ишемических и реперфузионных повреждений нейронов гиппокампа в постреанимационном периоде используют 4,2% раствор лития хлоридя в дозе 40 мг/кг путем однократного внутривенного введения сразу после восстановления спонтанной сердечной деятельности и последующего введения на 1-е, 2-е и 3-й сутки после реанимации. Использование заявленного изобретения позволяет нивелировать последствия влияния как ишемии нейронов, так и действия патогенных экстрацеребральных факторов, возникающих в условиях генерализованной реперфузии. 3 ил., 1 пр.

Способ предотвращения ишемических и реперфузионных повреждений нейронов гиппокампа в постреанимационном периоде, включающий использование солей лития, отличающийся тем, что в качестве средства для предотвращения ишемических и реперфузионных повреждений нейронов гиппокампа в постреанимационном периоде используют 4,2% раствор лития хлоридя в дозе 40 мг/кг путем однократного внутривенного введения сразу после восстановления спонтанной сердечной деятельности и последующего введения на 1-е, 2-е и 3-й сутки после реанимации.