ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 2001 года по МПК A61K35/54 A61K35/66 A61P31/04 

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарии и медицины и может быть использовано для профилактики и лечения инфекционных болезней рыб, животных и человека, вызываемых микроорганизмами.

Использование лизоцима яичного белка в качестве бактериолитического фермента широко известно [1, 2].

К недостаткам использования лизоцима можно отнести узкий спектр его действия, так как он не оказывает литического действия на целый ряд микроорганизмов, в том числе и патогенных.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является препарат, полученный путем смешения лизоцима и зимолазы [3].

К недостаткам препарата можно отнести узкий спектр его действия на микроорганизмы, особенно бактерии.

Целью предлагаемого изобретения является повышение активности и расширение спектра антимикробного действия ферментного препарата.

Для достижения поставленной цели предлагается препарат, содержащий смесь лизоцима яичного белка с препаратами микробного лизоцима.

Определенное соотношение указанных ингредиентов позволяет резко увеличить активность препарата и расширить спектр его действия.

Предлагаемое соотношение ингредиентов в препарате следующее:
лизоцим яичного белка: микробный лизоцим - 1 : 1-2 (по активности).

Реализация предложения демонстрируется следующими примерами.

Пример 1.

1.1. Определение активности препарата
Активность лизоцима определяли по уровню снижения оптической плотности суспензии микроорганизма Micrococcus lysodeikticus.

Микроорганизм Micrococcus lysodeikticus суспендировали в 0,05 М трис-буфере pH 7,0, вносили растворы ферментов с концентрацией в реакционной смеси, равной 0,5 мкг/мл, и инкубировали при температуре 37^oC в течение 60 мин.

Оптическую плотность суспензии измеряли на КФК-2 при длине волны 590 нм в кювете с расстоянием между стенками 1 см.

Расчет величины активности препаратов проводили по формуле

где D₁ - начальная оптическая плотность реакционной смеси;
D₂ - конечная оптическая плотность реакционной смеси;
t - время инкубирования реакционной смеси, мин;
с - концентрация ферментного препарата в смеси, мкг/мл;
1 000 000 - коэффициент пересчета из мкг в г.

Результаты измерений приведены в таблице 1.

1.2. Выбор оптимального соотношения ингредиентов.

Для определения оптимального соотношения ингредиентов в препарате микроорганизм Micrococcus lysodeikticus суспендировали в 0,05 М трис-буфере pH 7,0; вносили растворы смесей ферментов при различных их соотношениях (по активности), концентрация ферментной смеси в реакционной среде составляла 1,0 мкг/мл и инкубировали при температуре 37^oC в течение 60 мин.

Результаты измерений представлены в таблице 2.

Из приведенных данных видно, что все изученные ферментные смеси в соотношении 1: 1 -2 (по активности) в несколько раз превосходят по лизоцимной активности используемые для их составления ингредиенты (см. табл. 1).

Пример 2.

Приготовление препарата для профилактики и лечения инфекционных болезней.

Препарат для профилактики и лечения инфекционных болезней готовили путем простого смешения лизоцима яичного белка с препаратом микробного лизоцима при соотношении компонентов, равном 1:1-2 по активности по следующей схеме:
2.1. 10 г кристаллического лизоцима яичного белка с активностью 14400 ед/г смешивали с 13 г протосубтилина Г10Х с лизоцимной активностью 1100 ед/г (соотношение компонентов по активности - 1:1).

В результате получили 23 г препарата с активностью 20000 ед/г.

Препарат оценивали на основании коэффициента выхода активности, который рассчитывали следующим образом.

а. Расчет теоретического выхода активности препарата:
A_т = (A_л • P_л) + (A_мл • P_мл), ед,
где A_т - теоретический выход активности, ед;
A_л - активность лизоцима яичного белка, ед;
P_л - количество лизоцима яичного белка, взятое для получения препарата, г;
A_мл - активность препарата микробного лизоцима, ед;
P_мл - количество микробного лизоцима, взятое для получения препарата, г.

б. Расчет экспериментального выхода активности:
A_э = A_фп • P_фп, ед,
где A_э - экспериментальный выход активности, ед;
A_фп - активность полученного ферментного препарата, ед;
P_фп - количество полученного ферментного препарата, г.

в. Расчет коэффициента выхода активности в препарате:
K = A_э/A_т,
где A_э - экспериментальный выход активности, ед;
A_т - теоретический выход активности, ед.

2.1.1. Характеристика полученного препарата:
A_т = (14400 • 10) + (1100 • 13) = 158300 ед.

A_э = 20000 • 23 = 460000 ед.

K = 460000 / 158300 = 2,9.

Таким образом, из приведенных расчетов следует, что выход активности препарата в 2,9 раза превышает суммарную активность компонентов, взятых для его приготовления.

2.2. 10 г кристаллического лизоцима яичного белка с активностью 14400 ед/г смешивали с 19,6 г протосубтилина Г10Х с лизоцимной активностью 1100 ед/г (соотношение компонентов по активности - 1:1,5).

В результате получили 29,6 г препарата с активностью 20100 ед/г.

2.2.1. Характеристика полученного препарата:
A_т = (14400 • 10) + (1100 • 19,6) = 165560 ед.

A_э = 20100 • 29,6 = 594960 ед.

K = 594960 / 165560 = 3,6.

Таким образом, из приведенных расчетов следует, что выход активности препарата в 3,6 раза превышает суммарную активность компонентов, взятых для его приготовления.

2.3. 10 г кристаллического лизоцима яичного белка с активностью 14400 ед/г смешивали с 26 г протосубтилина Г10Х с лизоцимной активностью 1100 ед/г (соотношение компонентов по активности - 1:2).

В результате получили 36 г препарата с активностью 20100 ед/г.

2.3.1. Характеристика полученного препарата:
A_т = (14400 • 10) + (1100 • 26) = 172600 ед.

A_э = 20100 • 36 = 723600 ед.

K = 723600 / 172600 = 4,2.

Таким образом, из приведенных расчетов следует, что выход активности препарата в 4,2 раза превышает суммарную активность компонентов, взятых для его приготовления.

В дальнейшем испытания проводили с использованием препарата с активностью 20100 ед/г, полученного путем простого смешения ингредиентов при соотношении лизоцим: протосубтилин - 1:2 по активности.

Пример 3.

Изучение спектра антимикробного действия ферментного препарата и его ингредиентов.

Для изучения спектра антимикробного действия ферментного препарата и его ингредиентов проводили лизис клеток микроорганизмов, используемых в качестве тест-объектов, в 0,05 М трис-буфере pH 7,0; температуре 25^oC в течение 5 часов.

Оптическую плотность суспензии микроорганизмов определяли на КФК-2 при длине волны 590 нм в кювете с расстоянием между стенками 1 см.

Расчет степени лизиса клеток (L) в % проводили по формуле

где D₁ - начальная оптическая плотность реакционной смеси;
D₂ - конечная оптическая плотность реакционной среды;
100 - переводной коэффициент для выражения результатов в %.

Концентрация ферментных препаратов и их смесей реакционной смеси:
Лизоцим яичного белка - 0, 02 ед/мл (1,5 мкг/мл);
Протосубтилин Г10Х - 0,02 ед/мл (18 мкг/мл);
Препарат - 0,02 ед./мл (1 мкг/мл).

Результаты испытаний приведены в таблице 3.

Пример 4.

Испытание действия препарата на икру аквариумных рыб, с целью профилактики сапролегниоза.

Сапролегниоз икры приносит большой ущерб аквариумному и промысловому рыбоводству. Возбудителем заболевания является гриб рода Saprolegnia. Особенно большие потери от этого заболевания несет рыбоводство при культивировании рыб с длительным сроком инкубации икры.

Первая серия опытов проводилась на аквариумных рыбках минорах (красная тетра) Hyphessobrycon callistus (Boul, 1900) в аквариумах объемом 17,5 л и размерами 35 х 25 х 20 см при температуре 20^oC. Аквариумы были снабжены сеточками, через которые проваливалась икра отнерестившихся рыбок, во избежание ее поедания производителями. Через сутки производители отсаживались и к этому же времени происходило вылупление икры. Препарат вносили в опытные аквариумы сразу же после нереста.

Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Вторая серия опытов с относительно долго инкубируемой икрой проводилась на крапчатых сомиках Corydoras paleatus (Jenyns, 1842) в аквариумах объемом 20,7 л и размерами 30 х 30 х 23 см при температуре 20^oC. В каждом аквариуме группа производителей откладывала и оплодотворяла икру порциями, прикрепляя ее к стенкам аквариума. После нереста производители отсаживались. Срок инкубации икры длился от 6 до 7 суток.

Препарат вносили в опытные аквариумы сразу же после нереста.

Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Как видно из приведенных данных, препарат оказывает микостатическое действие на возбудителя сапролегниоза и не оказывает вредного воздействия на икру и на выход из нее личинок.

Пример 5
Испытания действия препарата на живой корм аквариумных рыб, инфицированный патогенными для рыб микроорганизмами.

Известно, что для кормления аквариумных и молоди промысловых рыб наиболее часто используют рачков-фильтраторов, нередко отловленных в самых разных водоемах, в том числе и в тех, где может быть больная рыба. Следовательно, рачки-фильтраторы, накапливая и концентрируя возбудителей инфекционных заболеваний рыб, могут служить их переносчиками.

Опыт проводили с дафниями Daphnia magna (4-суточная культура) и моинами Moina macrocoma (2-суточная культура).

В качестве тест-культур использовали водные суспензии бактерий: Aeromonas punctatum (возбудитель краснухи карповых) и Aeromonas salmonicida (возбудитель фурункулеза лососевых), взятых из музея Всесоюзного научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии (ВНИИРО).

Учитывая оптимальные условия существования рачков, опыты проводились при концентрации бактерий в воде, где содержались дафнии и моины, около 1 млн. клеток/мл.

В стеклянные стаканчики объемом 50 мл вносили культуру бактерий и приблизительно по 10 особей дафний и моин.

В опытные стаканчики дополнительно вносили раствор препарата из расчета его конечной концентрации в среде - 10 мг/мл.

В контрольные - препарат не вносили.

Стаканчики с рачками инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов.

Схема проведения опыта представлена в таблице 6.

После 3 часов экспозиции из всех стаканчиков производился посев воды в чашки Петри газоном на твердую питательную среду. Затем отлавливались с помощью сита рачки-фильтраторы и растирались в стерильной ступке, в которую добавляли 10 мл стерильной воды. Содержимое ступки размешивалось и производился посев 0,1 мл материала на твердую питательную среду в чашки Петри.

Все чашки инкубировали в термостате при температуре 27^oC в течение 5 суток и просматривали. Результаты посевов приведены в таблице 7.

Из приведенных в таблице 7 данных видно, что бактерии Aeromonas salmonicida из емкостей с препаратом ни из воды, ни из рачков не выделялись.

Концентрация бактерий Aeromonas punctatum не превышала 3-4 десятков колоний в воде и 100 колоний в рачках.

Разброс результатов в контроле, вероятно, следует объяснить перевариванием бактерий в пищеварительном тракте дафний и моин.

Пример 6
Испытание действия препарата на рыб, пораженных "матовой" болезнью (предположительно флексибактериозом).

Флексибактериозы рыб - широко распространенные заболевания аквариумных и промысловых рыб. Вызывают эти заболевания несколько видов бактерий рода Flexibacter.

Эффективных мер борьбы с флексибактериозами до настоящего времени нет.

Опыты по испытанию действия препарата на "матовую" болезнь аквариумных рыбок проводились на Меченосцах, форма красная и черноплавниковая (Xiphophorus helleri; Heckel, 1848) методом "купания" в нескольких вариантах и в демонстрационных аквариумах.

Испытания проводились по следующей схеме:
1. "купание", концентрация препарата - 10-50 мг/л, экспозиция 2 часа;
2. Демонстрационные аквариумы:
- контроль;
- препарат - 10 мг/л.

В результате проведенных экспериментов было установлено:
- препарат независимо от концентрации (в пределах от 10 до 50 мг/л) оказывает терапевтический эффект при лечении "матовой" болезни Меченосцев;
- слабо пораженные рыбки становились практически здоровыми;
- у сильно пораженных рыбок плавники расправлялись, "матовый" налет становится малозаметным.

Пример 7
Испытание лечебного действия препарата при ихтиофтириозе и хилодонеллезе рыб.

7.1. Испытание действия препарата на возбудителя ихтиофтириоза рыб и на рыб, больных ихтиофтириозом.

Ихтиофтириоз - широко распространенное паразитарное заболевание как аквариумных, так и промысловых рыб. Возбудитель - равноресничная инфузория Ichthyophthirius multifiliis. Цикл развития паразита состоит из нескольких стадий: зрелый трофонт, локализованный под эпителием тела рыбы-хозяина; циста, внутри которой происходит деление паразита, и бродяжки - вышедшие из цисты молодые паразиты (от 1 до 2 тыс. из каждой цисты), свободно плавающие в воде до 3 суток. Попав на тело рыбы, бродяжки внедряются под эпителий, где растут и созревают.

а. Изучение действия препарата на бродяжку (in vitro).

Объектом исследований служили больные ихтиофтириозом рыбки Тетра фон Рио (Hyphessobrycon flammeus; Myers, 1924). В соскобы с поверхности рыб при обнаружении под микроскопом бродяжек вносилась капля водного раствора препарата с концентрацией 10 мг/мл.

При наблюдении за поведением бродяжек под микроскопом видно, что во всех случаях в течение 1 мин наступал лизис оболочек бродяжек и их гибель.

б. Изучение действия препарата на зрелый трофонт (in vitro).

Объектом исследований служили больные ихтиофтириозом рыбки Неоны голубые (Paracheirodon innesi; Myers, 1936). Как и в предыдущем опыте, с поверхности тела рыб брались соскобы и при обнаружении в поле зрения микроскопа взрослых стадий паразита - трофонтов вносилась капля раствора препарата с концентрацией 10 мг/мл.

Наблюдался результат, аналогичный предыдущему, - трофонты реагировали на препарат, также как и бродяжки - в течение 1 мин лизис оболочек и гибель паразита.

в. Действие препарата на возбудителя ихтиофтириоза методом "купания" (in vivo).

Объектом исследований служили рыбки Керри (Inpaichthys kerri; Cery-Junk, 1977), пораженные ихтиофтириозом. Методом соскобов и прямой микроскопии определялась интенсивность инвазии. Для "купания" отбирались в каждом опыте по 10 особей со степенью поражения - 7-8 экземпляров паразитов на соскоб в поле зрения микроскопа. Бродяжки и трофонты составляли примерно по 50% соответственно. После 1 час экспозиции "купания" в воде, содержащей препарат (10 мг/мл), ни в одном соскобе, взятом повторно, в поле зрения микроскопа живых паразитов обнаружено не было.

г. Изучение прямого действия препарата на зараженную ихтиофтириозом аквасистему.

Объект исследования - Малая синяя касатка (Liocassis braschnikowi; Berg). В трех демонстрационных аквариумах находилось по 9 касаток, пораженных ихтиофтириозом с интенсивностью инвазии - в среднем по 4 бродяжки и по 6 трофонтов на соскоб. Аквариумы были обработаны препаратом из расчета его конечной концентрации в воде - 10 мг/л.

В результате через сутки ни в одном из соскобов паразитов обнаружено не было. Гибели рыб не наблюдалось.

Пример 8
Испытание действия препарата на возбудителя хилодонеллеза рыб (in vitro) и на рыб, больных хилодонеллезом (in vivo).

Хилодонеллез рыб приносит большой ущерб как аквариумному, так и промысловому рыбоводству. Спектр заболевания охватывает не только большое число видов рыб, но и широкий температурный диапазон. Возбудитель - паразитические представители рода Chilodonella, которые относятся к равноресничным инфузориям сем. Chlamidodontidae отряда Holotricha.

Испытание препарата для борьбы с хилодонеллезом проводилось по той же схеме, что и для ихтиофтириоза, то есть действие препарата (10 мг/мл) на возбудителя заболевания (in vitro), действие препарата (10 мг/мл) на рыб, пораженных паразитом методом "купания" (in vivo) c одночасовой экспозицией и действие препарата (10 мг/л) на больных рыб в демонстрационном аквариуме.

Работа проводилась на Золотых рыбках и Черных телескопах (Carassus carassus). Оценка результатов испытаний проводилась микроскопированием соскобов с тела рыб и наличию живых инфузорий в поле зрения микроскопа.

Результаты испытаний аналогичны результатам, полученным при ихтиофтириозе: 1-минутное воздействие препарата с концентрацией 10 мг/мл на возбудителя заболевания вызывало его гибель; при "купании" больных хилодонеллезом рыб в растворе препарата с концентрацией 10 мг/мл в течение 1 часа во взятых после обработки соскобах паразитов не обнаружили; в демонстрационных аквариумах через сутки после внесения препарата (10 мг/л) ни в одном соскобе живых хилодонелл обнаружить ни разу не удалось.

Пример 9
Изучение лечебного действия препарата в условиях модельных эпизоотий рыбного стада в замкнутой аквасистеме.

Для моделирования процесса возникновения и развития эпизоотий рыбного стада в условиях их содержания в замкнутой аквасистеме использовали 3 аквариума объемом по 20, 10 и 5 литров каждый.

В эти аквариумы выпускали по 19 здоровых рыбок - Кардинал (Tanichthys albonubes; Lin Shu Yen, 1932). Затем в каждый из аквариумов выпускали по одной рыбке, пораженной паразитом (ихтиофтириоз или хилодонеллез) с интенсивностью инвазии - 6-8 экземпляров паразитов на соскоб.

Таким образом, изучались три модели популяции рыбок Кардинал с плотностью 1, 2 и 4 экз./л соответственно. Экспозицию рыбных популяций проводили в течение 7 суток и изучали динамику смертности рыб.

Результаты исследований приведены в таблицах 8 и 9.

Следующий опыт ставили по аналогичной схеме, но через 4 суток в аквариумы внесли препарат из расчета 10 мг/л. Экспозицию популяции рыб проводили в течение 7 суток и изучали динамику смертности рыб.

Результаты исследований приведены в таблицах 10 и 11.

Из приведенных экспериментальных материалов следует, что предлагаемый препарат является эффективным лечебно-профилактическим средством для борьбы с инфекционными болезнями рыб.

Пример 10
Испытание препарата для борьбы с возбудителем фурункулярной ангины человека - Streptococcus-29.

Для изучения антимикробного действия ферментного препарата и его ингредиентов проводили лизис клеток микроорганизма Streptococcus-29.

Микроорганизм суспендировали в 0,05 М трис-буфере pH 7,0; вносили растворы препарата и его ингредиентов и инкубировали при температуре 37^oC в течение 5 часов.

Концентрация ферментного препарата и его ингредиентов в реакционной смеси:
Лизоцим яичного белка - 0, 02 ед/мл (1,5 мкг/мл);
Протосубтилин Г10Х - 0,02 ед/мл (18 мкг/мл);
Препарат - 0,02 ед./мл (1 мкг/мл).

Результаты испытаний приведены в таблице 12.

Из приведенных данных следует, что предлагаемый ферментный препарат способен эффективно лизировать клеточные стенки возбудителя фурункулярной ангины человека.

Представленные примеры демонстрируют достижение цели предложения, то есть препараты, составленные на основе предлагаемых ингредиентов в их определенном сочетании, обладают повышенной активностью и широким спектром антимикробного действия и могут быть использованы для профилактики и лечения инфекционных болезней, вызываемых бактериями, грибами и простейшими.

Источники информации
1. Жоллес П. Взаимосвязь между химической структурой и биологической активностью лизоцима куриного яйца и лизоцимов из других источников. - В сб.: Химия белка, М.: Мир, 1969, с. 5-22.

2. Подборнов В. М. Сравнительная характеристика лизоцимов разного происхождения. - Антибиотики и химиотерапия, 1990, т. 35, N 8, с 22-25.

3. D.Knorr, K.J.Shetty, L.F.Hood, J.E.Kinsell - An enzymatic method for yeast autolysis - J. Food Science, 1979, v. 44, N 5, p. 1362-1365.

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии, медицине и может быть использовано для профилактики и лечения инфекционных болезней рыб, животных и человека, вызываемых микроорганизмами. Предложен препарат, содержащий ферменты микробного и животного происхождения, обладающие лизоцимной активностью, при следующем соотношении компонентов: лизоцим яичного белка: микробный лизоцим - 1:1-2 по активности. Препарат, составленный по предлагаемому соотношению ингредиентов, позволяет лизировать клеточные стенки не только бактерий и грибов, но и простейших. 12 табл.

Препарат для профилактики и лечения инфекционных болезней животных и человека, включающий лизоцим яичного белка, отличающийся тем, что дополнительно содержит микробный лизоцим при следующем соотношении ингредиентов: лизоцим яичного белка : микробный лизоцим - 1 : 1 - 2 по активности.