СПОСОБ БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ НЕПРОТОЧНЫХ ВОДОЕМОВ ОТ ПАТОГЕННОЙ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ Российский патент 2002 года по МПК C02F3/32 A01K63/04 

Изобретение относится к вопросам охраны окружающей среды и гигиены и может быть использовано в процессах санации водоемов от загрязнения их аллахтонной микрофлорой.

Изобретение предназначено для использования в работе СЭС, специализированных лабораторий и биологических прудах очистки.

В настоящее время накоплено достаточно много данных о том, что представители типа моллюсков (Mollusca) по своим физиологическим особенностям являются естественными фильтраторами водной среды (Догель, 1975 (5), Скопцова, 1984 (13)). Известен факт участия двустворок в самоочищении водоема от взвешенного вещества (Жадин, 1952 (7), А.В. Алимов (1967 (1)) на примере моллюсков Sphaerium corneum (L.) изучил скорость и механизм освобождения вод от взвешенных частиц. Поскольку двустворчатые моллюски обладают особым фильтрационным типом питания, и основным компонентом их "рациона" является бактериопланктон (Жадин, 1952 (7)), то именно эти гидробионты по нашему мнению могли бы иметь большое значение в самоочищении водоема от аллохтонных, в том числе от патогенных и условно-патогенных, микроорганизмов.

О.Н. Труновой (1972 (15) (16)) был обнаружен санирующий эффект инфузорий в отношении аллохтонной микрофлоры непроточных водоемов. Ею же был предложен "Биологический метод обеззараживания непроточных водоемов от патогенной микрофлоры" (Информационный листок ЦНТИ, Саратов 1972, 4с.).

Автор предлагает после получения высокой биомассы простейших в специальных бассейнах - инфузации, ими "заражать" плавучие биологические островки, внесенные непосредственно в очищаемый водоем. Этот способ и взят нами за прототип. Однако существенным недостатком. предлагаемого автором метода является большая опасность попадания в водоем органического вещества, что способствует развитию вторичного биологического загрязнения.

В связи с этим необходим постоянный контроль не только за изменением количества бактериофлоры в зоне внесения биоостровков, но и за гидрохимическими показателями воды водоема. Недостатком способа также является и то, что он довольно длителен в подготовке и трудоемок в исполнении. Это заключается в том, что на первом этапе - до внесения биоостровков в водоем необходимо выращивание больших объемов культуры инфузорий в искусственных инфузариях. Второе: на самом водоеме необходимо создание большого количества плавучих биологических островков, образованных 3-5 кг разнотравья, которое рыхло закладывается в плетеные сетки. На третьем этапе в каждый биологический островок вносится по 10 литров среды, содержащей культуру простейших из бассейна инфузария.

При внесении в водоем органического субстрата в виде биологических островков создаются условия для массового развития водной флоры и фауны и в первую очередь бактерий и возникает угроза вторичного биологического загрязнения водоема.

Все это усложняет методы контроля за состоянием водоема, т.к. кроме микробного тестирования необходим широкий контроль за гидрохимическими показателями воды в водоеме.

Все эти недостатки заставляют искать более доступные и безопасные для водоема способы антимикробного обеззараживания водоемов особенно от патогенной и условно-патогенной микрофлоры.

Новизной заявляемого способа является то, что впервые биологическим объектом, используемым для обеззараживания водоемов, предлагаются пресноводные двустворчатые моллюски, обладающие лизоцимной активностью. Предлагаемое техническое решение применяется впервые в гигиене водоемов и в гидробиологии, т.к. в качестве биологического фактора очистки предлагается моллюск, обладающий лизоцимной активностью.

Сущностью заявляемого способа является обеззараживание непроточных водоемов от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов заселением в водоем гидробионтов, в качестве которых предлагается использовать пресноводных моллюсков, обладающих лизоцимной активностью, эквивалентной или превышающей активность яичного лизоцима при концентрации белка 1мкг/мл.

Создание предлагаемого способа стало возможным благодаря следующим моментам:
1. По литературным данным лизоцим является одним из экологически значимых факторов в формировании гидробиоценозов. Лизоцимной активностью обладают различные группы гидробионтов, в том числе и простейшие, и моллюски (Багнюк и др. 1980 (2), 1983 (3); Соловых, 1995 (14); Немцова, 1998 (11)).

2. Пропуская через мантийную полость огромные количества воды, моллюски играют роль естественных биологических фильтров, обезвреживание, которое они проводят с участием фагоцитов, содержащих целый комплекс гидролитических ферментов, в том числе и лизоцим (12).

3. Уровень лизоцимной активности у всех гидробионтов разный в отличие от инфузорий, обладающих слабой лизоцимной активностью - 0,7 мкг/мл, моллюски обладают более высокой лизоцимной активностью до 10 мкг/мл (Соловых, 1995 (14)).

Все это позволило предположить: чем большую способность синтезировать лизоцин, проявляют гидробионты, тем более высоким санирующим эффектом они обладают, по сравнению с гидробионтами, не обладающими лизоцимной активностью. Поэтому можно было выделить моллюсков в качестве биологических объектов, используемых для очистки водоемов, т.к. моллюски обладают лизоцимной активностью выше, чем инфузории, которые были использованы в прототипе. Исходя из этого предположения, был поставлены ряд экспериментов, подтвердивших это предположение.

Опытное обоснование факта санации воды моллюсками.

Принимая во внимание известные из литературы данные о лизоциме как о факторе резистентности беспозвоночных животных, мы провели ряд экспериментов по исследованию лизоцимной активности моллюсков семейства Unionidae. Объектом исследования явились моллюски Unio pictorum и Anodonta cygnea, виды наиболее характерные для реки Урала. Нами изучалась бактериолитическая активность экстрактов целых особей, а также мантии, жабр, дорсальной мускулатуры ноги и внутренностей в отношении суспензии живых и обработанных хлороформом клеток М. lysodeikticus.

Проведенные исследования показали, что препараты экстрактов тканей данных видов моллюсков оказывают выраженное литическое действие в отношении суспензии как живых, так и убитых клеток тест-культуры. Однако логическая активность экстрактов тканей моллюсков U. pictorum значительно выше, чем литическая активность экстрактов тканей моллюсков A. cygnea.

Поэтому дальнейшие исследования проводились с представителями моллюсков вида Unio pictorum.

1. Взаимодействие моллюсков Unio pictorum с сапрофитной микрофлорой.

Отбирали моллюсков одной возрастной группы. Моллюсков вскрывали, препарировали, отделяя жабры, помещали их в стерильные чашки Петри и заливали стерильной безбактериальной водой, объем которой был равен объему воды, содержащейся внутри раковины моллюска (10 мл). Материал обрабатывали в течение 1-1,5 ч. Затем из полученных смывов делали посевы на МПА (для определения числа сапрофитов)и среду Эндо (для выявления кишечной палочки). Параллельно определяли данные показатели в воде биотопа, из которого был взят моллюск.

Исследование микробной обсемененности поверхности жабр моллюсков, испытывающих постоянный "бактериальный прессинг", и в силу этого, способных стать центром концентрирования микробов, показало, что в жабрах U. pictorum не происходит накопления микроорганизмов. Общее число сапрофитов и АЛА-форм бактерий в смывах с жабр было на порядок ниже, чем в воде исследуемого биотопа (фиг.1. а, б).

Эти данные коррелировали с показателями коли-титра (таблица 1.).

Было установлено, что титр кишечной палочки в природной воде летом составлял 10^-4-10^-2, в то время как соответствующий показатель в смывах с жабр моллюсков принимал значения 10^-2-10^-1. Таким образом, количество санитарно-показательных бактерий (E. coli) в смывах с жабр было на порядок ниже, чем в воде.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что, профильтровывая огромные массы воды, моллюски U. pictorum не концентрируют, а элиминируют попадающие в них микроорганизмы и, таким образом, косвенно участвуют в антибактериальном очищении водоема.

Учитывая важное значение лизоцима как защитного фактора беспозвоночных животных (Купер, 1980 (9); Ломакин, 1990 (10)), мы предположили, что именно присутствием этого фермента обусловлено антибактериальное действие моллюсков U. pictorum. В связи с этим, внимания заслуживает и тот факт, что доля антилизоцимактивных бактерий в смывах с жабр моллюсков по сравнению с природной водой возрастает и составляет 70-86% от общего числа сапрофитов (фиг.2. а, б, в, г). Это позволило предположить наличие лизоцима в жабрах моллюсков.

Поэтому во второй серии экспериментов было проанализировано наличие лизоцима у моллюска. Было показано, что экстракты тканей моллюсков лизировали бактерии М. lysodeikticus, которые являются специфическими маркером на присутствие лизоцима. Все это позволяет сделать вывод, что моллюски, обладающие лизоцимом, оказывают литическое действие на бактерии водоема.

2. На следующем этапе нами был выделен и очищен препарат лизоцима из моллюсков U. pictorum. Полученный препарат лизоцима моллюсков был оценен на антибактериальную активность, для чего был поставлен модельный эксперимент с использованием природной и аквариумной воды, выступающей в качестве микрокосма. В две пробирки наливали по 18 мл исследуемой воды (речной или аквариумной); в одну из них добавляли 2 мл стерильной безбактериальной воды (контроль), в другую - 2 мл препарата лизоцима моллюсков с активностью, эквивалентной активности яичного лизоцима при концентрации белка 1 мкг/мл (опыт). Для определения исходной численности микроорганизмов проводили посев из опытной и контрольной пробирок (исход). Пробирки выдерживали в течение месяца при температуре 20-25^oС. В первые 7 суток проводили регулярный высев проб на чашки с МПА, далее высевы проводили один раз в неделю. Учитывали количество сапрофитов в контрольной и опытной пробах. Как видно на фиг. 3, в отсутствии лизоцима моллюсков численность сапрофитов в природной воде колебалась от 60 клеток/мл до 90 тыс. клеток/мл. В течение первых двух суток наблюдался рост численности бактерий от 300 клеток/мл в исходе до 90 тыс. клеток/мл. На 3-4-е сутки численность стабилизировалась и составила 50-60 тыс. клеток/мл, после чего на 5-е сутки наблюдалось ее снижение. К концу опыта численность сапрофитов в контрольной пробе составила 60 клеток/мл. Общее число сапрофитов в опытной пробе не превышало 10 клеток/мл.

Оценка антимикробного действия лизоцима моллюсков на некоторые виды условно-патогенных бактерий (S. epidermidis, E. coli), показало, что под его воздействием эти бактерии лизировались.

Как известно, лизоцим активен в отношении многих грамположительных и некоторых грамотрицательных микроорганизмов (Ермольева, 1968, (6)). Исследование антибактериальной активности полученного препарата лизоцима моллюсков в отношении культур М. lysodeikticus, S. epidermidis, E. coli в сравнении с яичным лизоцимом показало, что лизоцим моллюсков активен в отношении культур данных микроорганизмов. Так, в жидкой среде (МПБ) действие препарата в отношении М. lysodeikticus было сходно с действием яичного лизоцима: оба они подавляли микроорганизмы даже в разведении 1/128. S.epidermidis был менее чувствителен к действию лизоцима моллюсков (действующее разведение (МПБ) - 1/16), в то время как яичный лизоцим проявлял активность в разведении 1/128. Результаты исследования показали, что препарат лизоцима моллюсков проявляет более высокую антибактериальную активность в отношении E. coli, чем яичный лизоцим. Так, полученный препарат подавлял рост тестируемой культуры в разведении 1/2 - 1/8, что в четыре раза активнее в отношении E. coli, чем яичный лизоцим. Особого внимания заслуживает тот факт, что лизоцим моллюсков оказывает одинаковое действне в отношении как условно-патогенных грамотрицательных, так и грамположительных микробов, что отличает его от яичного лизоцима, активность которого в отношении грамотрицательных бактерий в 70-170 раз ниже по сравнению с действием на грамположительиые микроорганизмы.

Таким образом, присутствие лизоцима у моллюсков и его выраженное действие на условно-патогенные микроорганизмы позволили предположить участие данного фермента в процессах очищения водоемов от условно-патогенных микроорганизмов.

А это свидетельствует о том, что моллюски, обладающие этим фактором, можно использовать для обеззараживания от аллахтонной микрофлоры.

На основании полученных данных нами предложен "Способ биологического обеззараживания непроточных водоемов от патогенной и условно-патогенной микрофлоры". Способ предусматривает отбор моллюсков из природных водоемов и при условии, что если у видов отобранной группы обнаруживается лизоцимная активность, рекомендуется использовать их для заселения в водоем с целью обеззараживания его от патогенной и условно-патогенной микрофлоры.

Метод оценки лизоцимной активности
I. В приготовлении экстрактов тканей моллюсков. Экстракты моллюсков и их тканей готовили путем растирания материала в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,2) с кварцевый песком с добавлением ингибитора протеаз - фенилметилсульфонилфторида (300 мкг/мл). Полученные гомогенаты подвергали многократному замораживанию и оттаиванию. Центрифугировали при 9000 об/мин 15 минут. Осадок отбрасывали. В полученных экстрактах определяли литическую активность турбидиметрическим методом.

II. В фотометрическом (турбидиметрическом) определении лизоцимной активности моллюсков. О лизоцимной активности полученных препаратов судят по изменению светопропускания опытной взвеси микрококка по сравнению с исходной. Лизоцимную активность экстрактов и элюатов определяли но методике Каграмановой - Ермольевой (1966) (8) в суспензиях тест-культуры М. lysodeicticus (штамм 2665 ГНИИСКМБП им. Л.А. Тарасовича) с исходной оптической плотностью D₅₄₀= 0,6 при 37^oС и длине оптического пути 10 мм на спектрофотометре СФ-46. Кинетику активности препарата снимали на спектрофотометре UV VIS (DDR).

Для опыта можно использовать как живые, так к обработанные хлороформом клетки суточной культуры Micrococcus lysodeikticus (Бухарин с соавт., 1997 (4)). Суточную агаровую культуру, живую или обработанную хлороформом, смывали 0,1 М фосфатным буфером рН 6,0-6,2, фильтровали через слой марли и стандартизовали с помощью прибора СФ-46 до оптической плотности 0,6 при длине волны 540 нм в кювете с длиной светового пути 10 мм.

Относительную литическую активность выражали в условных единицах на мг белка, приняв в этом случае за единицу литической активности экстракта (элюата) такое его количество, которое вызывало снижение величины исходной оптической плотности раствора на 0,001 за 1 минуту. Содержание белка в исследуемых препаратах определяли по методу Лоури.

Виды моллюсков, обладающих лизоцимной активностью, и следует использовать для заселения в биологические пруды очистки.

Литература:
1. Алимов А.В. О возможной роли животных-фильтраторов в процессах самоочищения водоемов на примере популяции пресноводных моллюсков Sphaerium corneum (L. ) // В сб.: Моллюски их роль в биоценозах и формировании фаун. - Тр. Зоол. Ин-та АН СССР. - 1967. - Изд-во Наука, Ленингр. Отд. - Т. XLII. - С. 305-311.

2. Багнюк В.М., Закордонец О.А. Исследование экологической роли литических бактерий в активном иле. //Доклады АН СССР. - 1980. - Т. 254. 4. - С. 1018-1021.

3. Багнюк В. М., Новоженко Л.С., Закордонец О.А. Литические бактерии в активном иле станции биохимической очистки сточных вод. //Микробиологический журнал. - 1983. - Т. 45, 2. - С. 15-21.

4. Бухарин О.В., Соловых Г.Н., Немцева Н.В., Алехина Г.П., Фабарисова Л. Г. Система лизоцим-антилизоцим микроорганизмов как показатель состояния водных биоценозов // Гигиена и санитария. - 1997, 5. - С. 57-59.

5. Догель В.А. Зоология беспозвоночных животных. - М.: Высш. шк. - 1975. - 560 с.

6. Ермольева З.В. Лизоцим //Антибиотики, интерферон, бактериальные полисахариды. - М.: 1968. - С. 169-182.

7. Жадин В. И. Моллюски пресных вод СССР. - М., Л.: Изд-во АН СССР. - 1952, - 450 с.

8. Каграманова К.А., Ермольева З.В. Сравнительная характеристика методов определения активности лизоцима //Антибиотики. - 1966. - Т. 11, 10 - С. 9117-9119.

9. Купер Э. Сравнительная иммунология. - М.: Мир, 1980. - 422 с.

10. Ломакин М.С. Иммунобиологический надзор. - М.: Медицина, 1990, - 256 с.

11. Немцева Н. В. Микробиологическая характеристика биоценотических взаимоотношений гидробионтов и ее значение в санитарной оценке водоемов //Автореф. дисс. доктора мед. наук. - Челябинск. - 1998, - 38 с.

12. Подборонов В. М. Изучение биологической активности лизоцимов различного происхождения // Антибиотики. - 1982. - Т. 31, 10. - С. 50-54.

13. Скопцова Г.Н. Роль зообентоса в самоочищении воды водохранилища/ В кн. : Самоочищение воды и миграция загрязнений по трофической цепи. - М.: Наука, 1984. - С.81-85.

14. Соловых Г. Н. Система лизоцим-антилизоцим микроорганизмов в формировании водных сообществ пресных водоемов //Дисс. д-ра биол. наук. - Челябинск. - 1995, - 216 с.

15. Трунова О.Н. Биологический метод обеззараживания непроточных водоемов от патогенной микрофлоры // Информационный листок ЦНТИ, Саратов, 1972, 4 с.

16. Трунова О.Н. Организация биологического обеззараживания непроточных водоемов от патогенной микрофлоры // Методическое пособие для специалистов районных санитарно-эпидемиологических и ветеринарных станций и животноводств - Саратов, 1981 г., 18 с.

Изобретение относится к вопросам охраны окружающей среды и гигиены и может быть использовано в процессах санации водоемов от загрязнения их аллахтонной микрофлорой. Изобретение предназначено для использования в работе СЭС, специализированных лабораторий и в биологических прудах очистки. Для обеззараживания непроточных водоемов от патогенной и условно-патогенной микрофлоры в водоем заселяют гидробионтов - пресноводных моллюсков, обладающих лизоцимной активностью. Изобретение позволит упростить способ антибактериальной очистки водоемов. 1 табл., 3 ил.

Способ биологического обеззараживания непроточных водоемов от патогенной и условно-патогенной микрофлоры, включающий заселение в водоем гидробионтов, отличающийся тем, что используют в качестве гидробионтов пресноводных моллюсков, обладающих лизоцимной активностью, эквивалентной или превышающей активность яичного лизоцима при концентрации белка 1 мкг/мл.