СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМСОДЕРЖАЩЕГО ПРОДУКТА Российский патент 1994 года по МПК C12N9/36 A23J1/08 

Изобретение относится к биотехнологии и пищевой промышленности, в частности к получению ферментных препаратов из пищевого сырья. Чаще всего применяемым в промышленных масштабах является способ выделения фермента из жидкого сырья в щелочной среде с добавлением неорганических солей, а именно к яичному белку добавляют хлористый натрий до получения 5%-ного раствора, и раствор при рН 9,5 выдерживают 48-72 ч для осаждения кристаллов лизоцима.

Наиболее близким к предложенному является способ получения лизоцима, согласно которому проводили детанурацию белка при температуре выше 60^oC с таким расчетом, чтобы коагулировалась основная масса посторонних белков, а лизоцим вымывают водой при рН ниже 6 в присутствии солей одновалентных металлов.

В круглодонную колбу вместимостью 1 л, помещенную в водяную баню при температуре ниже 100^oC, заливают 300 мл воды, подкисленной до рН 3,5 уксусной кислотой; при перемешивании добавляют 4 г натрия хлористого. После растворения соли при температуре раствора 95^oC и сильном перемешивании в течение 1 мин тонкой струей добавляют 100 мл яичного белка. После добавления всего раствора яичного белка полученную массу денатурированного белка отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают 50 мл раствора уксусной кислоты в воде, имеющего рН 3,5.

Фильтрат охлаждают и используют для выделения кристаллического лизоцима.

Прототип имеет следующие недостатки:
1. После выделения лизоцима остается неиспользованным яичный белок, содержащий не менее 30% общей лизоцимной активности.

2. Способ требует проведения ряда сложных операций, удорожающих готовый препарат.

С целью упрощения процесса полученную белковую массу при 83-95^oC высушивают до образования нерастворимого в воде лизоцимсодержащего продукта.

Способ осуществляется следующим образом.

Массу яичного белка подкисляют соляной кислотой до рН 5 и добавляют 0,5% натрия хлористого. Поднимают температуру до 85^oC в массе и фильтруют. Фильтрат используют для получения кристаллического лизоцима, а белковую массу сушат в сушильном шкафу при 85^oC и высушенную массу размельчают.

Лизоцимная активность порошка - 240 ед/мг (после первого вымачивания порошка), с равномерной эмиссией 20 ед/мг активности в 1 ч.

Лизоцим в организме действует как фактор защиты против инфекции, не расщепляется в желудочно-кишечном тракте и всасывается кишечной системой. Т. е. , разовые дозы лизоцима во время кормления животных действуют "ударным" способом, не обеспечивая непрерывную эмиссию фермента.

П р и м е р 1. 100 яиц с поврежденной скорлупой разбивают и отделяют белок от желтка. Получают 3,080 кг яичного белка. К 2,82 кг яичного белка добавляют НСl до рН 5 и 150 г натрия хлористого. Общий вес массы 3 кг. Массу на водяной бане подогревают до 85^oC и выдерживают при перемешивании в течение 15 мин. Фильтруют.

Получают фильтрат около 400 мл (количество фильтрата зависит от зернистости массы) и около 2,6 кг белковой массы. Активность фильтрата 1230 ед/мл. Белковую массу высушивают в сушильном шкафу при 85^oC. Получают около 265 г грубозернистого материала, который размельчают.

Полученный лизоцимсодержащий продукт характеризуется следующими показателями.

Активность водной вытяжки после первой 10-минутной экспозиции порошка при соотношениях белок-вода 1:10 равна 24,0 ед/мг. Активность водного раствора через 1 ч (при полном сливе водного раствора) 20 ед/мг белка. Активность после 2-го часа - 20,5 ед/мг белка, активность после 3-го часа - 20 ед/мг белка, активность после 4-го часа 20 ед/мг белка. Выделение лизоцима в течение 4 ч равномерное.

П р и м е р 2. Опыт проведен как по примеру 1. Белок высушивают в сушильном шкафу при температуре не более 95^oC. Полученная масса - стекловидные комки белого и коричневого цвета. Лизоцимная активность может быть определена только после осветления раствора. Она составляет около 20 ед/мг белка равномерно в течение 4 ч.

Лизоцим повышает уровень агглютинации патогенных микробов, искусственный иммунитет, лизирует клеточные оболочки микроорганизмов, т.е. совместно с другими лизосомальными ферментами обеспечивает внутриклеточное переваривание бактерии.

Известно, что концентрация лизоцима, угнетающая рост различных микробов, колеблется от 0,3 до 5,0 мг/мл (300-5000 ед/мл), хотя сравнительно малые количества в сыворотке крови (2-19 ед/мл) явно недостаточны для антимикробного воздействия.

Установлено, что при разбавлении лизоцима сильно увеличивается суммарная активность. Т. е. при разбавлении 1 ед/мл активности раствора в 1000 раз, получается до 2500 ед/л раствора.

В связи с этим при внутреннем приеме кристаллического лизоцима или активизированной массы может в желудочно-кишечном тракте образоваться сверхвысокая концентрация фермента, подавляющая действие полезных микроорганизмов.

Предложенным способом можно получить препарат, исключающий перенасыщение фермента.

Это достигается удалением растворенного в жидкой фазе лишнего фермента; снижением степени эмиссии фермента из лизоцимактивного продукта путем уменьшения растворенности лизоцимсодержащего продукта.

Использование: биотехнология и пищевая промышленность, в частности к получению ферментных препаратов из пищевого сырья. Сущность изобретения: яичный белок подкисляют и коагулируют при 85 ± 100^°C с последующим удалением лизоцимсодержащей жидкой фазы и высушиванием оставшейся белковой массы при 83 - 95°С до образования нерастворимого в воде лизоцимсодержащего продукта. Масса хорошо сохраняется и ведет себя как иммобилизированный ферментный препарат, а жидкая фаза используется для получения кристаллического фермента.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОЦИМСОДЕРЖАЩЕГО ПРОДУКТА, предусматривающий подкисление яичного белка в присутствии соли, нагрев полученной массы до температуры 85 ± 10^oС, отделение полученной белковой массы от жидкой фазы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, белковую массу высушивают при 83 - 95^oС до образования не растворимого в воде лизоцимсодержащего продукта.